一株植物乳杆菌及其细菌素的制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物【技术领域】，公开了一株植物乳杆菌及其所产的细菌素及其制备方法与应用，该菌株已于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNO.7390，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明植物乳杆菌新菌株及其所产细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，利用该植物乳杆菌制备细菌素方法简单，成本低廉。
CGMCC NO.7390
2013.03.29
【专利说明】一株植物乳杆菌及其细菌素的制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及了一株植物乳杆菌及其所产的细菌素及其 制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素的来源主要是细菌在特定的代谢途径中，通过核糖体产生的蛋白质、多肽 或者蛋白类复合物。抑菌活性仅限于抑制亲缘关系较近的细菌，不过其对产生菌不具备任 何抑制活性。虽然细菌素是抑制沙门氏菌（salmonella)等食品病原菌的抗菌剂，但与传统 抗生素差异较大；传统意义上的多肽抗生素，其主要来源是经细胞多酶复合体的催化形成 的，不受特定的基因编码，但是细菌素则是由具体的结构基因所编码的，因此可以利用分子 生物学手段进行改造。这些细菌素的合成及作用模式与临床使用的抗生素有很大不同。
[0003] 细菌素普遍定义是：由细菌产生的通常只作用于与产生菌同种或亲缘关系较近的 种的其它菌株的一种蛋白类抗菌物质。它是一种多肽或多肽与糖及脂的复合物，但随着更 多的广谱细菌素的发现，使得其概念不仅仅只是局限于多肽或者多肽类复合物。细菌素的 种类很多，作用机理也是多种多样的。细菌素具有安全性、不易产生耐药性、热稳定性等其 他防腐剂无法企及的优点，因此研发新型的广谱细菌素作为食品添加剂具有重要意义。
[0004] 目前我国大量使用的还是苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类等化 学合成防腐剂。但研究发现，这一类防腐剂对人体有一定的毒性作用，长期食用对健康有不 利影响。因此，近年来研究者把目光投向天然防腐剂的开发。相对于合成防腐剂，天然防腐 剂因具有作用范围广、无毒性、强抗菌性的特点。经过多年的精心研究，微生物源防腐剂已 开发出乳酸链球菌细菌素（Nisin)、溶菌酶等安全防腐剂。细菌素，因其自身安全高效符合 食品防腐剂的未来发展趋势，现在已然成为食品科学领域最为火热的研究方向之一。但是 在实际应用过程中，还存在很多问题。例如制备细菌素的现有成本非常高、细菌素的获取来 源不足、对于细菌素自身的抗菌谱研究不够深入，细菌素的作用机理不够明确，而以上问题 将会很大程度的限制细菌素的开发和利用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株植物乳杆菌新菌株及其所产细菌素和制备方法，该植物 乳杆菌新菌株及其所产细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高，可以抑制多种食源性致病菌及 引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌所制备的细菌素及其制备方法与应 用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决： 一株植物乳杆菌(Lacp/a/?ia/--)ZJ5,其特征在于：该菌株已于2013 年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0. 7390,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0008] 作为优选，所述的植物乳杆菌可用于制备细菌素 PZJ5。
[0009] 作为优选，所述的植物乳杆菌/7/a/7ia/--)ZJ5可用于制备食品或 饲料防腐剂。
[0010] 作为优选，所述的植物乳杆菌(L3cioAaciJ7w5· Waflia/--) ZJ5制备细菌素 PZJ5 的方法，包括如下步骤： 制备发酵液：将植物乳杆菌(Zacic^aci77w5· /?7a/?ia/--)ZJ5按3%的接种量接种到MRS 液体培养基中，30°C静置培养24 h;得到的发酵液在10000 rpm，4°C的条件下离心15 min， 取上清液，放置4°C保存备用； 制备细菌素：将制备的发酵液经10000 r/ m离心15 min后取上清液，在上清液中缓慢 加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达40,然后在4-5°C条件下静置2 h，再在4-5°C条件下、12000 r/ m、离心30 min,弃去沉淀。再在上清液中缓慢加入硫酸铵固 体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80,然后在4-5°C条件下静置12 h，再在4-5°C 条件下、12000 r/ m、离心30 min，弃去上清液得到细菌素；最后经阳离子交换色谱、疏水色 谱和分子筛分离后得到细菌素 PZJ5。
[0011] 本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果： 本发明植物乳杆菌新菌株及其所产细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高，可以抑制多种 食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，利用该植物乳杆菌制 备细菌素方法简单，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是本发明植物乳杆菌ZJ5菌株的菌落形态和菌体形态图；其中，A :菌落形态； B :菌体形态； 图2是本发明植物乳杆菌PCR扩增结果图；M: Marker; 1: CK; 2: PZJ5; 图3是本发明植物乳杆菌ZJ5与其他乳酸菌的16s rDNA基因系统进化树图示； 图4是本发明SP-Sepharose纯化PZJ5色谱图； 图5是本发明Resource ΕΤΗ纯化PZJ5色谱图； 图6是本发明Superdex ΡΡ纯化PZJ5色谱图； 图7是本发明PZJ5的N端测序结果。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图1至附图7与实施例对本发明作进一步详细描述： 实施例1 一株植物乳杆菌(Lacp/a/?ia/--)ZJ5,其特征在于：该菌株已于2013 年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0. 7390,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0014] 菌株鉴定： 产细菌素菌株：植物乳杆菌(ZacioAaciBiAs 将植物乳杆菌ZJ5菌种 在MRS固体培养基上平板划线，30 °C培养24 h。挑取单菌落于装有10 ml MRS液体培养 基的试管中，静置培养24 h后，再按3%的接种量接种到100 ml液体培养基中，静置培养24 h，4 °C保存。该菌的菌落形态均为圆形、湿润、表面情况凸起或平整（图1A)，不透明，颜色 为白色，不产色素，边缘整齐。这些共同特点与典型乳酸菌的菌落特征相同。经革兰氏染色 和显微镜观察，菌株的个体形态特征结果见图1B。镜检为革兰氏阳性乳杆菌，菌体呈短杆菌 状，符合乳杆菌的形态。
[0015] 乳酸菌的生理生化特征试验结果 由表1可知，该菌经过淀粉水解实验、尿素实验和油脂水解实验后，反应均为阴性。该 细菌在代谢过程中不能够分泌产生淀粉酶、尿素酶、脂肪酶和明胶酶来降解大分子物质，如 淀粉、脂肪和明胶等。在经过M. R试验、V. P试验和硫化氢试验之后，反应也均为阴性，而糖 发酵试验则大多数呈阳性。此结果与《乳酸菌分类鉴定及试验方法》中乳杆菌的特征对照， 基本符合乳杆菌的理化特性。
[0016] 表1乳酸菌的生理生化特征试验结果
【权利要求】
1. 一株植物乳杆菌(kcto如腫）ZJ5,其特征在于：该菌株已于2013 年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO. 7390,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2. 利用如权利要求1所述的植物乳杆菌谓）ZJ5制备细菌素 中的应用。
3. 利用如权利要求1所述的植物乳杆菌谓）ZJ5制备细菌素 PZJ5的方法，其特征在于，包括如下步骤： 制备发酵液：将植物乳杆菌(kcto如按3%的接种量接种到MRS 液体培养基中，30°C静置培养24 h;得到的发酵液在10000 rpirufC的条件下离心15 min， 取上清液，放置4°C保存备用； 制备细菌素：将制备的发酵液经10000 r/ m离心15 min后取上清液，在上清液中缓慢 加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达40,然后在4-5°C条件下静置2 h，再在4-5*€条件下、12000 r/ m、离心30 min，弃去沉淀；再在上清液中缓慢加入硫酸铵固 体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80,然后在4-5°C条件下静置12 h，再在4-5°C 条件下、12000 r/ m、离心30 min，弃去上清液得到细菌素；最后经阳离子交换色谱、疏水色 谱和分子筛分离后得到细菌素 PZJ5。
4. 如权利要求1所述的植物乳杆菌谓）zj5在制备食品或饲 料防腐剂中的应用。
5. 如权利要求1所述的植物乳杆菌在制备细菌抑制 剂中的应用； 所述细菌为藤黄微球菌金黄色葡萄球菌 拙reM)、植物乳杆菌况i77^s* 腫）、乳酸乳球菌7况iis)、枯 草芽抱杆菌单增李斯特氏菌(Zisteria ?9/?(9?^τ?(9^^/?(96〇、幾肠球菌 痢疾志贺氏菌沢77a 办志贺氏菌沢77况 /7<9m<9_ri)、恶臭假单胞菌、沙门氏菌（5b7?9/?<977a 6/7.)、大肠杆菌 iBscherich. 或酉良酒酵母 與ras ?^9，<9Κ7?) 〇
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的细菌为藤黄微球菌(i/zirc^c^i^As1 CGMCC 1. 193、金黄色葡萄球菌 拙_r<9"6〇 CGMCC 1. 879、金 黄色葡萄球菌 拙_r<9^s〇 CGMCC 1. 128、植物乳杆菌 /?7故^^/'應）06]\10^1.551、植物乳杆菌（/^以(9如以77"6(/77故^^/'應）06]\10^ 1.556、乳酸 乳球菌7况iis) ATCC 15577、枯草芽抱杆菌CGMCC 1· 1627、单增李斯特氏菌（Wisteria ?9/?(9?^τ?(9沢dm) ATCC 7648、幾肠球菌 CGMCC 1. 125、痢疾志贺氏菌（总/沢773 办ATCC 9753、志贺氏 菌沢77沒· /7<9z/?<9ri)CGMCC 1.1868、恶臭假单胞菌CGMCC 1.645、沙门氏菌（5》7避?/?6*77沒 6/7. ) CGMCC 1. 1552、大肠杆菌eWi) CGMCC 1. 1580、大肠杆菌e<97i) JM109 或酿酒酵母 CGMCC 2·1643。
【文档编号】C12N1/20GK104232520SQ201410430688
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】顾青, 宋达峰 申请人:浙江工商大学