一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法，该芽孢杆菌(Bacillus sp.)保藏编号为CGMCC NO.9143。本发明的芽孢杆菌，可以以豆制品废水和/或味精废水为培养基，发酵培养得到多糖絮凝剂。本发明的芽孢杆菌和产絮凝剂的方法，不仅可高产絮凝剂，同时能去除豆制品废水和味精废水的COD和NH4+-N，此外，得到的多糖絮凝剂不仅可以改善浓缩污泥脱水性能，而且可以去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻及塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
CGMCC No. 9143
2014.05.12
【专利说明】一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一株产絮凝剂的芽孢杆菌的选育、以及味 精废水和豆制品废水复合培养芽孢杆菌产絮凝剂的方法。
【背景技术】
[0002] 生物絮凝剂具有高效、无毒和可生物降解性，是典型的环境友好功能材料，代表 了絮凝剂的重要研发方向之一。Burterfield于1935年从活性污泥中最早筛选到产絮凝 剂的微生物。20世纪70年代以来，国内外学者筛选到许多产絮凝剂的微生物，发现从土 壤、活性污泥、生活污水、工业废水以及各类沉积物样品中，均可分离得到具有产絮能力的 微生物，包括细菌、藻类、放线菌、真菌和酵母等（朱艳彬等，中国环境科学学会学术年会论 文集，2009,173-178)。20世纪末，日本学者从旱田土壤分离筛选得到的一株红串红球菌 (Rhodococcus erythropolis) S-I产生的N0C-1，是已发现效果最好的生物絮凝剂之一，具 有强而广泛的絮凝活性（J Takeda M, Agric. Biol. Chem, 1991，55(10) :2263-2264)。
[0003] 生物絮凝剂属于天然有机高分子絮凝剂，可以根据不同的方式进行分类：（1)根 据来源不同分为3类：直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母；利 用微生物细胞提取物的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N-乙酰葡萄 糖胺等；利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物，主要成 分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合物；(2)根据化学组成的不同分为3类：糖类 物质，绝大多数是代谢产生的各种多聚糖类；多肽、蛋白质和DNA类物质，已知絮凝能力最 好的生物絮凝剂N0C-1的主要成分即为蛋白质，其最大相对分子质量为75万；脂类物质，目 前发现的唯一的脂类絮凝剂是1994年Kurane从Rhodococcus erythropolis s_l的培养 液中分离出来的生物絮凝剂；（3)根据在分散介质水中所带电荷的不同分为3类：两性型蛋 白质和多肽类大分子，为两性电解质；非离子型多糖类生物絮凝剂，属于非离子型絮凝剂； 阴离子型直接利用微生物细胞的絮凝剂（李大鹏，哈尔滨工业大学博士论文，2010, 4-5)。
[0004] 以廉价底物为原料培养微生物产絮凝剂被广泛地研究。如Xiaoling Zhang等以 糖蜜为原料培养Bacillus Iicheniformis产絮凝剂，优化的培养基配方为20g · I71糖蜜、 0· 4g · Γ1 尿素、0· 4g · T1NaCUO. 2g · T1KH2PO4U. 6g · 17%册04、0· 2g · T1MgSO4 ;在优化 条件下 12h 内产絮凝剂活性达到 700U .mrHXiaoling Zhang, et al, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2012, 17:1041-1047)〇
[0005] 影响生物絮凝剂发酵的因素很多，培养基的组成、C/N比、培养基的pH值、温度、溶 氧等都将影响生物絮凝剂的产率。细胞生长与生物絮凝剂产生的关系因菌种不同而异。根 据国内外相关研究者对胞外分泌产絮凝剂的产絮菌的研究表明，其产生胞外代谢物的时间 主要应该在对数期后期和稳定期前期、中期，在对数期前期基本上不产絮凝剂。
[0006] 目前，生物絮凝剂的研究还存在一些问题，主要表现为：（1)絮凝效率低，制备成 本高；（2)代谢途径特别是多种菌株产复合絮凝剂的代谢途经及调控机理还不清楚；（3)从 大规模工业生产和应用急需解决的关键问题（如降低成本、提高产絮能力、生产的调控、提 高产絮稳定性等）角度开展的大规模的发酵技术研究几乎是空白。因此，继续选育具有高 效、稳定的产絮能力的微生物种质资源，以及在对其代谢途径和调控机理研究基础上开展 的发酵技术研究，是生物絮凝剂真正实现大规模工业生产的关键。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一株产生物絮凝剂的细菌。
[0008] 本发明的第一方面，提供一株芽孢杆菌（Bacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC NO. 9143。
[0009] 本发明的第二方面，提供第一方面所述的芽孢杆菌Bacillus sp.的用途，用于制 备絮凝剂。
[0010] 在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
[0011] 本发明的第三方面，提供一种絮凝剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0012] (a)将保藏编号为CGMCC NO. 9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养18-24h得 到一级种子液；
[0013] 任选地（b)将步骤（a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18_24h得到二级 种子液；
[0014] 以及（C)将步骤（a)得到的一级种子液或步骤（b)得到的二级种子液接种于发酵 培养基中培养得到所述絮凝剂。
[0015] 在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
[0016] 在另一优选例中，所述步骤（a)中于35-45°C、150-180rpm的条件下培养。
[0017] 在另一优选例中，所述步骤（b)中于35-45°C、通气量5-10L/min、搅拌速度 350-450rpm的条件下培养。
[0018] 在另一优选例中，所述步骤（(：）中于30-501：(较佳地35-45°〇的条件下培养。
[0019] 在另一优选例中，所述种子液的菌液浓度为1-2X IO9Cfu · πιΓ1。
[0020] 在另一优选例中，所述步骤（b)中，所述一级种子液与所述种子培养基的体积比 3-10:100,较佳地为 4-6:100,更佳为 5:100。
[0021] 在另一优选例中，所述二级种子液或所述一级种子液与所述发酵培养基的体积比 为 5-15:100,较佳地为 8-12:100,更佳为 10:100。
[0022] 在另一优选例中，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基，较佳地，所述产絮凝剂培养 基的组成为：葡萄糖 20g、K2HP045g、KH2P042g、（NH 4)2SO4O. 2g、NaCl 0. lg、尿素 0. 5g、酵母膏 0· 5g、MgSO4O. 2g、H2O 1000ml、ρΗ7· 5。
[0023] 在另一优选例中，所述种子培养基为废水培养基，pH为7-9,包含以下组分：
[0024] 豆制品废水和/或味精废水 500-8001111.17 1;
[0025] 水 200_500ml · ΙΛ
[0026] 其中，所述废水培养基包含?制品废水和味精废水时，所述?制品废水的含量为 250-500ml · Γ1，较佳地为300-400ml · Γ1 ;所述味精废水的含量为150-400ml · Γ1，较佳地 200-300ml · L'
[0027] 在另一优选例中，所述发酵培养基为废水培养基，pH为7-9,包含以下组分：
[0028] 豆制品废水和/或味精废水 500-8001111.17 1;
[0029] 水 200-5001111.171,
[0030] 其中，所述废水培养基包含?制品废水和味精废水时，所述?制品废水的含量为 250-500ml · Γ1，较佳地为300-400ml · Γ1 ;所述味精废水的含量为150-400ml · Γ1，较佳地 200-300ml · L'
[0031] 在另一优选例中，所述发酵培养基中还含有0. 5-5g · LlH2PO4 ;较佳地为 l-4g · T1KH2PO4 ;更佳地为 I. 2-3. 5g · T1KH2PO415
[0032] 在另一优选例中，所述发酵培养基中还含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量为 5_15g · L、
[0033] 在另一优选例中，所述步骤（c)中，在培养至对数期末期，流加5_15g · Γ1的葡萄 糖，较佳地流加8_12g · Γ1的葡萄糖。
[0034] 在另一优选例中，所述步骤（C)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在 15-95 %，较佳地为20-90 %，更佳地为25-65 %。
[0035] 在另一优选例中，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
[0036] 在另一优选例中，所述乙醇与所述步骤（c)获得的发酵液的体积比为3-4:1。
[0037] 本发明的第四方面，提供一种絮凝剂，采用第三方面所述的方法制备获得。
[0038] 在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
[0039] 在另一优选例中，所述絮凝剂具有以下一个或多个特征：
[0040] (1)具有如图3所示的红外特征谱图；
[0041] (2)具有如图4所示的紫外特征谱图。
[0042] 本发明的第五方面，提供第四方面所述的絮凝剂的用途，所述絮凝剂用于：
[0043] (i)制备改善浓缩污泥脱水性能的促进剂；或
[0044] (ii)去除米氏凯伦藻；或
[0045] (iii)去除塔马亚历山大藻。
[0046] 在另一优选例中，去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻。
[0047] 在另一优选例中，去除塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
[0048] 在另一优选例中，所述米氏凯伦藻培养液是F/2培养基。
[0049] 在另一优选例中，所述塔马亚历山大藻培养液是F/2培养基。
[0050] 在另一优选例中，所述F/2培养基配方：NaN0375mg、NaH2PO 4 · H2O 5mg、 Na2SiO3 ·9Η20 20mg,Na2EDTA 4. 36mg,FeCl3 ·6H20 3. 16mg,CuSO4 · 5H20 0. Olmg^ZnSO4 · 7H20 0· 023mg、CoCl2 ·6Η20 0· 012mg、MnCl2 ·4Η20 0· 18mg、Na2Mo04 ·2Η20 0· 07mg、维生素 B1O. lg、 维生素 B12O. 5g、生物素0. 5g、自然海水（0. 4 μ m孔径滤膜过滤）1000ml。
[0051] 本发明的芽孢杆菌和产絮凝剂的方法，不仅可高产絮凝剂，而且在较高温度下培 养，同时能去除豆制品废水和味精废水的COD和NH/-N，此外，得到的多糖絮凝剂不仅可以 改善浓缩污泥脱水性能，而且可以去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻及塔马亚历山大 藻培养液中的塔马亚历山大藻。
[0052] 应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此 不再一一赘述。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 图1是Bacillus sp. WZOl的革兰氏染色图。
[0054] 图2是Bacillus sp. WZYOl分批补料发酵产絮凝剂的进程图。
[0055] 图3是絮凝剂的红外光谱分析图谱。
[0056] 图4是絮凝剂的紫外光谱分析图谱。
【具体实施方式】
[0057] 本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外研发出一种新的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)WZY01，具有高的产絮凝剂能力，能在较高温度下培养，并可直接利用豆制 品废水和味精废水为营养来源产絮凝剂，可为微生物发酵法生产絮凝剂提供种源。在此基 础上，完成了本发明。
[0058] 芽孢杆菌
[0059] 本发明采用常规分离方法，从采自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥中分离并 经复合诱变育种获得一株芽孢杆菌（Bacillus sp.)，编为Bacillus sp.WZYOl，已保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 9143,保藏起始日期为2014年05月12日。
[0060] LB培养基
[0061] LB培养基是常用的细菌培养基，因其营养丰富，可使细菌菌种快速生长而达到活 化或作为种子的要求。可以根据《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著）进 行配制。
[0062] 废水培养基
[0063] 本发明的废水培养基，pH为7-9,包含以下组分：
[0064] 豆制品废水和/或味精废水 500-8001111.17 1;
[0065] 水 200_500ml · ΙΛ
[0066] 其中，当所述废水培养基包含?制品废水和味精废水时，所述?制品废水的含量 为250-500ml .L-1，较佳地为300-400ml .L-1 ;所述味精废水的含量为150-400ml .L-1，较佳 地 200-300ml · ΙΛ
[0067] 基于所述复合废水培养基的总体积计。
[0068] 在另一优选例中，本发明的废水培养基，pH为7-9,包含以下组分：
[0069] 豆制品废水和味精废水 500-8001111.17 1;
[0070] 水 200_500ml · ΙΛ
[0071] 其中，所述豆制品废水的含量为250-500ml · Γ1，较佳地为300-400ml · Γ1 ;所述 味精废水的含量为150_400ml · I71，较佳地200-300ml · Γ1，
[0072] 基于所述复合废水培养基的总体积计。
[0073] 在另一优选例中，所述培养基中还含有0· 5_5g · T1KH2PO4 ;较佳地为 l-4g · T1KH2PO4 ;更佳地为 I. 2-3. 5g · T1KH2PO415
[0074] 在另一优选例中，所述培养基中还含有葡萄糖，所述葡萄糖的含量为5_15g · Γ1， 较佳地为8-128·?Α
[0075] 应理解，培养基配方中的水并不包含豆制品废水和味精废水中的水。
[0076] 本发明的?制品废水和味精废水没有特别的限制，任何加工?制品后的废水和任 何生产味精后的除菌体蛋白尾液的废水均可用于本发明。
[0077] 在一优选实施方式中，豆制品废水的COD为15000-20000mg · Γ1、ΝΗ4+-Ν为 50-100mg · Γ1，pH 为 4. 5-5. 5。
[0078] 在一优选实施方式中，味精废水的COD 20000-25000mg · L' NH4+-N为 18000-25000mg · L' SO广为 50000-60000mg · L' pH 为 4· 0-4. 5。
[0079] 絮凝剂
[0080] 本发明还提供芽孢杆菌（Bacillus sp.)WZYOl在复合废水培养基中发酵培养得到 的絮凝剂。
[0081] 在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
[0082] 本发明提供的絮凝剂可用于改善浓缩污泥脱水性能、去除米氏凯伦藻培养液中的 米氏凯伦藻、或去除塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
[0083] 优选地，絮凝剂用于改善浓缩污泥脱水性能的适宜添加量为l_2ml 3%絮凝剂溶 液，pH 6. 2-7.0,温度 20-35 °C。
[0084] 优选地，絮凝剂用于去除米氏凯伦藻或塔马亚历山大藻的适宜浓度为0. 4-0. 6% (ff/V), pH 7. 5-8. 5 〇
[0085] 絮凝剂制备方法
[0086] 本发明的絮凝剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0087] (a)将保藏编号为CGMCC NO. 9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养18-24h得 到一级种子液；
[0088] (b)将步骤（a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18_24h得到二级种子液；
[0089] (C)将步骤（b)得到的二级种子液接种于发酵培养基中培养得到所述絮凝剂。
[0090] 在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
[0091] 在另一优选例中，所述步骤（a)中于35-45°C、150-180rpm的条件下培养。
[0092] 在另一优选例中，所述步骤（b)中于35_45°C的条件下培养，所述步骤（c)中于 30-50°C (较佳地35-45°C)的条件下培养。
[0093] 在另一优选例中，所述种子液的菌液浓度为1-2X IO9Cfu · πιΓ1。
[0094] 在另一优选例中，所述步骤（b)中，所述一级种子液与所述种子培养基的体积比 3-10:100,较佳地为 4-6:100,更佳为 5:100。
[0095] 在另一优选例中，所述二级种子与所述发酵培养基的体积比为5-15:100,较佳地 为 8-12:100,更佳为 10:100。
[0096] 在另一优选例中，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基，其组成为：葡萄糖20g、 K2HP045g、KH2P042g、（NH 4)2SO4O. 2g、NaCl 0· lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgSO4O. 2g、H2O 1000ml、pH7. 5。
[0097] 在另一优选例中，所述发酵培养基为废水培养基，pH为7-9,包含以下组分：
[0098] 豆制品废水和/或味精废水 500-8001111.17 1;
[0099] 水 200_500ml · ΙΛ
[0100] 其中，当所述废水培养基包含?制品废水和味精废水时，所述?制品废水的含量 为250-500ml .L-1，较佳地为300-400ml .L-1 ;所述味精废水的含量为150-400ml .L-1，较佳 地 200-300ml · L'
[0101] 在另一优选例中，所述种子培养基和发酵培养基为废水培养基，pH为7-9,包含以 下组分：
[0102] 豆制品废水和味精废水 500-800ml · Γ1 ;
[0103] 水 200_500ml · ΙΛ
[0104] 所述豆制品废水的含量为250-500ml · L-1，较佳地为300-400ml · L-1 ;所述味精废 水的含量为 150_400ml · Γ1，较佳地 200-300ml · Γ1，
[0105] 所述种子培养基和发酵培养基可以相同，可以不同。
[0106] 在另一优选例中，所述培养基中还含有0. 5_5g · T1KH2PO4 ;较佳地为 l-4g · T1KH2PO4 ;更佳地为 I. 2-3. 5g · T1KH2PO415
[0107] 在另一优选例中，所述培养基中还含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量为5-15g · L'
[0108] 在另一优选例中，所述步骤（c)中，在培养至对数期末期，流加5_15g · Γ1的葡萄 糖，较佳地流加8-12g · Γ1的葡萄糖。
[0109] 在另一优选例中，所述步骤（c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在 15-95 %，较佳地为20-90 %，更佳地为25-65 %。
[0110] 在另一优选例中，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
[0111] 在另一优选例中，所述乙醇与所述步骤（b)获得的发酵液的体积比为3-4:1。
[0112] 本发明能够达到以下技术效果：
[0113] 1.本发明提供一种新型的芽孢杆菌（Bacillus sp.)WZY01，具有高的产絮凝剂能 力，较高的培养温度，并可直接利用豆制品废水和味精废水为营养来源产絮凝剂，可为微生 物发酵法生产絮凝剂提供种源。
[0114] 2.本发明提供了适合培养菌株Bacillus sp. WZYOl产絮凝剂的豆制品废水和味 精废水复合的培养基配方和培养方法。
[0115] 3.在最佳培养条件下，菌株Bacillus sp. WZYOl产絮凝剂的产量达8. 6898·!^， 产率达 0· 362g · 17?'
[0116] 4.本发明不仅可高产絮凝剂，同时能有效去除豆制品废水和味精废水的COD和 NH:-N。
[0117] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0118] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0119] 通用方法
[0120] 絮凝活性（以絮凝率表征）
[0121] 在IOOml量筒中加入80ml蒸馈水，0· 4g高岭土（平均粒度4. 5um)，5ml 1 % CaCl2 溶液，2ml上清液待测样品，再加蒸馏水至IOOml，调pH值至7. 0,然后倒入150ml烧杯，在磁 力搅拌器上快速搅拌lmin，慢速搅拌3min，静置IOmin,吸取一定深度的上清液于550nm处 测定吸光度，同时以不加含絮凝剂的上清液作对照，计算絮凝率（刘国祥等，安全与环境学 报，2006, 6(1) :103-106)。
[0122] 絮凝率=(A-B)/A X 100%
[0123] 式中A为对照上清液在550nm处的吸光度，B为样品上清液在550nm处的吸光度。
[0124] 实施例1
[0125] 絮凝剂产生菌的分离
[0126] 样品为采自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥，将Ig活性污泥加入99ml无菌 水混匀，然后用无菌水稀释成重量（g)体积（ml)比为ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ 6三个稀释，涂布接种于 LB平板，于35°C下培养48h后挑取单菌落在LB平板上划线纯化，直至经镜检为纯培养物为 止，然后转接于LB斜面经培养后于4°C下保藏。
[0127] 将分离获得的纯菌株分别接种于产絮凝剂培养基（葡萄糖20g、K2HP0 45g、 KH2P042g、（NH4)2SO4O. 2g、NaCl 0· lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgS040. 2g、H201000ml、pH7. 5) 中，在35°C、160rpm下振荡培养72h，于8000rpm下离心IOmin得上清液，测定上清液对高 岭土悬池液的絮凝活性，筛选产絮凝活性高的菌株。对产絮凝活性超过70%的菌株进行10 代传代培养，以检测其产絮凝活性的稳定性。
[0128] 经初筛、复筛并传代试验，获得1株产絮凝活性达80. 80 %并稳定的菌株，该菌 株菌体杆状、具荚膜和芽孢、革兰氏阳性（见图1)，初步鉴定为芽孢杆菌，编为Bacillus sp. WZ01。
[0129] 实施例2
[0130] Bacillus sp. WZOl 的复合诱变
[0131] 将实施例1获得的菌株Bacillus sp. WZOl接入装有50ml LB培养基的250ml锥形 瓶内，在35°C、150rpm下振荡培养24h进行活化，然后按5%的体积比转接于装有50ml LB 培养基的250ml锥形瓶内，在35°C、150rpm下振荡培养至对数期（约18h)。取50ml菌液在 5000rpm下离心IOmin,菌体用生理盐水洗漆2次后，用生理盐水制成IO 8个^r1左右的菌 悬液。取15ml菌悬液于平皿中进行紫外线诱变。采用功率为15W UV紫外灯，照射距离为 20cm，照射时间为18min。取5ml经紫外光照射后菌悬液接种于用黑纸包裹的装有50ml LB 培养基的250ml锥形瓶中，在40°C、150rpm下振荡培养4-6h。
[0132] 将培养4-6h的菌液在5000rpm下离心lOmin，菌体用pH6. 0的磷酸缓冲液洗涤2 次后，用pH6. 0的磷酸缓冲液制成IO8个· πιΓ1左右的菌悬液。取Iml菌悬液于试管中，力口 Img · Hir1NTG (用pH6. 0的磷酸缓冲液配制）lml，使NTG终浓度为500 μ g · ml-1，混匀后置 22°C水浴保温30min，并不断摇动试管，然后离心弃上清液终止反应，用LB培养液稀释20 倍，22°C水浴过夜，取1滴菌液涂布于LB平板于40°C下培养后挑去单菌落，特别注意挑取生 长快、与原始菌株的菌落形态比较有所改变的单菌落。将单菌落在LB平板上划线纯化直至 为纯培养物后，转接于LB斜面经培养后于4°C下保藏。
[0133] 将获得的纯菌株分别接种于产絮凝剂培养基（葡萄糖20g、K2HP045g、KH 2P042g、 (NH4)2SO4O. 2g、NaClO. lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgSO4O. 2g、H2O 1000ml、ρΗ7· 5)中，在 40°C、150rpm下振荡培养72h，于8000rpm下离心IOmin得上清液，测定上清液对高岭土悬 浊液的絮凝活性；剩余上清液中加3-4倍体积的预冷乙醇，4°C下放置过夜，IOOOOrpm离心 IOmin得沉淀，用乙醇洗涤沉淀2次后真空干燥得絮凝剂粗品，称重，计算絮凝剂产量；筛选 产絮凝活性和絮凝剂产量高的菌株。对产絮凝活性和絮凝剂产量较原始菌株提高10%以上 的菌株进行10代传代培养，以检测其产絮凝活性和絮凝剂产量的稳定性。经筛选并传代试 验，获得1株产絮凝活性为93. 27%、絮凝剂产量达7. 025g · Γ1并稳定的菌株，较原始菌株 产絮凝活性提高13. 37%，絮凝剂产量提高19. 53%，编为Bacillus sp. WZY01。
[0134] Bacillus sp. WZYOl已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 9143,保藏起始日期为2014年05月12日。
[0135] 实施例3
[0136] 产絮凝剂培养基培养Bacillus sp. WZYOl产絮凝剂
[0137] 将保藏菌株Bacillus sp. WZYOl接种于装有100ml LB培养基的500ml锥形瓶中， 于40°C、160rpm下培养24h。然后按5%的体积比分别接种于装有IOOml产絮凝剂培养基 的500ml锥形瓶中，分别于30、351：、401：、451：和501：下培养7211，摇床转速均为160印111。 培养结束后将发酵液在SOOOrpm下离心IOmin后得上清液，测定上清液的絮凝活性。剩余 上清液中加3-4倍体积的预冷乙醇，4°C下放置过夜，IOOOOrpm离心IOmin得沉淀，用乙醇洗 涤沉淀2次后真空干燥得絮凝剂粗品，称重，计算絮凝剂产量，结果如表1所示。
[0138] 产絮凝剂培养基的组成：葡萄糖 20g、K2HP045g、KH2P042g、（NH 4)2SO4O. 2g、NaCl 0· lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgS040. 2g、H20 1000ml、pH7. 5。
[0139] 由表I看出，Bacillus sp. WZYOl在产絮凝剂培养基中产絮凝活性的适宜温度为 35-45°C，最适宜温度为40°C。
[0140] 表1不同温度下Bacillus sp. WZYOl产絮活性比较
[0141]
【权利要求】
1. 一株芽孢杆菌（Bacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC NO. 9143。
2. 如权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus sp.的用途，其特征在于，用于制备絮凝剂。
3. -种絮凝剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (a)将保藏编号为CGMCC NO. 9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养18-24h得到一 级种子液； 任选地（b)将步骤（a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18-24h得到二级种子 液； 以及（c)将步骤（a)得到的一级种子液或步骤（b)得到的二级种子液接种于发酵培养 基中培养得到所述絮凝剂。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中于35-45 °C、 150-180rpm的条件下培养；和/或 所述步骤（b)中于35-45°C、通气量5-10L/min、搅拌速度350-450rpm的条件下培养； 和/或 所述步骤（c)中于35-45°C的条件下培养。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基为废水培养基，pH为 7-9,包含以下组分： 豆制品废水和/或味精废水 500-800ml ? I71 ; 水 200-500ml ? I71， 其中，所述废水培养基包含制品废水和味精废水时，所述制品废水的含量为 250-500ml ? I/1 ;所述味精废水的含量为150-400ml ? L'
6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基或 废水培养基， 所述废水培养基的PH为7-9,包含以下组分： 豆制品废水和/或味精废水 500-800ml ? T1 ; 水 ZOO-SOOml*!/1, 其中，所述废水培养基包含制品废水和味精废水时，所述制品废水的含量为 250-500ml ? I/1 ;所述味精废水的含量为150-400ml ? L'
7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（c)中，在培养至对数期末期， 流加5-15g ? I71的葡萄糖；和/或 所述步骤（c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在15-95%。
8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出 所述絮凝剂的步骤。
9. 一种絮凝剂，其特征在于，采用权利要求3-9任一项所述的方法制备获得。
10. 如权利要求9所述的絮凝剂的用途，其特征在于，所述絮凝剂用于： (i) 制备改善浓缩污泥脱水性能的促进剂；或 (ii) 去除米氏凯伦藻；或 (iii) 去除塔马亚历山大藻。
【文档编号】C12P1/04GK104312943SQ201410494871
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】董新姣, 周茂洪, 葛世玫 申请人:温州大学