Her-2基因快速fish检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了HER-2基因快速FISH检测试剂盒，包括FISH荧光探针，杂交液和染色液，探针的序列分别为17号染色体特异性探针和HER-2基因特异性探针。本发明试剂盒，采用优化的短序列荧光探针，将原有的FISH检测时间由16～18小时缩短至1～2小时，可以快速、准确地检测出HER-2基因，利于疾病的早期诊断与治疗。本发明试剂盒使用两种不同类型的探针，一种与17号染色体的着丝粒相结合，另一种与目的基因HER-2结合，更好地保证了检测结果的可靠性，减少了假阳性结果。
【专利说明】HER-2基因快速FISH检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种FISH方法及其检测试剂盒，特别HER-2基因快速FISH检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] Her2基因编码的酪氨酸激酶-人类表皮生长因子受体2,在正常组织中含有2个 拷贝，在20%-30%的乳腺癌患者中有基因的扩增和蛋白的过度表达。HER-2扩增阳性患者 的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人 源化单克隆抗体，适用于HER-2过度表达的乳腺癌。由于只有HER-2过度表达和基因扩增 的乳腺癌患者用曲妥珠单抗治疗才有效，因此正确检测和评定乳腺癌的HER-2状态至关重 要。目前通常使用的免疫组织化学方法无法区分HER-2蛋白为中度阳性（IHC检测2+)的 患者是否存在HER-2基因的扩增，直接检测HER-2基因扩增水平的荧光原位杂交被认为是 检测乳腺癌HER-2基因扩增的"金标准"。
[0003] 突光原位杂交（FISH, fluorescence in situ hybridization)是一项在体外直 接观察细胞中特定核酸的技术。根据碱基互补配对的原则，特定的DNA序列与细胞内的目 标序列互补结合。由于探针带有荧光，在合适的激发光照射下，杂交探针及目标DNA能够在 荧光显微镜下被清楚地观察到，是一种直观有效的检测方法。
[0004] 现有的FISH探针合成后做进一步的荧光标记。短序列探针的序列短，在染色体上 的信号弱，为保证可以观察到较为显著的信号，短序列FISH探针一般仅用于重复序列的标 记。对于非重复基因序列，探针除需要覆盖除目的基因以外的基因序列，要求探针的长度较 大，导致所需要的杂交时间很长(一般是过夜杂16-18小时)，不能及时的得到检测结果，这 不利于临床的诊断及治疗。
[0005] 有必要开发出一种HER-2基因快速的FISH检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种HER-2基因快速FISH检测试剂盒。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： HER-2基因快速FISH检测试剂盒，包括FISH荧光探针，杂交液和染色液，其中，探针的 序列分别为：17号染色体特异性探针，其序列为： 探针 1 :CATTGTCAGAAACTTCTTTGTGATG 探针 2 :ATTGCATTCAACTCACAGAGTTGA 探针 3 :AGGTTCCTTTTCAAACAGCAGTTTC 探针 4 :CAATCACTCTTTCTGTGGAATCTGC 探针 5 :AAGTGGATAITTGGGCCTCTCTG 探针 6 :AGGATTTCGTTGGAAACGGGA 探针 7 :AACGGGATAACTGCACCTAACTAA 探针 8 :ACGGAAGCATTCTCAGAAACTGCT 探针 9 :TTGTGATGATTGCATTCACCTCAC 探针 10 :AGAGTTGAACATTCCTATTGATAG 探针 11 :AGCAGITTGGAAACACTCTTGTTG 探针 12 :CATAGAGTAGTTCTGAAACATGC 探针 13 :CCTGTGGTGGAAAACGAATTATG 探针 14 :ATATGTGGACCTCTCCGAAGATG 探针 15 :ATATGTGGACCTCTCCGAAGATG 探针 16 :CATTCTCAGAAACTTCTTGGTGATG 探针 17 :CCACTCTGTGGCCTTCGTTCG HER-2基因特异性探针，其序列为： 探针 Γ :CCTTGCACTTGAAAAGGCTC 探针 2' ：GGAGCGGAAGTGATTCAGAG 探针 3' ：ACGCCTGATGGGTTAATGAG 探针 4' ：ACTGGTCTCCCTCACTCCCT 探针 5' ：CTTGACAAATCCAGGGCTGT 探针 6' ：TAGCCTGGGATTCCATTCAC 探针 7' ：AAAACAACCCCTTAGCCCTC 探针 8' ：CAGAGGTCCTTGAAAACCCA 探针 9' ：TGAAGGGCAAAGGAAGAGAA 探针 10' ：TGTGACCAGGAACCATTCTG 探针 11' ：CAAAAGTGAGGTGAGTCGCA 探针 12' ：CACCCCTAGGAAGGACCAAT 探针 13' ：GATCTGAGTTTGCTGCCCTC 探针 14' ：CCCCTTCCTCTCCTCTTGTC 探针 15' ：ATGCAGAGAGGATGGGTTTG 探针 16' ：AACCTTTCCGGACACAACAG 探针 17' ：CTGGATGATGGGGTGAGAGT 探针 18' ：CGATGTGACTGTCTCCTCCC 探针 19' ：AGAGTCACCAGCCTCTGCAT 探针 20' ：ATTGGGACCGGAGAAACC 探针 21' ：CTCCTATCCCGAAGTTGTGG 探针 22' ：CTCCCCTTCAGACGATTTTG 探针 23' ：GTTCTGCTGCCTTTTCCTTG 探针 24' ：GCAGGGGAGACAAAATGAAA 探针 25' ：AGTACATCCTTGCCCTCCCT 探针 26' ：GGTATGGGTTTTACAAATTGCAG 探针 27' ：TCCAGCCAACAATAATGGGT 探针 28' ：CCAGGGTAGTTGTGCCTGTC 探针 29' ：GGGCATAGAGATGAATCCGA 探针 30' ：TTCTGCTGTGAGCAAGAGGA 探针 31' ：AGGGCAGATATGGGGACAAT 探针 32' ：TATTTATGTTGGCGTGGGGT 探针 33' ：GGCACACAGTAGGTGCTCAG 探针 34' ：AGTCTGTTGGGGGAGGAAGT 探针 35' ：TTGTGCTGTCCCTGAATCTG 探针 36' ：TATGCAGGGCTGACGTAGTG 探针 37' ：AACTCCAGCTGACCCTCCTT 探针 38' ：GAAGCCTTTCCCCTGAAATC 探针 39' ：CTGGAACTCACCTACCTGCC 探针 40' ：CCCTCTCCCACTTACAGCAG 探针 41' ：TCGGAGTTTATGAAATGCCC 探针 42' ：ACAACCAAGTGAGGCAGGTC 探针 43' ：CACTGCTAACCAGGGGGAG 探针 44' ：TAACTATTTGCTGGCCCTGG 探针 45' ：AGCATCTGGACCTAGCATGG 探针 46' ：AACCAGCTGGCTCTCACACT 探针 47' ：CCGTCCTCTCGCTGTTAGAC 探针 48' ：GGTGATGCTGATGAGGGTCT 探针 49' ：GGCAAAACAGCACAGTGAAA 探针 50' ：CCTCCTCTCACAGGAACAGG。
[0008] 优选的，上述检测试剂盒中的使用的探针中，17号染色体特异性探针连接的荧光 基团为绿色荧光基团。
[0009] 优选的，上述检测试剂盒中的使用的探针中，HER-2基因特异性探针连接的荧光基 团为红色荧光基团。
[0010] 本发明的有益效果是： 本发明试剂盒，采用优化的短序列荧光探针，将原有的FISH检测时间由16?18小时 缩短至1?2小时，可以快速、准确地检测出HER-2基因，利于疾病的早期诊断与治疗。本 发明试剂盒使用两种不同类型的探针，一种与17号染色体的着丝粒相结合，另一种与目的 基因 HER-2结合，更好地保证了检测结果的可靠性，减少了假阳性结果。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1和2是染色后的镜检结果。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 : HER-2基因快速FISH检测试剂盒，包括FISH荧光探针，杂交液和染色液，其中，探针的 序列分别为： 17号染色体特异性探针，其序列为： 探针 1 :CATTGTCAGAAACTTCTTTGTGATG 探针 2 :ATTGCATTCAACTCACAGAGTTGA 探针 3 :AGGTTCCTTTTCAAACAGCAGTTTC 探针 4 :CAATCACTCTTTCTGTGGAATCTGC 探针 5 :AAGTGGATAITTGGGCCTCTCTG 探针 6 :AGGATTTCGTTGGAAACGGGA 探针 7 :AACGGGATAACTGCACCTAACTAA 探针 8 :ACGGAAGCATTCTCAGAAACTGCT 探针 9 :TTGTGATGATTGCATTCACCTCAC 探针 10 :AGAGTTGAACATTCCTATTGATAG 探针 11 :AGCAGITTGGAAACACTCTTGTTG 探针 12 :CATAGAGTAGTTCTGAAACATGC 探针 13 :CCTGTGGTGGAAAACGAATTATG 探针 14 :ATATGTGGACCTCTCCGAAGATG 探针 15 :ATATGTGGACCTCTCCGAAGATG 探针 16 :CATTCTCAGAAACTTCTTGGTGATG 探针 17 :CCACTCTGTGGCCTTCGTTCG ; HER-2基因特异性探针，其序列为： 探针 Γ :CCTTGCACTTGAAAAGGCTC 探针 2' ：GGAGCGGAAGTGATTCAGAG 探针 3' ：ACGCCTGATGGGTTAATGAG 探针 4' ：ACTGGTCTCCCTCACTCCCT 探针 5' ：CTTGACAAATCCAGGGCTGT 探针 6' ：TAGCCTGGGATTCCATTCAC 探针 7' ：AAAACAACCCCTTAGCCCTC 探针 8' ：CAGAGGTCCTTGAAAACCCA 探针 9' ：TGAAGGGCAAAGGAAGAGAA 探针 10' ：TGTGACCAGGAACCATTCTG 探针 11' ：CAAAAGTGAGGTGAGTCGCA 探针 12' ：CACCCCTAGGAAGGACCAAT 探针 13' ：GATCTGAGTTTGCTGCCCTC 探针 14' ：CCCCTTCCTCTCCTCTTGTC 探针 15' ：ATGCAGAGAGGATGGGTTTG 探针 16' ：AACCTTTCCGGACACAACAG 探针 17' ：CTGGATGATGGGGTGAGAGT 探针 18' ：CGATGTGACTGTCTCCTCCC 探针 19' ：AGAGTCACCAGCCTCTGCAT 探针 20' ：ATTGGGACCGGAGAAACC 探针 21' ：CTCCTATCCCGAAGTTGTGG 探针 22' ：CTCCCCTTCAGACGATTTTG 探针 23' ：GTTCTGCTGCCTTTTCCTTG 探针 24' ：GCAGGGGAGACAAAATGAAA 探针 25' ：AGTACATCCTTGCCCTCCCT 探针 26' ：GGTATGGGTTTTACAAATTGCAG 探针 27' ：TCCAGCCAACAATAATGGGT 探针 28' ：CCAGGGTAGTTGTGCCTGTC 探针 29' ：GGGCATAGAGATGAATCCGA 探针 30' ：TTCTGCTGTGAGCAAGAGGA 探针 31' ：AGGGCAGATATGGGGACAAT 探针 32' ：TATTTATGTTGGCGTGGGGT 探针 33' ：GGCACACAGTAGGTGCTCAG 探针 34' ：AGTCTGTTGGGGGAGGAAGT 探针 35' ：TTGTGCTGTCCCTGAATCTG 探针 36' ：TATGCAGGGCTGACGTAGTG 探针 37' ：AACTCCAGCTGACCCTCCTT 探针 38' ：GAAGCCTTTCCCCTGAAATC 探针 39' ：CTGGAACTCACCTACCTGCC 探针 40' ：CCCTCTCCCACTTACAGCAG 探针 41' ：TCGGAGTTTATGAAATGCCC 探针 42' ：ACAACCAAGTGAGGCAGGTC 探针 43' ：CACTGCTAACCAGGGGGAG 探针 44' ：TAACTATTTGCTGGCCCTGG 探针 45' ：AGCATCTGGACCTAGCATGG 探针 46' ：AACCAGCTGGCTCTCACACT 探针 47' ：CCGTCCTCTCGCTGTTAGAC 探针 48' ：GGTGATGCTGATGAGGGTCT 探针 49' ：GGCAAAACAGCACAGTGAAA 探针 50' ：CCTCCTCTCACAGGAACAGG ; 其中，17号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团，HER-2基因特异性探 针连接的荧光基团为红色荧光基团。
[0013] 其中，探针1?17分别编号为SEQ ID N0 :1?17,探针Γ?50'分别编号为SEQ ID N0 :18 ?67。
[0014] FISH 检测 1) 将石錯包埋样本玻片放入65±5°C恒温箱中烤片过夜； 2) 取出玻片，将其放入室温二甲苯中15分钟，重复一次； 3) 取出玻片，再将其放入室温无水乙醇中10分钟； 4) 取出玻片，再将其放入室温100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇各3分钟； 5) 取出玻片，再将其放入室温去离子水中3分钟； 6) 取出玻片，再将其放入95°C -99°C的样本处理液中煮片10分钟(切片水平放置于容 器中，样本面朝上）； 7 )取出玻片，等其凉至室温后，再将其放入无菌纯水中3分钟，用无绒纸巾吸去多余水 分(不能触碰到组织）； 8) 室温晾干，将玻片平摊放在恒温箱或加热平台上，在样本区域滴加适量(覆盖整个样 本区即可）的蛋白酶K反应液，37°消化5?15分钟； 9) 倒去玻面上的多余液体，将其放入室温洗液中5分钟，重复一次； 10) 取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各2分钟，室温晾干； 11) 从-20±5°C冰箱中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心； 12) 加10 μ 1的杂交液(含17号染色体和HER-2基因荧光探针）到杂交区域，迅速盖上 22 X 22mm盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡； 13) 用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位； 14) 将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置 "Denat&Hyb"程序，杂交(变性 95。lOmin，杂交 42。20min); 15) 将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片(若盖玻片难以去除，可以将其放入洗液 I中微微摇晃，以利于其脱落）； 16) 玻片放入洗液中室温孵育5分钟； 17) 取出玻片，再将其放入洗液中室温孵育2分钟； 18) 取出玻片，自然干燥玻片； 19) 室温，滴加10 ul DAPI复染剂到22X22mm的盖玻片，载玻片目标区域朝下，轻放 于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察； 其中，15)?19)避光操作。
[0015] 镜检结果如图1和2所示。从图中可以看出，本发明的检测试剂盒中所使用的探 针，可以与目的序列快速稳定的结合，检测结果准确可靠，同时大大缩短了 HER-2基因的荧 光检测时间，利于疾病的早期诊断与治疗。
【权利要求】
1. HER-2基因快速FISH检测试剂盒，包括FISH荧光探针，杂交液和染色液，其中，探针 的序列分别为：17号染色体特异性探针，其序列为： 探针 1 :CATTGTCAGAAACTTCTTTGTGATG 探针 2 :ATTGCATTCAACTCACAGAGTTGA 探针 3 :AGGTTCCTTTTCAAACAGCAGTTTC 探针 4 :CAATCACTCTTTCTGTGGAATCTGC 探针 5 :AAGTGGATAITTGGGCCTCTCTG 探针 6 :AGGATTTCGTTGGAAACGGGA 探针 7 :AACGGGATAACTGCACCTAACTAA 探针 8 :ACGGAAGCATTCTCAGAAACTGCT 探针 9 :TTGTGATGATTGCATTCACCTCAC 探针 10 :AGAGTTGAACATTCCTATTGATAG 探针 11 :AGCAGITTGGAAACACTCTTGTTG 探针 12 :CATAGAGTAGTTCTGAAACATGC 探针 13 :CCTGTGGTGGAAAACGAATTATG 探针 14 :ATATGTGGACCTCTCCGAAGATG 探针 15 :ATATGTGGACCTCTCCGAAGATG 探针 16 :CATTCTCAGAAACTTCTTGGTGATG 探针 17 :CCACTCTGTGGCCTTCGTTCG HER-2基因特异性探针，其序列为： 探针 Γ :CCTTGCACTTGAAAAGGCTC 探针 2' ：GGAGCGGAAGTGATTCAGAG 探针 3' ：ACGCCTGATGGGTTAATGAG 探针 4' ：ACTGGTCTCCCTCACTCCCT 探针 5' ：CTTGACAAATCCAGGGCTGT 探针 6' ：TAGCCTGGGATTCCATTCAC 探针 7' ：AAAACAACCCCTTAGCCCTC 探针 8' ：CAGAGGTCCTTGAAAACCCA 探针 9' ：TGAAGGGCAAAGGAAGAGAA 探针 10' ：TGTGACCAGGAACCATTCTG 探针 11' ：CAAAAGTGAGGTGAGTCGCA 探针 12' ：CACCCCTAGGAAGGACCAAT 探针 13' ：GATCTGAGTTTGCTGCCCTC 探针 14' ：CCCCTTCCTCTCCTCTTGTC 探针 15' ：ATGCAGAGAGGATGGGTTTG 探针 16' ：AACCTTTCCGGACACAACAG 探针 17' ：CTGGATGATGGGGTGAGAGT 探针 18' ：CGATGTGACTGTCTCCTCCC 探针 19' ：AGAGTCACCAGCCTCTGCAT 探针 20' ：ATTGGGACCGGAGAAACC 探针 21' ：CTCCTATCCCGAAGTTGTGG 探针 22' ：CTCCCCTTCAGACGATTTTG 探针 23' ：GTTCTGCTGCCTTTTCCTTG 探针 24' ：GCAGGGGAGACAAAATGAAA 探针 25' ：AGTACATCCTTGCCCTCCCT 探针 26' ：GGTATGGGTTTTACAAATTGCAG 探针 27' ：TCCAGCCAACAATAATGGGT 探针 28' ：CCAGGGTAGTTGTGCCTGTC 探针 29' ：GGGCATAGAGATGAATCCGA 探针 30' ：TTCTGCTGTGAGCAAGAGGA 探针 31' ：AGGGCAGATATGGGGACAAT 探针 32' ：TATTTATGTTGGCGTGGGGT 探针 33' ：GGCACACAGTAGGTGCTCAG 探针 34' ：AGTCTGTTGGGGGAGGAAGT 探针 35' ：TTGTGCTGTCCCTGAATCTG 探针 36' ：TATGCAGGGCTGACGTAGTG 探针 37' ：AACTCCAGCTGACCCTCCTT 探针 38' ：GAAGCCTTTCCCCTGAAATC 探针 39' ：CTGGAACTCACCTACCTGCC 探针 40' ：CCCTCTCCCACTTACAGCAG 探针 41' ：TCGGAGTTTATGAAATGCCC 探针 42' ：ACAACCAAGTGAGGCAGGTC 探针 43' ：CACTGCTAACCAGGGGGAG 探针 44' ：TAACTATTTGCTGGCCCTGG 探针 45' ：AGCATCTGGACCTAGCATGG 探针 46' ：AACCAGCTGGCTCTCACACT 探针 47' ：CCGTCCTCTCGCTGTTAGAC 探针 48' ：GGTGATGCTGATGAGGGTCT 探针 49' ：GGCAAAACAGCACAGTGAAA 探针 50' ：CCTCCTCTCACAGGAACAGG。
2. 根据权利要求1所述的HER-2基因快速FISH检测试剂盒，其特征在于：17号染色体 特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。
3. 根据权利要求1所述的HER-2基因快速FISH检测试剂盒，其特征在于：HER-2基因 特异性探针连接的荧光基团为红色荧光基团。
【文档编号】C12Q1/68GK104195246SQ201410431098
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】陈华云, 刘淑园, 肖湘文, 丁渭, 陈嘉昌, 黄爽, 曾烨, 黄家伟 申请人:广州和实生物技术有限公司