用于非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prx的类弹性蛋白多肽ELP的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prx的类弹性蛋白多肽ELP，属基因工程领域。本发明改变类弹性蛋白五肽单元中第四个氨基酸的种类提高其弹性功能，从而使减小ELP长度成为可能。使ELP五肽单元中第四个碱基含K、V和F的比例为1:6:3。内含肽方面，本发明采用高效内含肽gp41-1，该内含肽的C端和N端分开表达，并且对其内部基因进行了突变。所述的类弹性蛋白多肽ELP为ELP-IN和前体蛋白ELP-IC-PrxI。利用类弹性蛋白的弹性功能进行非色谱纯化蛋白PrxI，无需使用色谱柱分离，一定温度下孵育，目的蛋白就会沉淀，而且沉淀还可以重新溶解于缓冲溶液中，能使蛋白纯化更加高效快捷。
【专利说明】用于非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prx的类弹 性蛋白多肽ELP
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种类弹性蛋白多肽ELP，尤其涉及一种用于非酶切非色谱纯化方法 原核表达融合蛋白Prx的类弹性蛋白多肽ELP，属基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 非酶切非色谱纯化技术是一种用基因工程的方法分离纯化融合蛋白的方法。传统 的蛋白纯化依赖于色谱纯化，该方法所用仪器价格昂贵，使蛋白生产成本高；含有融合蛋白 的目的蛋白在纯化后需要工具酶（如肠激酶）切除标签，该酶生产成本高，特异性差。内含 肽介导的自切使得无需加入工具酶，蛋白在一定条件下诱导即可从前体蛋白上游离出来； 利用类弹性蛋白的弹性功能进行非色谱纯化蛋白，无需使用色谱柱分离，一定温度下孵育， 目的蛋白就会沉淀，而且沉淀还可以重新溶解于冰冷的缓冲溶液中，这使蛋白纯化更加高 效快捷、经济、操作简单。因此，类弹性蛋白多肽及内含肽的筛选对非酶切非色谱纯化技术 尤为重要。
[0003] 类弹性蛋白多肽ELP是一种人造基因工程蛋白质聚合物，它不仅具有弹性功能， 还对环境温度非常敏感。它的这些特殊性质使其在蛋白纯化与质粒DNA分离中应用广泛。 其分子量大小从4-60kDa不等。早在10多年前，人们就开始将ELP标签应用于蛋白的非 色谱纯化，30°C、一定盐浓度条件下，ELP会发生聚集，形成不溶的沉淀，将该沉淀通过离心 的方法分离出来。[ffuWYetal,Recombinantproteinpurificationbyself-cleaving aggregationtag.NatProtoc2006;1:2257-2262]。环境温度、蛋白浓度、盐的种类、或者 是ELP的长度会影响ELP这种多肽的沉淀。[FongBAetal,OptimizationofELP-intein mediatedproteinpurificationbysaltsubstitution.ProteinExprPurif2009 ； 66:198-202]。
[0004] 内含肽inteins，是internalprotein的缩写，最初是在1990年由Hirata等人 发现的，因其特点与内含子很像，故称其内含肽。[HirataRetal，Molecularstructure ofagene,VMA1,encodingthecatalyticsubunitofH(+)-translocatingadenosine triphosphatasefromvacuolarmembranesofSaccharomycescerevisiae.JBiol Chem. 1990 ;265:6726-C6733]。大量的基因组测序结果表明内含肽不仅存在于噬菌体和病 毒中，还广泛存在于古生菌、细菌和真核生物中。2009年末，inBase共收集了多达450种内 含肤。[PerlerFBInBase:theInteinDatabase.NuclAcidsRes. 2002;30:383-384]。 内含肽大致分两类，大内含肽和小内含肽，它们的区别在于大内含肽中含有归为内切酶结 构域，而小内含肽没有。自切效率较高的mini内含肽是将大内含肽中的内切酶结构域 去除后得到的，该区域对于蛋白的裂解没有影响。[ChongSetal，Proteinsplicing oftheSaccharomycescerevisiaeVMAinteinwithouttheendonucleasemotifs. JBiolChem. 1997 ；272:15587-155890DerbyshireVtetal,Geneticdefinitionofa protein-splicingdomain:functionalmini-inteinssupportstructurepredictions andamodelforinteinevolution.ProcNatlAcadSciUSA1997 ;94:11466-11471]〇 通常，细胞内首先形成一个前体蛋白，在其成熟过程中，内含肽会通过裂解反应从其C端断 开，然后从其N端断开，C端和N端的部分又称为外显肽，这两部分会通过分子内反应形成共 价键°[PerlerFBetal,Proteinsplicingelements:inteinsandexteins-adefinition oftermsandrecommendednomenclature.NuclAcidsRes. 1994 ;22:1125-1127]〇
[0005] 内含肽在生物【技术领域】是一种非常有价值的工具，利用内含肽的天然的裂解活性 连接蛋白或者多肽，称之为内含肽介导的蛋白剪接。内含肽还可以用于蛋白环化、毒性蛋 白的可控表达、非典型氨基酸的连接等，基础研究中还被用于监测体内蛋白之间的相互作 用。[ChongS,Harnessinginteinsforproteinpurificationandcharacterization. In:BelfortM,DerbyshireV,StoddardBL,WoodDff(eds)Homingendonucleasesand inteins,vol16.Springer,BerlinHeidelbergNewYork,pp2005 ;273_292:Ozawa Tetal,Inteinsforsplit-proteinreconstitutionsandtheirapplications. In:BelfortM,DerbyshireV,StoddardBL,WoodDff(eds)Homingendonucleasesand inteins,vol. 16.Springer,BerlinHeidelbergNewYork,pp. 2005 ;307_323]〇
[0006] 传统的蛋白亲和纯化标签在DNA水平上与目的蛋白基因相融合，但蛋白纯化后需 要通过特殊的内切蛋白酶将标签切除，而该过程中用到的工具酶价格昂贵，且工具酶特异 性较差，还会影响目的蛋白的活性。因此，内含肽介导的蛋白分离成为了替代以亲和标签为 基础的蛋白纯化技术的很好的工具。天然的内含肽是C端和N端都会发生裂解，工程用内 含肽则使剪接点处的保守残基发生突变，这就使得裂解只发生在内含肽和目的蛋白的连接 处。[ChongSetal,Single-columnpurificationoffreerecombinantproteinsusing aself-cleavableaffinitytagderivedfromaproteinsplicingelement.Gene. 1997 ； 192:271-281]。内含肽介导的蛋白纯化系统最先是由NewEnglandBiolabs公司开发为商 品，它们使用的是SeeVMA1 内含肤。[ChongSetal,Single-columnpurificationoffree recombinantproteinsusingaself-cleavableaffinitytagderivedfromaprotein splicingelement.Gene. 1997 ； 192:271-281]〇
[0007] 内含肽自我剪接功能与类弹性蛋白的弹性功能首次结合是在2006年。[WuWY etal,Recombinantproteinpurificationbyself-cleavingaggregationtag.Nat Protoc. 2006 ;l:2257-2262]。之后人们发现这种方法在小分子抗菌肽的生产中，不仅成 本低，而且非常方便。[ShenYetal,ExpressionandpurificationofmoricinCM4and humanbetadefensins4inEscherichiacoliusinganewtechnology.MicrobiolResin press. 2010]。由于ELP的弹性功能受到其肽链长度的影响，肽链越长所需盐浓度越小、温 度越低、蛋白浓度越小，同时所表达的蛋白摩尔数也会减少，目前所使用的ELP较长，蛋白 表达量较少。而目前使用的内含肽在表达过程中或在蛋白的提取过程中容易发生前体蛋白 的自切，造成损失，并且纯化后的蛋白自切需要较长时间（12h以上），从而较大程度上影响 目的蛋白的活性，而且这些内含肽大多依赖于DTT这类价格昂贵的强还原剂促发反应。在 非酶切非色谱纯化技术中需寻找突变的类弹性蛋白多肽ELP和内含肽。
[0008] Prx(peroxiredoxin)是一类新定义的抗氧化物，Prxl是该家族成员之一，对于 清除体内活性氧起着重要作用，Prx1属于2CysPrx，在H202作用下，其N端第51位半 胱氨酸（Cys51SH)被选择性地氧化为Cys51S0H，同时H202被还原为水而被清除。[KM H，etal.Roleofperoxiredoxinsinregulatingintracellularhydrogenperoxide andhydrogenperoxide-inducedapoptosisinthyroidcells.JBiolChem，2000,27 5 (24):18266-18270:Chuan-XuLiuetal，AdenanthintargetsperoxiredoxinIand IItoinducedifferentiationofleukemiccellsdifferentiationofleukemic cells. 2012 ;8(5) :486-93]。药物可以通过抑制PrxI活性而阻碍其对活性氧的清除，进而 诱导细胞凋亡。目前，Prxl现已成为筛选抗肿瘤药物的重要靶点，因此，原核表达Prxl，对 建立筛药平台，筛选抗肿瘤药物具有重要意义，目前未见原核表达PrxI的非酶切非色谱纯 化方法的相关报道。
【发明内容】
[0009] 针对ELP较长而影响蛋白的产量，本发明的目的在于提供一种肽链长度短，蛋白 表达量高的类弹性蛋白多肽ELP，实现原核表达PrxI的非酶切非色谱纯化。
[0010] 为实现本发明目的，本发明改变类弹性蛋白五肽单元中第四个氨基酸的种类提高 其弹性功能，从而使减小ELP长度成为可能。使ELP五肽单元中第四个碱基含K、V和F的 比例为1:6:3,增加疏水性氨基酸缬氨酸的比例。内含肽方面，本发明采用了非常高效的一 种内含肽gp41_l，该内含肽的C端和N端分开表达，并且对其内部基因进行了突变，在不影 响其剪接活性的前体条件下增加表达量。
[0011] 具体技术方案如下：所述的类弹性蛋白多肽ELP为ELP-IN或前体蛋白 ELP-IC-PrxI，ELP-IN是类弹性蛋白与N端内含肽的组合，ELP-IC是类弹性蛋白与C端内含 肽的组合。
[0012] ￡1^-預的0嫩序列为5￡〇10勵:3，氨基酸序列为5￡〇10勵:4。
[0013] ELP-IC的DNA序列为SEQIDN0:1，氨基酸序列为SEQIDN0:2。
[0014] 由以上所述的类弹性蛋白多肽ELP组成一对融合蛋白，分别含有SEQIDNO: 2和 SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列。
[0015] 所述N端内含肽DNA序列为SEQIDNO: 5。所述C端内含肽DNA序列为SEQID N0:6。
[0016] 含有本发明上述一对融合蛋白DNA分子的载体为pET30a-ELP-IC-PrxI和 pET28a-ELP-IN。
[0017] 含有本发明上述两种载体的宿主细胞为大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3) /ELP-IN和 BL21(DE3)/ELP-IC-PrxI。
[0018] 上述一对融合蛋白可用于蛋白的非色谱纯化。包括以下步骤：将本发明所述的一 对融合蛋白按一定比例（1:1质量比）混合，加反应液RB(ReactionBuffer),适宜条件下诱 导自切，然后分离自切下的目的蛋白Prxl。
[0019] 本发明创新点在于：改变类弹性蛋白ELP五肽单元中第四个氨基酸的种类，提高 了其弹性功能，从而使ELP长度减小成为可能。使ELP五肽单元中第四个碱基含K、V和F 的比例为1:6:3,增加了疏水性氨基酸缬氨酸的比例。另外，本发明采用了非常高效的一种 内含肽gp41_l，该内含肽的C端和N端分开表达，内含肽介导的自切使得无需加入工具酶， 蛋白在一定条件下诱导即可使目标蛋白从前体蛋白上游离出来，既减小了因自切时间过长 对目的蛋白活性造成的影响，又避免了蛋白在表达和提取过程中发生剪接。利用类弹性蛋 白的弹性功能进行非色谱纯化PrxI蛋白，无需使用色谱柱分离，一定温度下孵育，目的蛋 白就会沉淀，而且沉淀还可以重新溶解于冰冷的缓冲溶液中，这使蛋白纯化更加高效快捷、 经济、操作简单，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是本发明制备方法的流程示意图。
[0021] 图2是表达载体的电泳图。其中各泳道如下：M. 100bpDNALadder标准品； 1.pET28b-ELP-IN质粒；2.pET28b-ELP-IN质粒NcoI单酶切；3.pET28b-ELP-IN质粒 Hindlll单酶切；4.pET28b-ELP-IN质粒NcoI/Hindlll双酶切；5.pET30a-ELP-IC-PrxI质 粒；6.pET30a-ELP-IC-PrxI质粒HindIII单酶切；7.pET30a-ELP-IC-PrxI质粒Ndel单酶 切；8.pET30a-ELP-IC_PrxI质粒Ndel/Hindlll双酶切；9.pGEMT_easy_PrxI质粒Hindlll/ BamHI双酶切。
[0022] 图3是ELP-IN和ELP-IC-PrxI两种融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳图。其 中各泳道如下：1.标准分子量蛋白；2.诱导组；3.对照组。
[0023] 图4是使用ITC的方法纯化启动蛋白ELP-IN后的SDS-PAGE电泳图。其中各泳道 如下：1.总蛋白；2.第一循环离心后上清；3.第一循重新溶解的蛋白；4.第二循环离心后 上清；5.第二循重新溶解的蛋白；M.标准分子量蛋白。
[0024] 图5是不同盐浓度下，利用ITC方法纯化蛋白，所获得的蛋白产率。横坐标为 (NH4)2S04浓度，纵坐标为蛋白产率（产率=纯化后所得目的蛋白量/总蛋白中目的蛋白量）
[0025] 图6是利用ITC的方法一步纯化启动蛋白与前体蛋白共同沉淀，并用不同的溶剂 重新溶解。PBS溶解：a.沉淀后不溶物；b.离心后上清；c.低盐溶液溶解重新溶解的蛋白。 d.沉淀后不溶物；e.离心后上清；f.重新溶解的蛋白；g.标准分子量蛋白。
[0026] 图7是纯化后的蛋白按照1:1的摩尔比例混合，自切百分率在不同温度条件下随 时长增加而变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为自切百分率。
[0027] 图8是最适条件下内含肽自切百分率随时长增加而变化的曲线。横坐标为时间， 纵坐标为自切百分率。
[0028] 图9为蛋白自切后经可逆相变循环纯化，获得目的蛋白PrxI和ELP-IN与ELP-IC 的混合物。其中各泳道如下：M.标准分子量蛋白；1-3.PrxI;4, 5.ELP-IN与ELP-IC的混 合物。
[0029] 图10是PrxI活性检测曲线。
【具体实施方式】
[0030] 为对本发明进行更好地说明，结合附图，详细说明如下：
[0031] 定义：
[0032] 如本文所用，术语'C端内含肽'是指在原内含肽gp41_l中靠近C端的内含肽， 该种内含肽的N端被突变而丧失了这种功能。与其像类似，'N端内含肽'是指在原内含肽 gp41_l中靠近N端的内含肽片段。
[0033] 如本文所用，术语'可逆相变循环'缩写为ITC，是指在特定条件下蛋白由可溶性物 质变为不溶性固体，特定条件下还可以再次溶解。
[0034] 在本发明中，术语'自切'和'自我剪接'都是指内含肽分子内酯交换元件发生的 分子内的共价键的断裂与结合。
[0035] 如本文所用，术语'前体蛋白'是指目的蛋白的蛋白前体（ELP-IC-Prx I)，该蛋白 发生剪接后获得目的蛋白Prx I。
[0036] 在本发明中，术语'启动蛋白'是用于与前体蛋白结合后使蛋白具备完整的内含肽 分子内酯交换元件，而前体蛋白在此之前不会发生自切。
[0037] 实施例1
[0038] 结合附图1说明制备方法。
[0039] 1、启动蛋白、前体蛋白表达载体和宿主细胞的构建
[0040] (a) ELP-IN、ELP-IC以及Prxl基因的合成
[0041] 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物，通过PCR的方法获得ELP-IN和 ELP-IC的DNA(SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3)。引物序列如下：
[0042] ELP-IN：
[0043] 5,弓丨物：
[0044] 5, GGCCATGGCCGTGCCTGGTAAAGGAGTTCC3' (Nco I )
[0045] 3,弓丨物：
[0046] 5 ' GCGCAAGCTTATTCTTTCACATACAGGCACATGCC3'(Hind III)
[0047] ELP-IC：
[0048] 5,弓丨物：
[0049] 5' CCCATATGGTGCCTGGTAAAGGAG3'(Ndel)
[0050] 3,弓丨物：
[0051] 5, TTAAGGATCCGCTGTTATGGGTCAGAATATCGTT3, （BamH I )
[0052] 另外设计合成两条引物用于PCR克隆Prx I的cDNA。引物序列如下：
[0053] 5,弓丨物：
[0054] 5? CGGGATCCATGTCTTCAGGAAATGCTAAAATTGG3'(Hind III)
[0055] 3,弓丨物：
[0056] 5' CCCAAGCTTTCACTTCTGCTTGGAGAAATAT3' (BamH I )
[0057] 5'引物包含PrxlN端基因序列并引入酶切位点BamH I ;3'引物含Prx I C 端基因序列、酶切位点Hind III和终止密码子。用上述引物以实验室现有的Prxl表达载 体为模板进行PCR，获得Prxl全基因序列。然后用promega公司的克隆试剂盒将Prxl、 ELP-IN和ELP-IC PCR产物克隆到pGEMT-easy载体上，转化得到的pGEMT-easy-ELP-IN、 pGEMT_easy-ELP-IC、pGEMT_easy-PrxI重组载体至E. coli DH5a中进行测序。测序结果 表明，克隆得到的三个基因片段与它们的序列一致。
[0058] (b)表达载体pET28b-ELP-IN、pET30a-ELP-IC-PrxI的制备pGEMT-easy-ELP-IN 载体、pGEMT-easy-ELP-IC载体、pGEMT-easy-PrxI载体分别经过Nco I和Hind III、Nde I 和8已111^111111和胞(1111酶切。酶切后的￡1^-預克隆到经过相同酶切的口￡丁2813(+)载体 (购自invitrogen公司）中，然后转化至E.coli DH5a ;酶切后的ELP-IC和Prxl则克隆到 经过相同酶切的pET30a(+)载体（购自invitrogen公司）中，然后转化至E.coli DH5a。 酶切鉴定图谱见图2。
[0059] (c)大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3) /ELP-IN和BL21 (DE3) /ELP-IC-Prxl的构建
[0060] 用化学转化的方法分别将表达载体pET28b-ELP-IN和pET30a-ELP-IC-PrxI转 化至E.coliBL21(DE3)中，筛选阳性克隆，得到分别表达ELP-IN和ELP-IC-Prxl融合蛋白 的工程菌，即大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3)/ELP-IN和BL21 (DE3)/ELP-IC-Prxl。
[0061] 2、ELP-IN和ELP-IC-Prxl的表达
[0062] 分别从转化平板上挑取阳性的大肠杆菌BL21 (DE3) /ELP-IN和BL21 (DE3) / ELP-IC-Prxl于试管中，加入含终浓度为100iig/mlKana的LB培养基，37°C、200rpm条件下 培养至对数生长期（〇D值为0. 6-0. 9)。然后，加IPTG之终浓度ImM诱导表达10h。8000rpm 离心3min收集菌体，加PBS后将菌体吹匀，再次离心后加入等量PBS重悬，超声破碎菌体， 8000rpm离心15min。取上清蛋白加LB(LoadingBuffer)于10CTC水浴中变性lOmin后上 SDS-PAGE电泳（积层胶5%，分离胶12% )，染色、脱色、扫描分析。
[0063] 由BioXM2. 6预测蛋白ELP-IN理论分子量为19. 4KD，ELP-IC-Prxl理论分子量为 36. 3KD。SDS-PAGE电泳结果表明：在15KD和25KD以及35KD和45KD之间有明显的诱导表 达条带，分子量大小与预期相符，融合蛋白表达量占菌体总蛋白50%左右，表达为可溶性蛋 白（图3)。
[0064] 3、两种蛋白的分离纯化
[0065] (a)启动蛋白的分离纯化
[0066] 工程菌在发酵后收集菌体，冰浴条件下超声波处理菌体悬浮液，处理后的菌液在 8000rmp、4°C条件下离心15min，蛋白ELP-IN主要在上清中。
[0067] 进行可逆相变循环纯化蛋白：向上述获得的上清蛋白中加入（NH4)2S04至终浓 度为0. 2M，室温孵育10min后，离心6min。弃上清后加入冰冷的PBS(300mMNaCl，100mM NaH2P04)，将沉淀吹匀，离心6min，上清中为目的蛋白。如所得蛋白纯度较低，可在此加 入（册14)250 4进行第二个循环的纯化，直至达到理想的纯度。去除杂蛋白后所得目的蛋白 ELP-IN大小与理论值一致，纯度高达95%以上（图4)。
[0068] (b) (NH4)2S04浓度对蛋白纯化产率的影响
[0069] 设定浓度梯度，加入蛋白溶液中（NH4)2S04至终浓度为0. 025M、0. 05M、0. 1M、0. 2M 和0. 4M，将重新溶解的蛋白上SDS-PAGE电泳，染色、脱色、扫描分析。结果表明：(NH4)2S04 终浓度为〇. 2M时，获得最大产率（图5)。
[0070] (c)前体蛋白ELP-IC-Prxl的纯化
[0071] 前体蛋白提取方法同启动蛋白，但是加入（见14)250 4至0. 2M时不能发生沉淀，且加 入过高浓度时蛋白会发生变性。因此使用ITC的方法不能单独纯化该蛋白，而共沉淀这一 方法很好的解决了这一问题。取一定量的含启动蛋白的蛋白提取液于EP管中，加（NH4)2S04 至终浓度为〇. 2M，室温孵育10min后加入含前体蛋白的蛋白提取液，再加入（NH4)2S04至终 浓度为〇. 2M，室温孵育10min。然后完成ITC剩余部分。重新溶解的蛋白上SDS-PAGE电泳， 染色、脱色、扫描分析。结果表明：利用共沉淀的方法可以获得较高纯度的两种蛋白的混合 液（图6)。
[0072] 实施例2目的蛋白间接条件的摸索
[0073] (a)不同温度条件下孵育4h
[0074] 纯化后的蛋白按照1:1的比例在不同温度（4°C、10°C、15°C、20°C、25°C)下孵育不 同时长（10min、20min、30min、lh、2h、4h)后，SDS-PAGE电泳检测，绘制不同温度条件下自切 百分比与时间的关系曲线（图7)。25°C时蛋白自切较为完全，为减小温度过高对目的蛋白 活性的影响，暂时使用25°C诱导自切。
[0075] 3〇pL反应体系：7.5PLH20 7, 5PL 4XReactionbuffer 7, 5PLELP-L'- ?. 5PLKIP-1C-Prx1
[0076] lXReactionbuffer： (50mMTris,lOOmMNaCl, 5%Glycerol)
[0077] (b)25°C水浴诱导蛋白剪接
[0078]启动蛋白与前体蛋白按1:1比例混合,25°C条件下诱导自切不同时长（lmin, 5min，10min，0. 5h，lh)。SDS-PAGE电泳检测，0. 5h时蛋白自切完全，前体蛋白已几乎消失， 绘制自切百分比与时间的关系（图8)。
[0079] 实施例3目的蛋白的纯化及活性检测 [0080] (a)目的蛋白的纯化
[0081] 纯化后的蛋白按照实施例2体系在最适温度25°C条件下诱导前体蛋白自切0. 5h， 然后用ITC的方法纯化获得目的蛋白Prxl(图9)。
[0082] (b)PrxI的活性检测
[0083] 参照 文献AdenanthintargetsperoxiredoxinIandIItoinduce differentiationofleukemiccells中提到的PrxI活性检测方法测定上述制备的 PrxI活性。用BioTekSynergy2多功能酶标仪（MolecularDevices,USA)检测不同时间 点的A340值，绘制A340值随时间变化的曲线（图10)。
[0084] 结果：样品的活性与标准品的活性相当，整个纯化过程未对蛋白活性造成影响。这 表明，本发明方法可以用于蛋白产品的生产。
【权利要求】
1. 用于非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prx的类弹性蛋白多肽ELP，其特征 在于， 所述的类弹性蛋白多肽ELP为ELP-IN或前体蛋白ELP-IC-PrxI，ELP-IN是类弹性蛋 白与N端内含肽的组合，ELP-IC是类弹性蛋白与C端内含肽的组合； ELP-IN的DNA序列为SEQ ID NO: 3,氨基酸序列为SEQ ID NO: 4 ; ELP-IC的DNA序列为SEQ ID NO: 1，氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。
2. 与如权利要求1所述的类弹性蛋白多肽ELP组合的内含肽，其特征在于，所述内含肽 N端DNA序列为SEQ ID NO: 5,所述内含肽C端DNA序列为SEQ ID N0:6。
3. 如权利要求1所述的类弹性蛋白多肽ELP组成的一对融合蛋白，其特征在于，分别含 有SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列。
4. 如权利要求3所述的类弹性蛋白多肽ELP组成的一对融合蛋白DNA分子载体，其特 征在于,分子的载体为 pET30a-ELP-IC-PrxI 和 pET28a-ELP-IN。
5. 如权利要求4所述的类弹性蛋白多肽ELP组成的一对融合蛋白DNA分子载体的 宿主细胞，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3) /ELP-IN和BL21 (DE3) / ELP-IC-PrxI〇
6. 如权利要求1所述的类弹性蛋白多肽在原核表达融合蛋白Prx中应用，其特征在于， 采用非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prxl，步骤如下： 纯化后的蛋白ELP-IN和ELP-IC-PrxI按照质量比1:1在如下体系中25°C孵育4h， 25°C条件下诱导自切0. 5h，然后用ITC的方法纯化获得目的蛋白Prxl ; 30ii L 反应体系：7. L H20 7. 5 u L 4XReaction buffer 7. 5u L ELP-IN 7. 5u L ELP-IC-Prx I lXReaction buffer :50mM Tris，100mM NaCl，5% Glycerol。
【文档编号】C12N15/63GK104387473SQ201410583428
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】刘宏民, 张贵星, 王西新, 章旭耀, 王龙珍, 王志茹, 袁君, 郑一超, 赵文, 郑甲信 申请人:郑州大学