一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物【技术领域】。本发明通过pH指示剂结合高通量筛选，能够从大量菌株中筛选获得有机酸产量相对较高的菌株，简化了整个筛选过程和提高了筛选效率。本发明还将pH指示剂结合的高通量筛选与常规育种方法相结合，获得了一株α-酮戊二酸的高产菌株，相较于原始菌，该菌株的产量在摇瓶上提高了51.8％，在3L发酵罐上提高了45.4％。
【专利说明】一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] α-酮戊二酸（a-KG)是三羧酸循环中一个关键的中间代谢产物，是氨基酸和蛋 白质代谢过程中主要的前提物质，广泛应用于食品、医药、农业和化妆品等领域。但低生 产效率这一缺陷严重地限制了发酵法生产α-酮戊二酸在工业上的发展和应用，因此，对 α-酮戊二酸高产菌株的筛选迫在眉睫。
[0003]目前，有机酸的检测一般使用气相色谱法或者HPLC法，用此方法来筛选菌株存在 繁琐、效率低等缺点。还没有关于高通量筛选α-酮戊二酸高产菌株方面的相关报道。
[0004] 本发明通过利用有机酸生产过程中pH变化这一特性，结合pH指示剂和高通量技 术建立了高效、快速筛选有机酸高产菌株的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，是先将待筛选菌株于含有变 色范围包含了pH2. 6?5. 2中的任一pH值的pH指示剂的培养基中进行初筛，选取变色圈 较大的菌株于高通量孔板中发酵后，再加入变色范围包含了pH1. 4?3. 2中的任一pH值 的PH指示剂进行复筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。
[0006] 所述方法，是先用含有溴甲酚绿或百里酚蓝或刚果红的培养基对待筛选菌株进行 初筛，挑选变色圈较大的菌落，于高通量孔板中发酵后，取发酵液上清，加入喹哪啶红或橙 黄IVpH指示剂，进行复筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。
[0007] 所述有机酸可以是以下任意一种：柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、 α-酮戊二酸、苯丙酮酸、a_酮异己酸、延胡索酸、脂肪酸、草酰乙酸。
[0008] 所述有机酸在本发明的一种实施方式中是α-酮戊二酸。
[0009]所述溴甲酚绿或百里酚蓝或刚果红，在培养基中的添加量为常规添加量。
[0010]所述溴甲酚绿指示剂的配制方法：溴甲酚绿〇.lg，加0.05mol/L氢氧化钠溶液 2. 8ml使溶解，再加水稀释至200ml，变色范围pH3. 6?5. 2。
[0011] 所述溴甲酚绿，在本发明的一种实施方式中，是直接在培养基中加入终浓度在 0. 2-0. 5g/L的固体溴甲酚绿。在高产有机酸菌株的培养基中，溴甲酚绿变色明显，而且对细 胞没有毒害作用。
[0012] 所述初筛，可以是将菌株点种、涂布或者划线在平板上。
[0013]所述高通量孔板可以是96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等 任意一种具有高通量筛选作用的培养器皿。
[0014] 所述喹哪啶红pH指示剂的配制方法：取喹哪啶红0. lg，加甲醇IOOml使溶解，即 得。变色范围pHl. 4?3. 2 (无色一红）。
[0015] 所述加入喹哪啶红pH指示剂的量，为上清体积1/25至1/100。
[0016] 所述加入橙黄IVpH指示剂的量,为上清体积1/50至1/200。
[0017] 所述加入喹哪啶红或橙黄IVpH指示剂后，反应5 - 60min。
[0018] 所述加入喹哪啶红pH指示剂的量，在本发明的一种实施方式中，为上清体积的 1/50。
[0019] 所述加入橙黄IVPH指示剂的量，在本发明的一种实施方式中，为上清体积的 1/200。
[0020] 所述上清，在本发明的一种实施方式中，是将发酵液离心后获得的。
[0021] 所述复筛，在本发明的一种实施方式，还可以是加入喹哪啶红pH指示剂后，测定 OD52tl，数值相对较小的即为复筛得到的菌株。
[0022] 所述复筛，在本发明的一种实施方式，还可以是加入橙黄IVpH指示剂后，测定 OD52tl，数值相对较大的即为复筛得到的菌株。
[0023] 本发明还提供一种利用所述高通量筛选方法来筛选α-酮戊二酸高产菌株的方 法，是先将待筛选菌株于含有溴甲酚绿的培养基中进行初筛，挑取变色圈较大的菌落，再于 高通量孔板中发酵后，取发酵液上清，加入喹哪啶红pH指示剂，选取变色较大的菌株为复 筛得到的菌株，对复筛得到菌株进行发酵验证，即得到α-酮戊二酸相对高产菌株。
[0024] 所述菌株是任意一种：能生产有机酸的菌株。
[0025] 所述高产菌株，在本发明的一种实施方式中，是在发酵过程中能使发酵液的pH能 够达到3. 6以下的菌株。
[0026] 所述菌株，在本发明的一种实施方式中，是解脂亚洛酵母Yarrowialipolytica。
[0027] 所述菌株，在本发明的一种实施方式中，是YarrowialipolyticaCCTCCNO: M207143及其经ARTP诱变后得到的菌株。
[0028] 所述复筛，在本发明的一种实施方式，还可以是加入喹哪啶红pH指示剂后，测定 OD52tl，数值相对较小的即为复筛得到的菌株。
[0029] 所述加入喹哪啶红pH指示剂的体积为上清体积的1/50,上清中α-酮戊二酸 的量为〇. 6g/L-4. 8g/L时，反应30min后，OD52tl与α-酮戊二酸量存在线性方程：Y= 0.02842Χ+0. 2039。
[0030] 所述复筛，本领域技术人员，可以通过调整发酵时间、稀释或者浓缩发酵液等方 法，使上清中α-酮戊二酸的量在某一合适范围，以适于用喹哪啶红PH指示剂进行筛选。
[0031] 所述α-酮戊二酸高产菌株的筛选方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将 多株Yarrowialipolytica于含有溴甲酚绿指示剂的培养基中进行培养，选取变色圈相对 较大的菌株为初筛得到的菌株，再于高通量孔板中进行发酵，发酵液离心后，取上清加入体 积为上清1/50的喹哪啶红pH指示剂反应30min，测定OD52tl，选取OD52tl相对较小的菌株作为 复筛得到的菌株，再于发酵培养基中培养后进行验证。
[0032] 所述高通量深孔板中进行发酵，在本发明的一种实施方式中，是指在发酵培养基， 于 28°C，900rpm下，发酵 96h。
[0033] 所述验证，是指采用高效液相色谱测定菌株发酵后α-酮戊二酸产量，以确定复 筛菌株是相对高产菌株。
[0034]本发明建立了一种新型筛选方法，结合了pH指示剂的高通量筛选的方法，极大 地简化了整个筛选过程。本发明方法能够快速地从大量菌株中筛选获得高产有机酸的菌 株。本发明还可以与其他育种方法（比如说诱变育种、代谢育种技术、代谢工程改造等）结 合起来，从大量菌株中筛选目标菌株。此外，本发明还结合了恒温常压等离子体诱变技术 (ARTP)、pH指示剂和高通量筛选技术，提高α-酮戊二酸的产量和降低副产物丙酮酸的产 量，本发明经过多批次的诱变再筛选，得到了一株α-酮戊二酸的高产菌株，同时相应地降 低了发酵副产物丙酮酸的产量和提高整个发酵过程的生产效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图I:0D520与有机酸产量的线性关系；A为喹哪啶红1/25 ;Β为喹哪啶红1/50;C 为喹哪啶红1/100 ;D为橙黄IV1/50 ;E为橙黄IV1/100 ;F为橙黄IV1/200。
【具体实施方式】
[0036] 本发明的待筛选菌株，可以是分离自自然界的初筛产物，也可以是人工诱变或者 改造的产物。本发明同样适用于从有机酸产值水平已经较高或偏低的菌株中快速筛选有机 酸产量相对较高的菌株，因为首先高通量孔板中有机酸的产量较低，不会达到摇瓶或发酵 罐中一样的高产值，另外，为获取目标产物为目的的孔板培养技术是本领域所熟知的，根据 感兴趣的目标菌种，相关的种子培养基、发酵培养基、培养条件和时间等均可以参照现有技 术中的相关指导，予以采纳或调整与改进，这些调整与改进都属于本领域技术人员的常规 技能，比如说本领域技术人员可以根据菌种特性，通过调整发酵时间、稀释或者浓缩发酵液 等方法，使有机酸含量积累在某一合适范围，以适合本筛选方法进行筛选。本发明方法适用 于各种产有机酸的菌株，尤其是产α-酮戊二酸的菌株。
[0037] 细胞干重的测定：
[0038] 吸取一定量的菌悬液于IOmL容量瓶中，加入2mL盐酸溶解悬液中的碳酸钙，加去 离子水定容到10mL，摇匀，用UV7500型可见光分光光度计，于570nm处测定OD值，用细胞 干重标准曲线得出细胞干重。
[0039] α-酮戊二酸、丙酮酸和甘油的测定：高效液相色谱（HPLC)
[0040] 仪器：Agilent1260高效液相色谱仪（配紫外可见检测器、示差折光检测器和工 作站），色谱条件：
[0041] 色谱柱：AminexHPX-87Hionexchangecolumn
[0042] 流动相：5mMH2SO4
[0043] 流速：0· 5mL/min
[0044] 柱温：40。。
[0045] 进样量：10μL
[0046] 紫外检测器波长：210nm(检测α-酮戊二酸和丙酮酸）
[0047] 示差折光检测器：检测甘油
[0048] 样品制备：ImL发酵液在12,OOOrpm下离心5min，取上清液放入I. 5mL离心管中测 α-酮戊二酸、丙酮酸和甘油的含量。取100μL上清液于5mL容量瓶中，超纯水定容到刻度 线，经0. 22μL滤膜过滤，滤液供高效液相色谱分析。
[0049] 致死率的计算：
[0050] 致死率=?X100% A
[0051] 其中A表示空白对照平板上的菌落形成单位个数，S表示经过诱变处理后平板上 的菌落形成单位个数。
[0052] 所需培养基：
[0053] 种子培养基（g/L)
[0054] 葡萄糖20g，大豆蛋白10g，磷酸二氢钾l.Og，七水硫酸镁0.5g，固体培养基添加 20g琼脂。115°C灭菌 15min。
[0055] 初筛培养基（g/L)
[0056] 葡萄糖20g，大豆蛋白IOg,磷酸二氢钾I. 0g，七水硫酸镁0. 5g，溴甲酚绿0. 5g，卡 那霉素l.Og，琼脂20g。115°C灭菌15min。
[0057] 发酵培养基（即复筛和验证培养基）（g/L)
[0058] 甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁I. 2g，氯化钠0. 5g，磷酸氢二钾 〇.lg，盐酸硫胺6Xl(T7g(过滤除菌），碳酸I1^lOg(单独灭菌）。115°C灭菌15min。验证培 养基中加入l〇g/L碳酸钙。
[0059] 实施例I :ARTP诱变
[0060] 将保藏在甘油管中的YarrowialipolyticaCCTCCNO:M207143菌种涂布在茄形 瓶斜面上活化24h后，挑取一环菌体接入种子培养基中（500mL摇瓶装50mL)，200r/min、 28°C培养17-18h，取ImL菌悬液于I. 5mL无菌离心管中，4500r离心10min，生理盐水洗涤2 次后，再用生理盐水适量稀释制成菌体浓度在IO6?IO7之间的菌悬液，将稀释的菌悬液均 匀涂布于无菌的载片表面，将载片置于载台上，用ARTP诱变育种系统处理，在入射功率为 100W、氦气流量为10SLM条件下，分别照射1〇8、2〇8、3〇8、4〇8、5〇8、6〇8、9〇8、12〇8，样品处理 完毕，用无菌镊子将载片放至装有Iml生理盐水的EP管中，振荡lmin，把附着在菌物载片 上的微生物洗脱到液体中，形成新的菌悬液，对照组中直接取IOul菌液至Iml生理盐水中。 将所有的新的菌悬液稀释至10' 10'KT3三个梯度，分别取100μLKT1、10'KT3梯度的菌 悬液涂布固体平板上，每组做3组平行。28°C恒温培养箱中培养24h后，计数每块平板上的 菌落形成单位个数，再分别计算出每个处理时间的致死率，进而得到在入射功率为100W，氦 气流量为10SLM条件下的致死曲线，Laroussi等早期的研究表明致死率在90%以上的突变 效果最好，因此，30s作为最佳的诱变处理时间。
[0061] 实施例2:显色剂的选择
[0062] 根据α-酮戊二酸发酵过程中pH值的变化特点，选取了亮绿、喹哪啶红、橙黄IV、 孔雀绿、百里酚蓝、刚果红、溴甲酚绿7种显色剂作为预选显色剂，又有48深孔板中的预实 验测出α-酮戊二酸和丙酮酸的产量均在2g/L以下，因此以发酵培养基为溶解液，加入 〇-酮戊二酸的量0.68/1-4.88/1的梯度浓度，溶解在20(^1^发酵培养基中，在加入梯度比 例的显色剂（1/400,1/200,1/100,1/50,1/25)，常温反应30min，在各种显色剂的最大可见 光吸收值时测定吸光值0D。结果表明溴甲酚绿指示剂在低的酸浓度下就有明显的变色反 应，且不存在杀菌和抑菌作用，可作为初筛平板上的显色剂；喹哪啶红加入比例为1/50时 存在很好的线性关系，OD52tl与α-酮戊二酸量存在的线性方程为：Y= -〇. 0306X+0. 214,喹 哪啶红作为复筛显色剂。
[0063] 实施例3:高产α-酮戊二酸菌株的筛选
[0064] 将ARTP诱变处理30s后的菌悬液稀释成KT1、10_2两个浓度梯度，分别吸取100μL 均匀涂布在预筛平板上，在200r/min、28°C恒温培养箱中培养48h，挑取菌落形态大变色圈 大的菌落转移到96深孔板中的种子培养基中，900r/min，28°C高通量深孔板恒温振荡器中 培养48h，以10 %的接种量转接到48深孔板中（装ImL发酵培养基（接种后体积）），900r/ min，28°C发酵培养96h，将48深孔板3500r/min离心lOmin，取200μL上清液于96孔板中， 加入4μL喹哪啶红pH指示剂反应30min后，用酶标仪测定520nm可见光下的吸光值0D52Q。 选择OD52tl相对较少的菌株进行复筛实验。将活化后的出发菌和初筛得到的诱变菌株分别 以10%的接种量接入发酵培养基中（500mL摇瓶装50mL(接种后体积）），200r/min，28°C培 养168h。得到一株产α-酮戊二酸的量相比出发菌株提高了 51. 8%的菌株，几次传代培养 后产量仍然稳定。
[0065] 此外，在筛选过程，同时选用HPLC对菌株产α-酮戊二酸量进行了定量测定，发 现：初筛过程中变色圈大的菌株产酸能力强于变色圈相对较小的菌株，复筛过程中，变色较 小或者OD52tl较大的菌株，其α-酮戊二酸产量确实低于变色较大或者OD52tl较小的菌株，说 明该筛选方法可靠。
[0066] 实施例4 :高产α-酮戊二酸菌株的发酵生产验证
[0067] 将实施例3得到的产量最大提高的菌株与出发菌株接种到种子培养基中（500mL 摇瓶装5〇1^)，于20〇1'/11^11，281：培养17-1811条件下培养17-1811，以10%的接种量接入 到31^发酵罐中（装1.51^(接种后体积）），60〇1'/ 1^11，281：，1.5^111条件下发酵16811。发酵 168h后，与出发菌株相比，α-酮戊二酸的产量是31. 46g/L，而出发菌株是21. 64g/L提高 了 45. 4%，丙酮酸的量是30. 45g/L，而出发菌株是39. 23g/L，降低了 22. 4%。
[0068] 实施例5:高产丙酮酸菌株的筛选
[0069]将Torulopsisglabrata CCTCC M202019能发酵生产丙酮酸。将Torulopsis glabrataWSH-Y进行紫外诱变后，得到大量突变菌株。将突变菌株和出发菌株，点种于含有 〇. 2g/L的溴甲酚绿的平板上，剔除负突变菌株，然后挑出变色圈大的菌株在高通量孔板中 进行复筛，72h发酵结束后，离心，在200 μ L上清液中加入3/100的喹哪啶红，反应lOmin， 在酶标仪中520nm的波长下对其反应液进行吸光度的检测，得到0052(|较出发菌株低的12株 菌，将这12株菌摇瓶发酵72h，检测丙酮酸含量。结果发现这12株菌中，上述测定的OD52tl 越低的产丙酮酸能力越强。同时还得到一株丙酮酸产量为36.6g/L的菌株，相对对于出发 菌株32.4g/L提高了12.96%。应用此方法，快速、准确地从大量菌株中筛选得到了一株产 丙酮酸相对较高的菌株。
[0070] 实施例6 :显色剂的选择
[0071] 将刚果红、溴甲酚绿和百里酚蓝添加到含有不同浓度有机酸的培养基中，发现在 低的酸浓度下都能发生颜色反应，都可作为初筛指示剂。如图1所示，为溴甲酚绿和百里酚 蓝色显色解雇，结果显示，溴甲酚绿的颜色由蓝色变为黄色，颜色变化最明显，且溴甲酚绿 对细胞无毒害作用，用于初筛指示剂，效果最好。
[0072] 将与发酵上清液体积比为1/25、1/50、1/100的喹哪啶红指示剂，以及1/50、 1/100U/200的橙黄IV指示剂，与发酵上清反应30min后分别测定OD52tl。同时还测定了发 酵上清中的有机酸含量，为了表明实验数据的可靠性，每组分别做5个平行，结果发现OD值 与有机酸含有之间都存在一定的线性关系，如图I(A，喹哪啶红1/25 ;B，喹哪啶红1/50 ;C， 喹哪啶红1/100 ;D，橙黄IV1/50 ;E，橙黄IV1/100 ;F，橙黄IV1/200)所示，加入上清体积的 1/50的喹哪啶红指示剂后，OD52tl与有机酸含量的线性关系最好，因此喹哪啶红指示剂可以 作为本发明的优选方式之一。
[0073] 实施例7 :高产有机酸菌株的筛选
[0074] 将从自然环境中筛选得到的52株酵母菌，涂布或点种于含有刚果红的培养基中， 于30°C培养24h时间，挑选变色圈相对较大24株菌为初筛的到的菌株，于含有种子培养基 的24深孔板中发酵培养72h，取发酵液离心，在200μL上清液中加入1/200的橙黄IV指示 齐[J，反应60min，在酶标仪中520nm的波长下对其反应液进行吸光度的检测，得到OD52tl相对 较高的6株菌，将这6株菌摇瓶发酵144h，检测总有机酸含量。结果发现这6株菌中，上述 测定的OD52tl越低的产有机酸能力越强，并得到的一株有机酸产量为43. 6g/L的相对产量最 高的菌株。
[0075] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种有机酸高产菌株的高通量筛选方法，是先将待筛选菌株于含有变色范围包含了 pH2. 6?5. 2中的任一pH值的pH指示剂的培养基中进行初筛，选取变色圈较大的菌株于高 通量孔板中发酵后，再加入变色范围包含了 PH1. 4?3. 2的任一 pH值的pH指示剂进行复 筛，选取变色较大的菌株进行发酵验证。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是先用含有溴甲酚绿或百里酚 蓝或刚果红的培养基对待筛选菌株进行初筛，挑选变色圈较大的菌落，于高通量孔板中发 酵后，取发酵液上清，加入喹哪啶红或橙黄IV pH指示剂进行复筛，选取变色较大的菌株进 行发酵验证。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有机酸可以是以下任意一种：柠 檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、a -酮戊二酸、苯丙酮酸、a-酮异己酸、延胡索酸、 脂肪酸、草酰乙酸。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高产菌株是在发酵过程中能使发酵 液的pH能够达到3. 6以下的菌株。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机酸是a-酮戊二酸。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述喹哪啶红或橙黄IV pH指示剂加入量 分别为上清体积的1/20至1/100或1/50至1/200 ;所述加入喹哪啶红或橙黄IV pH指示剂 后，反应5到60min。
7. -种筛选a-酮戊二酸高产菌株的方法，是先将菌株于含有溴甲酚绿的培养基中进 行初筛，挑取变色圈较大的菌落，再于高通量深孔板中发酵后，取发酵液上清，加入喹哪啶 红pH指示剂，选取变色较大的菌株为复筛得到的菌株，对复筛得到菌株进行发酵验证，即 得到a-酮戊二酸相对高产菌株。
8. 根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述菌株是分离自自然界的初筛产物 或人工诱变后菌株或者代谢改造后的菌株。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述复筛是加入喹哪啶红pH指示剂后，反 应30min，测定OD52(l，数值相对较小的即为复筛得到的菌株。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述加入喹哪啶红pH指示剂的量为上清 体积的1/50。
【文档编号】C12R1/645GK104357539SQ201410583352
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】周景文, 陈坚, 曾伟主, 李江华, 堵国成 申请人:江南大学