一种dna连接酶活性测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种DNA连接酶活性测定方法，所述方法包括以下步骤：首先根据单链DNA模板合成毗连的两段引物，其中按引物的5’至3’方向来说，5’方向的引物的3’端与3’方向的引物的5’相邻，并且5’方向的引物为正常引物，而3’方向的引物为3’末端被磷酸化的引物；然后将这两段引物与单链DNA模板退火，以形成的单链DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物为底物，在DNA连接酶存在下进行连接反应；随后以连接反应的产物为底物，在具有链置换活性的聚合酶作用下进行聚合反应，然后检测双链DNA或单链DNA的相对量，并以该相对量为基础推导出DNA连接酶的活性程度。本发明方法无放射性污染；操作简单快速；并且可以对DNA连接酶活性进行定量的检测分析。
【专利说明】一种DNA连接酶活性测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化【技术领域】，具体来说涉及一种DNA连接酶活性测定方法。
【背景技术】
[0002] DNA连接酶是1967年发现的，它可以封闭DNA链上的缺口，通过ATP或NAD水解提 供的能量催化DNA链的5' -磷酸末端和3' -羟基末端生成磷酸二酯键，使与同一条互补链 配对结合并紧邻(之间没有空隙）的两条寡核苷酸链相连。大肠杆菌DNA连接酶，来源于大 肠杆菌，是最早发现的DNA连接酶，可以用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌 体，它可以连接粘性末端和平末端，但是连接效率较低；热稳定的DNA连接酶，是从嗜热高 温放线菌菌株中分离纯化得到的，它是一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接 作用的核酸酶。
[0003] DNA连接酶是基因工程技术以及分子生物学研究中一种重要的工具酶，广泛应用 于分子克隆中重组DNA构建等领域。（周李华等，中国测试.2014March;40(2):64-66)。工 具酶的酶活力检测是工具酶产品质量控制的关键，研究和建立工具酶酶活力的测定方法是 工具酶产品标准化制定的一个重点，也是一个难点。另外有文献报道，临床研究发现连接 酶的活性水平与乳腺癌及恶性胶质瘤等肿瘤的发病机制密切相关，抑制连接酶的活性不仅 能降低肿瘤侵袭转移能力，还能显著提高肿瘤细胞的药敏性，因此，定量分析连接酶活性对 开展肿瘤的早期诊断和预后评估具有重要意义。（刘斌等，高等学校化学学报.2010March; 31 (3):463-467)。
[0004] 目前，对于DNA连接酶的测活普遍采用的是一种半定量的检测方法。将T4DNA连 接酶(或大肠杆菌DNA连接酶）做一系列的稀释倍数，将稀释后的酶加入到含有双链DNA片 段(经HindIII消化的λDNA片段)和IXDNA连接酶反应缓冲液的反应体系中，在一定温度 下反应一定时间。反应终止后，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过分析连接产物即大分子量 片段的量，来计算连接酶活性。这种方法实验成本较低，但是其最大的缺陷在于电泳图谱的 分析存在相当强的主观性。即使用图像扫描、灰度分析来判定连接产物的比例，仍然是一种 半定量的方法，因此不能精确测定DNA连接酶的活性，从而不能很好地保持批次之间的稳 定性。
[0005] 基于荧光技术发展的分子信标法及AP标记法虽然简单快速，但探针设计复杂，成 本高，检测过程中容易产生假阳性信号，无法满足人们研究的不同需求。（刘斌等，高等学校 化学学报· 2010March;31 (3) :463-467)。
【发明内容】
[0006] 本发明建立了一种简便、快速、非放射性且定量的DNA连接酶测活方法，其原理如 图1所示。
[0007] 具体来说，本发明采用的是如下技术方案： 一种DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先根据单链 DNA模板合成毗连的两段引物，其中按引物的5'至3'方向来说，5'方向的引物的3'端与 3'方向的引物的5'相邻，并且5'方向的引物为正常引物，而3'方向的引物为3'末端被 磷酸化的引物；然后将这两段引物与单链DNA模板退火，形成单链DNA模板/正常引物-3' 末端磷酸化引物复合物；接着以该单链DNA模板/正常引物-3'末端磷酸化引物复合物为 底物，在DNA连接酶存在下进行连接反应；随后以连接反应的产物为底物，在具有链置换活 性的聚合酶作用下进行聚合反应，聚合反应完成后检测双链DNA或单链DNA的相对量，并以 该相对量为基础推导出DNA连接酶的活性程度。
[0008] 优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且 双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA 特异性荧光染料。在一个实施例中，所采用的染料是业内常用的商购染料Picogreen染料。
[0009] 优选地，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板，聚合反应所形成的双链DNA 是在该单链环状DNA模板上形成互补链而形成的双链环状DNA。更优选，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA，以便于建立可以在业内通用并且更方便的标准的测定方法。 [0010] 所用的具有链置换活性的聚合酶可以采用多种来源的该类聚合酶，在一个实施方 案中，所采用的具有链置换活性的聚合酶是大肠杆菌聚合酶I。
[0011] 本发明的优点： 1. 操作步骤简单快速，重复性好，稳定性强； 2. 可以对DNA连接酶活性进行定量的检测分析，引物设计容易，便于操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的测定方法的原理图。
[0013] 图2是作为一个实例的T4DNA连接酶活性-荧光强度曲线图。
[0014] 图3是作为另一个实例的大肠杆菌DNA连接酶活性-荧光强度曲线图。
【具体实施方式】
[0015] 本发明的目的在于建立一种简便、快速、非放射性且定量的DNA连接酶测活方法， 其原理如图1所示。
[0016] 如图1所示，我们设计两个M13单链环状DNA的引物：一个为与之匹配的正常引 物，另一个为3'末端磷酸化修饰的引物(若引物3'末端发生磷酸化修饰，则它本身虽然能 以Ml3单链环状DNA匹配，但因为3 '-OH被封闭，不能发生聚合反应)，其中正常引物与3 ' 末端磷酸化引物是M13单链环状DNA上两个顺次的引物，正常引物的3'端与3'末端磷酸 化引物的5'端有一个缺刻(没有磷酸二酯键相连)。DNA连接酶可将正常引物的3'-OH末 端与3'末端磷酸化引物的5'-P末端连接起来，生成磷酸二酯键，使两条引物连成一条长的 3'末端磷酸化修饰的引物。大肠杆菌聚合酶I是一种有聚合活性和链置换活性的酶，当正 常引物与3'末端磷酸化引物未发生连接时，它可以M13单链环状DNA为模板，以正常引物 为引物，将3'末端磷酸化引物置换下来，发生聚合反应，生成M13双链DNA。M13双链DNA 可被双链特异性的picogreen染料结合，产生突光。而当正常引物与3'末端磷酸化引物连 接时，大肠杆菌聚合酶I不能以3'末端磷酸化修饰的引物为引物，进行聚合反应，由此不能 生成M13双链DNA，picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。
[0017]DNA连接酶的活性在一定范围内同生成的长的3'末端磷酸化修饰的引物的量成 正比；而在大肠杆菌DNA聚合酶I活性一定的情况下，生成的长的3'末端磷酸化修饰的引 物的量同荧光强度成反比。因此，本发明将DNA连接酶的测活体系同大肠杆菌DNA聚合酶 I的聚合反应体系偶联起来。
[0018] 本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速且可以定量的 DNA连接酶测活方法。
[0019] 下面将结合具体实施例更详细地说明本发明。
[0020] 实施例1. "转化法"测定T4DNA连接酶活性的可行性验证 M13模板/正常引物-3'末端磷酸化引物复合物的制备： M13 单链DNA:M13mpl8 单链DNA(NEB); 正常M13 引物：5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； 3'末端磷酸化M13引物：5' -tatcaaaaggagcaattaaagg-3'（3，末端轻基进行了磷酸 化修饰） M13模板/正常引物-3'末端磷酸化引物复合物：将M13mpl8单链DNA同正常M13引 物、3'末端磷酸化M13引物按摩尔比1:1:1混合，在退火缓冲液（10mMTris-HClpH8.0， 50mMNaCl)中，70°C加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
[0021]M13模板/3'末端磷酸化引物复合物的制备： M13 单链DNA:M13mpl8 单链DNA(NEB); 3'末端磷酸化M13引物：5' -tatcaaaaggagcaattaaagg-3'（3，末端轻基进行磷酸化 修饰） M13模板/3'末端磷酸化引物复合物：将M13mpl8单链DNA同3'末端磷酸化M13引物 按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10mMTris-HClpH8.0，50mMNaCl)中，70°C加热5 分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
[0022] 连接反应： T4DNA连接酶为NEBM0202
【权利要求】
1. 一种DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先根据单 链DNA模板合成毗连的两段引物，其中按引物的5'至3'方向来说，5'方向的引物的3'端 与3'方向的引物的5'相邻，并且5'方向的引物为正常引物，而3'方向的引物为3'末端被 磷酸化的引物；然后将这两段引物与单链DNA模板退火，形成单链DNA模板/正常引物-3' 末端磷酸化引物复合物；接着以该单链DNA模板/正常引物-3'末端磷酸化引物复合物为 底物，在DNA连接酶存在下进行连接反应；随后以连接反应的产物为底物，在具有链置换活 性的聚合酶作用下进行聚合反应，聚合反应完成后检测双链DNA或单链DNA的相对量，并以 该相对量为基础推导出DNA连接酶的活性程度。
2. 如权利要求1所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA或单链DNA 的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光 强度表不的。
3. 如权利要求2所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是 双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是 picogreen 染料。
5. 如权利要求1所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模 板是单链环状DNA模板，聚合反应所形成的双链DNA是在该单链环状DNA模板上形成互补 链而形成的双链环状DNA。
6. 如权利要求5所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模 板是Ml3噬菌体单链DNA。
7. 如权利要求1所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的具有链置换 活性的聚合酶是大肠杆菌聚合酶I。
【文档编号】C12Q1/48GK104278090SQ201410502851
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】徐晓昱, 王静 申请人:南京诺唯赞生物科技有限公司