一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌，及含有所述菌株的组合物，其中所述的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为：CGMCC6326。该菌株具有提高机体免疫力的能力，所述组合物为食品或药物组合物形式。本发明还公开了筛选测定乳酸菌菌株的方法，以及通过提高调节机体的脏器指数、非特异性免疫及特异性免疫反应来达到提高机体免疫力的方法。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药物，达到提高人体免疫力；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下患者的新选择。CGMCC 632620120710
【专利说明】一株具有増强免疫活性的植物乳杆菌
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株具有免疫调节活性的植物乳杆菌。
【背景技术】
[0002] 益生菌是指一类对宿主产生有益作用的活性微生物，通过定植于宿主肠道、生殖 系统内，能够对宿主产生确切的健康功效，从而改善宿主体内微生态平衡、发挥有益作用的 活性微生物的总称。乳酸菌作为益生菌中最具代表性的菌属，具有帮助消化、促进营养物质 的吸收、缓解乳糖不耐症、预防和治疗腹泻、调节肠道菌群和缓解便秘、调节机体免疫功能、 降低血液总的胆固醇、改善食物引起的过敏性疾病、延缓衰老及抗肿瘤等生理活性。
[0003] 随着年龄的增长、人们的生活与工作压力不断增大、饮食作息不合理、以及环境污 染等原因造成亚健康人群不断增加，而亚健康最明显的症状就是机体免疫力低下，从而易 引起其他疾病。大量体内外及临床实验表明乳酸菌具有调节机体免疫力的活性，市场上也 相继出现具有改善机体免疫力的乳酸菌产品，深受消费者的欢迎。然而，目前中国市场的 乳酸菌产品使用的菌株多为国外供应商提供的菌株，如丹麦科汉森公司的动物双歧杆菌 BB12、芬兰维利奥公司的鼠李糖乳杆菌LGG等，国内研发的具有自主知识产权的调节免疫 力的菌株少之又少，能够成功上市的菌株更是凤毛麟角。
[0004] 目前，国内外研宄比较多的有双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、 瑞士乳杆菌等菌株。然而，由于乳酸菌的益生活性具有菌株特异性，不同菌株之间的益生活 性差别较大。因此，需要更有针对性的筛选具有特殊生理活性的菌株，特别是我国有大量的 传统发酵食品，其中有大量的乳酸菌亟待研宄与开发。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌，以便解决中国市场上乳 酸菌产品使用的菌株的国产化问题。
[0006] 本发明提供的植物乳杆菌是从中国传统泡菜中分离得到的植物乳杆菌BC299， 该菌株具有提高机体免疫力的活性。该菌株由天津科技大学食品工程与生物技术学院 食品生物技术实验室分离并保藏，编号BC299 ;该菌株已于2012年7月10日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研宄所，菌种保藏编号为：CGMCC 6326,建议分类命名为：植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)〇
[0007] 本发明同时提供了一种组合物，该组合物是包含所述植物乳杆菌BC299菌株的生 理上可接受的赋形剂或稀释剂，可以是食品或药品。所述的植物乳杆菌BC299为活菌或死 菌或该菌株的衍生物。
[0008] 所述的食品可以是发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、发酵果蔬或其他含有该菌株或 该菌株衍生物的食品的任何一种。所述的药品是胶囊、粉剂、片剂或其他药学上可以接受的 赋形剂或稀释剂的任何一种。
[0009] 本发明所提供的组合物可以用于增强机体的免疫反应，为口服形式。具体包括：
[0010] 用于提高机体的免疫脏器指数、血液中白细胞数，促进脾淋巴细胞的转化，增强巨 噬细胞的吞噬活性、NK细胞的杀伤活性及DTH反应；
[0011] 或者，用于调节机体的IL-12或IFN-γ或IL-10或免疫球蛋白IgG的产生；
[0012] 或者，用于调节肠道菌群，抑制肠道大肠杆菌的增殖或促进肠道乳酸杆菌的增殖。
[0013] 此外，本发明还提供了利用植物乳杆菌BC299菌株制备用于调节机体免疫力的食 品或药品的方法。
[0014] 本发明所述食品或药品的用途可广义包括一种提高机体免疫力、改善肠道菌群的 方法，所述方法包括给予哺乳动物可达到提高免疫力效果剂量的该菌株的组合物。
[0015] 无须做进一步阐述，本发明所属领域技术人员根据上述说明即可利用本发明至最 广的程度。因此，以下说明仅作为示例说明，并非以任何方式限制其余的揭露内容。若本文 所述及的明确完整事物已在与本发明有关的相关技术中出现已知的同等物时，这些已知的 同等物将视为独立事项并入本文中。
[0016] 本发明的优点和有益效果：
[0017] 本发明提供了一株具有免疫调节及改善肠道菌群的植物乳杆菌BC299,该菌株可 以通过调节机体的非特异性免疫功和特异性免疫功能，从而达到提高机体免疫力的目的。 此外，植物乳杆菌BC299还可有效抑制肠道内大肠杆菌的增殖，促进乳酸杆菌的增殖，可有 效改善机体内肠道菌群的平衡。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药 物，达到提高人体免疫力；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下 患者的新选择。本发明菌株可以是食品或药品形式的组合物，并可为发酵食品提供特殊的 风味与口感。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1所不为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299在显微镜和扫描电镜下观察到的个 体形态。
[0019] 图2所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299体外促进BALB/c小鼠脾细胞增殖 的效果，RPMI-1640细胞培养基为空白对照组，脂多糖为阳性对照组。
[0020] 图3所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299体外促进鼠源巨噬细胞株RAW264. 7 增殖的效果，RPMI-1640细胞培养基为空白对照组，脂多糖为阳性对照组。
[0021] 图4所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对体重的影 响，生理盐水为空白对照组。
[0022] 图5所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其摄食量的 影响，生理盐水为空白对照组。
[0023] 图6所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其脾淋巴细 胞转化的影响，生理盐水为空白对照组，其中包括脂多糖（LPS)诱导B细胞转化和刀豆蛋白 A(ConA)诱导T细胞转化。
[0024] 图7所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其脾脏巨噬 细胞吞噬能力的影响，生理盐水为空白对照组，。
[0025] 图8所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其外周血T 淋巴细胞亚群的影响，生理盐水为空白对照组，。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术特点，图中显示的具体实施例是目 前最佳的，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。
[0027] 首先，本发明提供了一株分离自泡菜中、具有免疫调节活性的植物乳杆菌BC299， 该菌株由天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室分离并保藏，编号 BC299;于2012年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种 编号为：CGMCC 6326。
[0028] 实施例1 :菌株的分1?与培养
[0029] 采集中国传统泡菜，经研磨后，无菌生理盐水梯度稀释至适当浓度，采用平板涂布 法涂布于MRS平板培养基上，于37°C下静置厌氧培养36?72h，培养得乳杆菌疑似菌株的 各菌落。取该菌落涂布于MRS平板培养基上，于37°C下静置厌氧培养36?72h，挑取单菌 落做进一步纯化，依照以下实施例2进行菌株鉴定，获得分离菌株BC299。
[0030] 将分离菌株采用划线法接种于MRS平板培养基上，于37°C下厌氧培养36?72h， 挑取单菌落至0. 5?2mL新鲜无菌的MRS液体培养基中，于37±2°C下厌氧培养24?48h， 待菌株生长状况良好后，以1 %?4% (v/v)的接种量接种至5?8mL新鲜无菌的MRS液体 培养基中，于37±2°C下厌氧培养18?24h。重复此步骤直至菌株回复活力，培养所得菌液 供后续实验使用。
[0031] 实施例2:菌株鉴定
[0032] 2. 1、初步分析
[0033] 根据菌种鉴定的标准方法进行初步分析，结果表明本发明的分离菌株BC299为革 兰氏阳性、过氧化氢酶阴性杆菌（附图1)，无运动性，不产孢子，于有氧及厌氧条件下均能 生长。
[0034] 2. 2、16S rDNA 的 PCR 分析
[0035] 以菌株BC299的基因组DNA为模板，向PCR管中添加细菌通用引物（Pl序列为 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';P2 序列为：5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'），DNA 聚合酶、缓冲 液、dNTPs等试剂后，进行PCR扩增。
[0036] 各试剂添加量及扩增程序如下：
[0037] 各试剂添加量：DNA基因组（IOOng/ μ L) 1 μ L作为PCR反应模板，0. 5mmol/L引物 P1、P2 各 I yL，10XPCR buffer(含 Mg2+)2yL，dNTPs(2mmol/L)l yL，Taq DNA 聚合酶（5U/ μ L) 1 μ L，ddH20 13 μ L ;总体系 20 μ L0
[0038] 16S rDNA PCR反应程序：94°C，IOmin ;94°C，30s ;52°C，30s ;72°C，IlOs ;30循环后 72°C延伸IOmin。反应结束后，采用琼脂糖电泳分析PCR产物，对产物片段进行切胶回收。 纯化后的产物进行序列分析。测序结果与GeneBank中的标准株序列（http://www.ncbi. nlm. nih. gov/blast)进行同源性比较，并计算同源性百分比，选取相似度最高的菌种名称 作为初步鉴定结果。
[0039] 菌株BC299的16S rDNA PCR产物扩增片断的测序结果显示，该菌株的基因序列 与乳杆菌属的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)的同源相似性为99% (登录号： JX280493. I)〇
[0040] 2· 3 菌株 BC299 的 API 50CHL 系统鉴定
[0041] 挑取活化好的乳酸菌菌落，在API 50CHL培养基中制得相当于2McFarland浑浊度 的菌悬浮液，将此菌的悬浮液加入API 50CHL试剂条中，进行系统鉴定。阳性结果记为" + "， 阴性结果记为"一"，将结果输入系统测定软件中，通过归纳菌株测试结果确定其归属的种 类。
[0042] 表1菌株BC299的API鉴定分析结果
[0043]
【权利要求】
1. 一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌BC299 (Lactobacillus plantarum BC299)，保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 6326。
2. -种组合物，该组合物是含有权利要求1所述植物乳杆菌BC299的生理上可接受的 赋形剂或稀释剂。
3. 如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的植物乳杆菌BC299为活菌或死菌或 该菌株的衍生物，所述的生理上可接受的赋形剂或稀释剂为一种食品或药品。
4. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的食品是发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳 粉、发酵果蔬或其他含有该菌株或该菌株衍生物的食品的任何一种。
5. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的药品是胶囊、粉剂、片剂或其他药 学上可以接受的赋形剂或稀释剂的任何一种。
6. 如权利要求2至5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于增强机体的免 疫反应，为口服形式。
7. 如权利要求6所述的组合物，其特征在于所述组合物，用于提高机体的免疫脏器指 数、血液中白细胞数，促进脾淋巴细胞的转化，增强巨噬细胞的吞噬活性、NK细胞的杀伤活 性及DTH反应；或者，用于调节机体的IL-12或IFN-y或IL-10或免疫球蛋白IgG的产生； 或者，用于调节肠道菌群，抑制肠道大肠杆菌的增殖或促进肠道乳酸杆菌的增殖。
【文档编号】C12N1/20GK104480032SQ201410563725
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】王艳萍 申请人:天津科技大学