用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于干细胞【技术领域】，涉及一种用于制备胎盘干细胞的试剂盒，该试剂盒包括胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液II、消化终止液、细胞分离液、细胞冻存液；胎盘保存液为含青霉素100?200yg/ml、链霉素100?200yg/ml、两性霉素2.5?5yg/ml、肝素纳注射液0.5?1.5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；本发明的试剂盒可在较短时间内获得大量胎盘干细胞，使用方便。
【专利说明】用于制备胎盘干细胞的试剂盒
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明属于干细胞【技术领域】，涉及一种用于制备胎盘干细胞的试剂盒。
【背景技术】
[0003] 胎盘干细胞指的是存在于胎盘组织中的干细胞。目前已知证明的胎盘干细胞包 括造血干细胞、间充质干细胞、亚全能干细胞等多种干细胞。近十年内，随着胎盘干细胞 产业化技术的出现和临床应用的不断推进，国际上关于胎盘干细胞的研究成果呈现了井 喷之势。2008年，M. Evangelista等发表论著称，胎盘干细胞是未来细胞治疗的新希望 这一事实。随后的几年里，针对胎盘干细胞的研究如雨后春笋般出现。2012年，美国奥克 兰研究所儿童医院的研究者称胎盘干细胞具有的高度治疗应用价值。2013年，韩国"CHA BI0&DI0STECH"干细胞研究所的文智淑教授组发表声明，称首次证实利用产生于人类胎盘 的成体干细胞可以治愈老年性痴呆症。Celgene是世界上第六大生物制药企业，目前药物研 发中涉及到胎盘干细胞的药物，主要针对克罗恩病、多发性硬化症、关节炎、肉状瘤病，分别 在一期临床和二期临床。
[0004] 胎盘造血干细胞为造血干细胞移植提供了新的来源。造血干细胞是红细胞、白细 胞、血小板等的鼻祖，是高度未分化的细胞，是一切血细胞和免疫细胞的原始细胞。造血干 细胞移植可治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤，部分遗传性疾病等十几种致死性疾病。数量丰 富，是脐带血的5?10倍，突破了脐带血来源造血干细胞30kg体重使用的瓶颈，可以提供 自体干细胞足够的数量重建成年人的造血系统。
[0005] 胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族胚胎后亚全能干细胞，其在发 育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但与胚胎干细胞的 不同之处是不会形成畸胎瘤，这一特性使亚全能干细胞可以直接用于体内而不必担心在体 内产生畸胎瘤。胎盘亚全能干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能。在适宜的体内或 体外环境下具有分化为间充质干细胞、上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细 胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、 脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 胎盘间充质干细胞不仅具有干细胞的共性即无限增殖能力和多向分化潜能，还具有以下优 势：1)具有低免疫原性以及免疫抑制作用，这就使得治疗用的间充质干细胞不仅可以来源 于自体，也可以来源于异体；2)具有强大的免疫调节作用，使得移植的间充质干细胞在修复 受损组织的同时，还可以调节患者的免疫状态；3)具有向特定细胞定向分化的特性，避免了 胚胎干细胞等全能干细胞致瘤性风险；4)来源非常广泛，骨髓、胎盘脐带为富含间充质干细 胞的部位，此外在脂肪、脐带血以及其他成体组织器官中也能分离到MSC。
[0006] 胎盘干细胞从开始就受到国际上无数专家的关注。目前已经在临床上广泛开展应 用研究，治疗相关的疾病包括：重型再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病等恶性 或非恶性血液疾病，还有二型糖尿病、特发性肺纤维化、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎等非 血液系统疾病。
[0007] 胎盘干细胞具有广阔的临床应用前景。因此，开发简单、快速、高新、安全获得大量 胎盘干细胞方法成为当务之急，而目前现有技术中还未有用于制备胎盘干细胞的试剂盒， 使得相关科研工作进展缓慢。
【发明内容】
[0008] 本发明目的是为了弥补现有技术中存在的不足，提供一种使用方便，成本低廉的 用于制备获得大量胎盘干细胞的试剂盒。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于制备胎盘干细胞的试剂盒， 包括胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液II、消化终止 液、细胞分离液、细胞冻存液。
[0010] 所述胎盘保存液为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉素 2. 5?5 μ g/ml、月干素纳注身寸液0· 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的DMEM、DMEM/ F12、MEM 或 RPMI-1640 培养基。
[0011] 所述胎盘洗涤液I为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉 素2. 5?5 μ g/ml、肝素钠注射液0. 5?I. 5mg/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks或HBSS。
[0012] 所述胎盘洗涤液II为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉 素2. 5?5 μ g/ml、肝素钠注射液0· 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的生理盐水、 PBS、D-Hanks 或 HBSS。
[0013] 所述组织分解液I为含IV型胶原酶0. 5?2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或 RPMI-1640 培养基。
[0014] 所述组织分解液II为含胰蛋白酶0· 5?2. 5mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或 RPMI-1640 培养基。
[0015] 所述消化终止液为0. 2g/ml的人血白蛋白。
[0016] 所述细胞分离液为60mg/ml的羟乙基淀粉。
[0017] 所述细胞冻存液为含 CryoSure_DEX40 0· 1 ?0· 3mg/ml 的 Knockout? SR。
[0018] 本发明提供了一种制备胎盘干细胞的试剂盒。该试剂盒中，胎盘保存液的作用是 保证胎盘标本在采集之后的运输过程中的活性，并消灭和预防细菌、真菌。胎盘洗涤液I、 胎盘洗涤液II的作用是洗涤除去胎盘组织的血液细胞，同时消灭和预防细菌、真菌。组织分 解液I、组织分解液II的作用是消化胎盘组织，获得单细胞悬液。消化终止液的作用是终止 组织分解液的消化作用。细胞分离液的作用去除红细胞，获得单个核细胞。细胞冻存液的 作用是冻存获得的胎盘干细胞。
[0019] 本发明的用于制备胎盘干细胞的试剂盒，可在短短的3h内获得大量胎盘干细胞 (细胞数量可达IO 9数量级)，并且具有使用方便，成本低廉，无血清，减少动物来源的病原体 感染风险，更安全等特点，将在干细胞临床试验及其相关研究中发挥重要作用，应用前景极 为广泛。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所需试剂耗材及实验仪器等 均可通过商业途径购得。
[0021] 实施例一用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备及应用 一、用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备 1、溶液配置 本发明的用于制备胎盘干细胞的试剂盒包括以下试剂： (1)胎盘保存液配置方法：青霉素（品牌Amresco,货号0242) 100mg、链霉素（品牌 Amresco,货号0382) 100mg、两性霉素（品牌Amresco,货号E437) 2. 5mg、人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，规格20% :50ml) 2. 5g、肝素钠注射液(厂家：成都市海通药业有限公司，规格2ml : 5000 单位）0. 5g，溶于 500ml RPMI-1640 培养基中。
[0022] (2)胎盘洗漆液I配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、肝素钠注 射液lg，溶于1000ml生理盐水中。
[0023] (3)胎盘洗漆液II配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素钠注射液lg，溶于1000ml生理盐水中。
[0024] (4)组织分解液I配置方法：IV型胶原酶（品牌sigma，货号C5138)l g溶于500ml RPMI-1640培养基中，0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0025] (5)组织分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml RPMI-1640培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0026] (6)消化终止液配置方法：购买的商品化浓度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，规格 20% :50ml)。
[0027] (7)细胞分离液配置方法：购买的商品化60mg/ml羟乙基淀粉(厂家：北京费森尤 斯卡比医药有限公司，规格500ml :30g羟乙基淀粉130/0. 4与4. 5g氯化钠)。
[0028] (8)细胞冻存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 (品牌WAK，规格50ml)缓慢加入 到 80ml Knockout? SR (品牌 Life Technologies，货号 N10828028 )中，轻轻混匀即可。
[0029] 2、各组分的分装 试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：胎盘保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盘洗 涤液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盘洗涤液II 2瓶（500ml/瓶)，组织分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 组织分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化终止液1瓶（20ml/瓶)，细胞分离液1瓶（IOOrnl/瓶)， 细胞冻存液1瓶（50ml/瓶)。
[0030] 按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备胎盘干细胞的 试剂盒。试剂盒中胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液 II、细胞冻存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱内或者37°C水浴解冻，解冻之 后4°C保存，一个月内用完；试剂盒中消化终止液、细胞分离液于室温避光保存，有效期为2 年。
[0031] 二、胎盘干细胞的制备 现用步骤一中的试剂盒制备胎盘干细胞，具体制备方法包括以下步骤，以一份完整的 胎盘为例，所有操作步骤均在洁净工作台完成： 1、胎盘运输：采集一份完整的胎盘，加入适量的胎盘保存液，以浸没过胎盘为宜，2? 8°C恒温保存在疫苗箱中，24h内送至实验室。
[0032] 2、洗涤胎盘：吸弃胎盘保存液，加入适量体积的胎盘洗涤液I，反复振荡几次，吸 弃胎盘洗涤液I，同上，再加入适量体积的胎盘洗涤液I振荡洗涤2?3次，直至胎盘表面 的血渍洗涤干净。去除胎盘表面的羊膜和蜕膜，加入适量体积的胎盘洗涤液II，将胎盘组织 剪碎，并将组织块内的血液清洗干净，收集胎盘洗涤液II，于ISOOrpm室温离心lOmin，弃上 清，用50ml胎盘洗涤液II重悬细胞沉淀，按胎盘洗涤液II :细胞分离液=4:1的比例加入细 胞分离液，混合均匀后于室温静置30min后分层，收集上层液体。
[0033] 3、消化胎盘：收集剪碎的胎盘组织块，加入与胎盘组织块等体积的组织分解液I， 于37°C水浴摇床中消化20?30min，之后再加入胎盘组织块1/4体积的组织分解液II，于 37°C水浴摇床中消化10?20min。将两次消化后胎盘组织块经200目分析筛过滤收集滤 液，加入消化终止液IOml,混匀后于1800rpm室温离心IOmin,弃上清,用适量的胎盘洗漆液 II重悬细胞沉淀，按胎盘洗涤液II :细胞分离液=4:1的比例加入细胞分离液，混合均匀后 于300rpm室温离心IOmin,收集上层液体。
[0034] 4、收获细胞：合并步骤2和3中收集的上层液体，于血液分析仪中测得单个核细胞 的数量为4. 06 X IO9个。
[0035] 5、细胞冻存：将上述获得细胞悬液于1800rpm室温离心lOmin，弃上清，缓慢加入 细胞冻存液，轻轻混匀，然后在冻存袋上表明细胞的基本信息，于程控降温仪中降至_80°C 后，转移到液氮中长期保存。待使用时复苏即可。
[0036] 可以看出，用本发明的试剂盒，在较短时间3h内，由一份完整的胎盘，可获得大量 的胎盘干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量胎盘干细胞。
[0037] 实施例二用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备及应用 一、用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备 1、溶液配置 本发明的用于制备胎盘干细胞的试剂盒包括以下试剂： (1)胎盘保存液配置方法：青霉素50mg、链霉素50mg、两性霉素I. 25mg、人血白蛋白 I. 25g、肝素钠注射液0. 25g，溶于500ml DMEM培养基中。
[0038] (2)胎盘洗漆液I配置方法：青霉素lOOmg、链霉素lOOmg、两性霉素2. 5mg、肝素钠 注射液〇. 5g，溶于IOOOmlPBS中。
[0039] (3)胎盘洗漆液II配置方法：青霉素lOOmg、链霉素lOOmg、两性霉素2. 5mg、人血白 蛋白2. 5g、肝素钠注射液0. 5g，溶于IOOOmlPBS中。
[0040] (4)组织分解液I配置方法：IV型胶原酶I g溶于500ml DMEM培养基中，0· 22um 滤器过滤除菌即可。
[0041] (5)组织分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml DMEM培养基中，0· 22um 滤器过滤除菌即可。
[0042] (6)消化终止液配置方法：购买的商品化浓度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，规格 20% :50ml)。
[0043] (7)细胞分离液配置方法：购买的商品化60mg/ml羟乙基淀粉(厂家：北京费森尤 斯卡比医药有限公司，规格500ml :30g羟乙基淀粉130/0. 4与4. 5g氯化钠)。
[0044] (8)细胞冻存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 缓慢加入到 80ml Knockout? SR 中，轻轻混匀即可。
[0045] 2、各组分的分装 试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：胎盘保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盘洗 涤液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盘洗涤液II 2瓶（500ml/瓶)，组织分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 组织分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化终止液1瓶（20ml/瓶)，细胞分离液1瓶（IOOml/瓶)， 细胞冻存液1瓶（50ml/瓶)。
[0046] 按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备胎盘干细胞的 试剂盒。试剂盒中胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液 II、细胞冻存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱内或者37°C水浴解冻，解冻之 后4°C保存，一个月内用完；试剂盒中消化终止液、细胞分离液于室温避光保存，有效期为2 年。
[0047] 二、胎盘干细胞的制备 用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备胎盘干细胞，并用相同的方法对获得的 胎盘干细胞进行计数，结果一份完整的胎盘，经过3h的分离即可得到4. 18X IO9个单个核 细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量胎盘干细胞。
[0048] 实施例三用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备及应用 一、用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备 1、溶液配置 本发明的用于制备胎盘干细胞的试剂盒包括以下试剂： (1)胎盘保存液配置方法：青霉素l〇〇mg、链霉素100mg、两性霉素2. 5mg、人血白蛋白 2. 5g、肝素钠注射液0. 5g，溶于500ml RPMI-1640培养基中。
[0049] (2)胎盘洗漆液I配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、肝素钠注 射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0050] (3)胎盘洗漆液II配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素钠注射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0051] (4)组织分解液I配置方法：IV型胶原酶0· 5g溶于500ml RPMI-1640培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0052] (5)组织分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml RPMI-1640培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0053] (6)消化终止液配置方法：购买的商品化浓度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，规格 20% :50ml)。
[0054] (7)细胞分离液配置方法：购买的商品化60mg/ml羟乙基淀粉(厂家：北京费森尤 斯卡比医药有限公司，规格500ml :30g羟乙基淀粉130/0. 4与4. 5g氯化钠)。
[0055] (8)细胞冻存液配置方法：20ml CryoSure_DEX40 缓慢加入到 80ml Knockout? SR 中，轻轻混匀即可。
[0056] 2、各组分的分装 试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：胎盘保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盘洗 涤液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盘洗涤液II 2瓶（500ml/瓶)，组织分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 组织分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化终止液1瓶（20ml/瓶)，细胞分离液1瓶（IOOrnl/瓶)， 细胞冻存液1瓶（50ml/瓶)。
[0057] 按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备胎盘干细胞的 试剂盒。试剂盒中胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液 II、细胞冻存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱内或者37°C水浴解冻，解冻之 后4°C保存，一个月内用完；试剂盒中消化终止液、细胞分离液于室温避光保存，有效期为2 年。
[0058] 二、胎盘干细胞的制备 用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备胎盘干细胞，并用相同的方法对获得的 胎盘干细胞进行计数，结果一份完整的胎盘，经过3h的分离即可得到3. 83 X IO9个单个核 细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量胎盘干细胞。
[0059] 实施例四用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备及应用 一、用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备 1、溶液配置 本发明的用于制备胎盘干细胞的试剂盒包括以下试剂： (1)胎盘保存液配置方法：青霉素l〇〇mg、链霉素100mg、两性霉素2. 5mg、人血白蛋白 2. 5g、肝素钠注射液0. 5g，溶于500ml DMEM/F12培养基中。
[0060] (2)胎盘洗漆液I配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、肝素钠注 射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0061] (3)胎盘洗漆液II配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素钠注射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0062] (4)组织分解液I配置方法：IV型胶原酶0. 25g溶于500ml DMEM/F12培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0063] (5)组织分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml DMEM/F12培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0064] (6)消化终止液配置方法：购买的商品化浓度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，规格 20% :50ml)。
[0065] (7)细胞分离液配置方法：购买的商品化60mg/ml羟乙基淀粉。
[0066] (8)细胞冻存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 缓慢加入到 80ml Knockout? SR 中，轻轻混匀即可。
[0067] 2、各组分的分装 试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：胎盘保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盘洗 涤液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盘洗涤液II 2瓶（500ml/瓶)，组织分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 组织分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化终止液1瓶（20ml/瓶)，细胞分离液1瓶（IOOrnl/瓶)， 细胞冻存液1瓶（50ml/瓶)。
[0068] 按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备胎盘干细胞的 试剂盒。试剂盒中胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液 II、细胞冻存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱内或者37°C水浴解冻，解冻之 后4°C保存，一个月内用完；试剂盒中消化终止液、细胞分离液于室温避光保存，有效期为2 年。
[0069] 二、胎盘干细胞的制备 用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备胎盘干细胞，并用相同的方法对获得的 胎盘干细胞进行计数，结果一份完整的胎盘，经过3h的分离即可得到3. 91 X IO9个单个核 细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量胎盘干细胞。
[0070] 实施例五用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备及应用 一、用于制备胎盘干细胞的试剂盒的制备 1、溶液配置 本发明的用于制备胎盘干细胞的试剂盒包括以下试剂： (1)胎盘保存液配置方法：青霉素l〇〇mg、链霉素100mg、两性霉素2. 5mg、人血白蛋白 2. 5g、肝素钠注射液0. 5g，溶于500ml RPMI-1640培养基中。
[0071] (2)胎盘洗漆液I配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、肝素钠注 射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0072] (3)胎盘洗漆液II配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素钠注射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0073] (4)组织分解液I配置方法：IV型胶原酶Ig溶于500ml RPMI-1640培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0074] (5)组织分解液II配置方法：胰蛋白酶0. 25g溶于500ml RPMI-1640培养基中， 0· 22um滤器过滤除菌即可。
[0075] (6)消化终止液配置方法：购买的商品化浓度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，规格 20% :50ml)。
[0076] (7)细胞分离液配置方法：购买的商品化60mg/ml羟乙基淀粉(厂家：北京费森尤 斯卡比医药有限公司，规格500ml :30g羟乙基淀粉130/0. 4与4. 5g氯化钠)。
[0077] (8)细胞冻存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 缓慢加入到 80ml Knockout? SR 中，轻轻混匀即可。
[0078] 2、各组分的分装 试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：胎盘保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盘洗 涤液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盘洗涤液II 2瓶（500ml/瓶)，组织分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 组织分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化终止液1瓶（20ml/瓶)，细胞分离液1瓶（IOOrnl/瓶)， 细胞冻存液1瓶（50ml/瓶)。
[0079] 按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备胎盘干细胞的 试剂盒。试剂盒中胎盘保存液、胎盘洗涤液I、胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液 II、细胞冻存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱内或者37°C水浴解冻，解冻之 后4°C保存，一个月内用完；试剂盒中消化终止液、细胞分离液于室温避光保存，有效期为2 年。
[0080] 二、胎盘干细胞的制备 用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备胎盘干细胞，并用相同的方法对获得的 胎盘干细胞进行计数，结果一份完整的胎盘，经过3h的分离即可得到3. 77 X IO9个单个核 细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量胎盘干细胞。
【权利要求】
1. 一种用于制备胎盘干细胞的试剂盒，其特征在于：包括胎盘保存液、胎盘洗涤液I、 胎盘洗涤液II、组织分解液I、组织分解液II、消化终止液、细胞分离液、细胞冻存液。所述 胎盘保存液为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉素2. 5?5 μ g/ ml、肝素钠注射液0· 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或 RPMI-1640 培养基； 所述胎盘洗涤液I为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉素 2. 5?5 μ g/ml、肝素钠注射液0· 5?I. 5mg/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks或HBSS ; 所述胎盘洗涤液II为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉素 2. 5?5 μ g/ml、肝素钠注射液0. 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的生理盐水、PBS、 D-Hanks 或 HBSS ; 所述组织分解液I为含IV型胶原酶0. 5?2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640 培养基； 所述组织分解液II为含胰蛋白酶0. 5?2. 5mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640 培养基； 所述消化终止液为〇. 2g/ml的人血白蛋白； 所述细胞分离液为60mg/ml的羟乙基淀粉； 所述细胞冻存液为含 CryoSure_DEX40 0· 1 ?0· 3mg/ml 的 Knockout? SR。
【文档编号】C12N5/074GK104212761SQ201410411126
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】徐冲, 张炳强 申请人:北京瑞思德生物科技有限公司