位于簇毛麦6vs dna渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了抗白粉病近等基因系京411/6VS.6AL/京4117配制方法和6VS渗入近等基因系DNA片段序列。该近等基因系的获得是以抗白粉病小麦易位系T6VS.6AL为抗病基因供体亲本，以农艺性状优良但不抗白粉病的栽培小麦京411为轮回亲本，T6VS.6AL与京411杂交后，获得的F1再与京411连续回交7代，自交1代育成近等基因系411/6VS.6AL/京4117。每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。本发明的实验结果表明，EACG/M14-301是6VS上的专一分子标记，它可以用于小麦抗白粉病种质资源的筛选和 Pm21 高抗、广谱抗病特性的机理研究以及小麦起源进化、远缘杂交亲本选择等方面的研究。
【专利说明】位于簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列 及应用
[0001] 本发明得到国家自然科学基金(编号：31071671)和天津市科技支撑重点 (11ZCKFNC00700)资助。
【技术领域】
[0002] 本发明属于农业生物技术工程，涉及抗白粉病近等基因系配制、簇毛麦6VS DNA渗 入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据以及应用。
【背景技术】
[0003] 近等基因系（Near isogenic line, NIL)是通过一个重要农艺性状优良但某一性 状不够理想的栽培种作为轮回亲本（Recurrent parent, PR)与一个具目标基因的品种或 品系杂交、回交6-8代后再自交一代培育而成，因此NIL与PR是遗传背景相同仅目标基因 有差异的一对品种。由于NIL可以用于目标基因的分离、基因的精细定位与克隆及基因多 效性分析，目前，已被广泛应用于遗传学研究以及育种实践中。但由于NIL的培育时间长， 在回交选育过程中，容易受发育、环境条件及人为因素的影响，因此，为保证NIL的培育质 量与选择效果，对NIL遗传背景评估与检测十分重要。早期研究者们利用回交世代与外观 形态对NIL的遗传背景进行评价，但这种方法多侧重于NIL与PR的遗传相似性分析上，对 特定目标基因的跟踪即供体基因在NIL中的检测则报道较少。虽然近10多年来，利用分子 标记技术追踪NIL目标基因的工作取得进展，如Kaczorowski等在黄豆抗Kagl NIL中筛选 到与目标基因相连锁的22个SFPS，Martin等在番茄抗Pro NIL中发现存在抗病基因供体 片段，Stan等发现在10个NIL中有目标基因片段的存在，我们在以Brock为供体基因配制 的小麦抗白粉病NIL中也筛选到了与供体基因相连锁的P15/M14-160AFLP分子标记。上述 工作为提高NIL的培育质量与筛选效益发挥了积极作用。
[0004] 儀毛复(Masypyrum villosum，2 ^\=2Χ=]Α，Ψ〇 是普通/\、复(Jriticum aestivum, 2N=6X=42, MBBDD)的野生近缘种。我国学者陈佩度等利用簇毛麦与小麦杂交结合辐射培育 了小麦-簇毛麦染色体易位系（T6VS. 6AL)，细胞与抗性遗传学研究表明，抗小麦白粉病基因 ZfeW位于6VS上。ZfeW被证实对所有的菌株都是免疫的。近期，他们的研究又发现抗 白粉病基因基因区域中的一个关键基因丝氨酸/苏氨酸激酶基因泣K。本发明以 T6VS. 6AL为抗白粉病基因供体，以生产上已推广种植多年但对白粉病敏感的小麦优良品种 京411为轮回亲本，在白粉菌胁迫下，经过连续8年的回交转育，培育了具强抗白粉病特性的 NIL，用AFLP分子标记方法，对NIL中供体基因进行跟踪监测，找到了簇毛麦6VS基因组渗入 NIL中的分子证据和NIL中来源于簇毛麦6VS上的部分同源分子序列。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小 麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列，其特征在于具有SEQ ID N0:1 所述的核苷酸序列。
[0006] 本发明公开的位于簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列的制备方 法，其特征在于包括如下步骤 1、抗白粉病近等基因系京411/6VS. 6AL/京4117配制： 供试材料普通栽培小麦京411 aeWira?，2N=6X=42，AABBDD)，农艺性状 优良，但易感染白粉病；抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位系6VS. 6AL (T6VS. 6AL)，易位系 中的6VS来源于簇毛麦2N=2X=14, VV)。以6VS. 6AL为抗病供体亲 本，京411为轮回亲本配制的近等基因系京411/6VS.6AL/京4117( Near-isogenic Lines, NIL)。其过程为T6VS.6ALX京411杂交，所得F1均抗白粉病，用京411回交7代，自交1代 育成抗白粉病近等基因系411/6VS. 6AL/京4117 ;每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下 选择抗病单株。
[0007] 2、簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据的获得： 提取栽培小麦京411、T6VS. 6AL、簇毛麦和NIL基因组DNA，用AFLP分析技术，寻找在普 通小麦中不存在，但同时存在于NIL、簇毛麦和T6VS. 6AL的差异谱带，克隆并测序这些差异 带，通过BLAST比对确定同时存在于NIL、簇毛麦和T6VS. 6AL的差异片段的DNA碱基序列， 同源性高达100%的片段即为簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据。
[0008] 3、簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据 一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基 因系的DNA片段EACG/M14-301，其序列为： GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCA TTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCC TGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTT GTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA。
[0009] 本发明更进一步公开了通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入 到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301在制备抗白粉病育种中的应用。我们 用EACG/M14为引物，在轮回亲本京411、簇毛麦、抗白粉病小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL、 近等基因系（京411/6VS. 6AL/京4117) 120个单株中进行PCR扩增，片段EACG/M14-301与 6VS紧密连锁。
[0010] 本发明更加详细的制备方法如下： 1材料 供试材料普通栽培小麦京411 aesiira?，2N=6X=42, AABBDD)，农艺性 状优良，但易感染白粉病；抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位系6VS.6AL (T6VS.6AL);以 6VS. 6AL为抗病供体亲本，京411为轮回亲本配制的近等基因系京411/6VS. 6AL/京4117 ( Near-isogenic Lines, NIL)。散毛"复 iDasypyrum villosum，2N=2X=14, VV) 2材料培养及抗病性鉴定 将小麦种子放置于铺有湿润滤纸的培养皿中，20°C下于人工气候箱中催芽，待根长Icm 时转移到培养土中，置于人工气候箱中培养，培养条件：白天温度25°C，湿度60%，光照强度 80,16h ;夜间温度22°C，湿度60%，黑暗，8h。小麦长至一叶一心期时，用毛笔蘸取新鲜的白粉 菌孢子均匀刷在叶片表面，培养7-10天后，调查小麦感病情况。抗病等级按照盛宝钦（1988) 提出的O?4级分级法(0型为免疫，1?4型分别表示高抗、抗、敏感、高度感病）方法进行。 [0011] 3不同抗性材料接种白粉菌后的显微观察 分别剪取不同染菌时间（211、411、811、1211、1611、2011、2411、3611、4811、6011、7211)小麦叶片，各 取中间2cm左右叶段4段，置于固定透明液(无水乙醇：冰乙酸3:1，0. 15%三氯乙酸冲固定 72h，再用染色液（0. 6%考马斯亮蓝R-250甲醇溶液:15%三氯乙酸=:11)染色24h，冲洗叶片 表面的染色液后于保存液(冰乙酸：甘油：水=1:4:15)中保存待用。取叶段于载玻片上，用 保存液作浮载液制成临时装片，于显微镜下（Nikon Al)观察附着胞形态及宿主抗性反应等 互作情况，统计白粉菌孢子数、孢子萌发芽管数、正常附着胞数、畸形附着胞数以及寄主细 胞的结构特征变化等。
[0012] 4 NIL 的 AFLP 分析 4. 1小麦DM的提取采用CTAB法，略有改动：称取0. 2g幼嫩叶片剪碎于研钵中，加液氮 迅速研磨成粉状转入5ml离心管，加 ImlDNA提取缓冲液（0. IM Tris ·α，ρΗ8. 0 ;0. 02mM EDTA， ρΗ8· 0 ;1· 4M NaCl ;4%CTAB ;1%PVP)，65°C水浴 90min，期间每 IOmin 振摇一次；10000rpm，4°C 离心lOmin，取上清液于新的5ml离心管，加等体积的酚-氯仿-异戊醇（25 :24 :1)轻轻上 下颠倒充分混勻，IOOOOrpm离心IOmin,吸取上清液于新的5ml离心管，再次加等体积酚-氯 仿-异戊醇抽提，IOOOOrpm离心lOmin，吸取上层水相于2ml离心管；加等体积冷异丙醇，于一 20°C放置20min以上。待DNA沉淀后于12000rpm离心10min，收集沉淀；加72〇μ175%乙醇， 8(^lNaAc (3Μ，ρΗ5. 2)洗涤沉淀，静置 20min，12000rpm 离心 IOmin ;加 80〇μ175% 乙醇，洗涤沉 淀，静置 l〇min，12000rpm 离心 10min，收集沉淀；加 ΙΟΟμΙΤΕ (Tris ·α，1Μ，Ε?ΤΑ，0. 5Μ，ρΗ8· 0) 溶解DNA，加2PlRNAse，于37°C孵育Ih降解RNA ;加等体积氯仿-异戊醇（24 :1)去除RNAse， IOOOOrpm离心IOmin,取上清；重复一次；取上清，加2倍体积冷无水乙醇，1/10体积NaAc,混 匀后于一20°C放置20min，12000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用75%乙醇洗2次，稍离心， 去掉洗涤液，晾干后溶于4〇μ1ΤΕ。取5μ1?ΝΑ样品在0. 7%的琼脂糖凝胶上检测DM的完整性。 取2μ1样品用Nanodrop 2000C测定DNA的浓度。
[0013] 4. 2 AFLP扩增及产物检测 AFLP分析参照Vos等的方法。所用接头和引物见表1。基因组DNA双酶切及接头连接、 预扩增、选择性扩增以及扩增产物的检测参照张荣等[7 ]的方法。
[0014] 表！ AFLP分析所用接头和引物
【权利要求】
1. 一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等 基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列，其特征在于具有SEQ ID N0:1所述的核苷酸序 列。
2. 权利要求1所述位于簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列的制备方 法，其特征在于包括如下步骤： (1) 抗白粉病近等基因系京411/6VS. 6AL/京4117配制 以6VS. 6AL为抗病供体亲本，京411为轮回亲本配制的近等基因系京411/6VS. 6AL/京 4117 ( Near-isogenic Lines, NIL);其过程为 T6VS.6ALX 京 411 杂交，所得 抗白粉 病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系411/6VS. 6AL/京4117 ;每一次的 杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株； (2) 族毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列的获得 通过BLAST比对确定同时存在于NIL、簇毛麦和T6VS. 6AL的差异片段的DNA碱基序列， 同源性高达100%的片段即为簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列； (3) 簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列 一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基 因系的DNA片段EACG/M14-301，其序列为： GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCA TTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCC TGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTT GTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA。
3. 权利要求1所述通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗 白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301在制备抗白粉病育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104278028SQ201410470561
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】王振英, 刘晓颖, 彭永康, 范宝莉, 陈宏
申请人:天津师范大学