甘蓝粉虱特异性ss-coi引物对及快速pcr检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒。所述引物对包括引物APZYJF：5'-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′；和引物APZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′。该引物只对甘蓝粉虱具有扩增能力，其检测灵敏度达到了1/25600头雌性成虫。是对甘蓝粉虱形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸、有机蔬菜生产基地、鲜切花生产基地，以及蔬菜、观赏植物种苗和植株调运中推广。
【专利说明】甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对及快 速PCR检测方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 甘蓝粉風Aleyrodes proletella(L.)，属同翅目、粉風科、粉風属，是一种世界性 检疫害虫。甘蓝粉虱的寄主植物较多，有12科38种加3属，分别为十字花科16种加1属， 菊科10种加3属，毛艮科3种，伞形科1种加1属，玄参科1属，結梗科2种，凤仙花科、小 檗科、大戟科、壳斗科、豆科和罂粟科各1种。而且，随着甘蓝粉虱入侵区域的逐渐扩大和定 居时间的推移，其寄主植物的种类和危害程度有进一步增加的趋势。甘蓝粉虱以成虫和若 虫进行危害，危害方式主要有两种，一是直接危害，亦即以刺吸式口器吸食寄主植物汁液， 与植物争夺营养物质，导致寄主叶片黄化、提前落叶、落花甚至落果，严重影响作物产量和 质量；二是间接危害，亦即成虫和若虫分泌的蜜露诱发煤污病，不仅影响植物的光合作用、 降低作物产量，还严重影响作物的品质和观赏植物的观赏价值。而有关其是否传播植物病 毒，尚不得而知。如甘蓝粉虱近年来在欧洲各国严重危害十字花科蔬菜，并在英国多次暴发 成灾，对欧洲芸苔属蔬菜产业的健康发展构成了极大威胁，而且已对拟除虫菊酯类杀虫剂 产生了抗性。
[0003] 甘蓝粉虱原产于英国南部，二十世纪九十年代之前是欧洲十字花科蔬菜的一种次 要害虫。然而，随着国际贸易的日趋频繁，甘蓝粉虱传播扩散迅速，目前已广泛分布于欧洲 如奥地利、英格兰、捷克斯洛伐克、芬兰、法国、德国、匈牙利、意大利、波兰、西班牙、瑞典、瑞 士、南斯拉夫；非洲如加那利群岛、埃及、摩洛哥、安哥拉、肯尼亚、莫桑比克，北非和东非； 亚洲如俄罗斯（塔吉克斯坦帕米尔山脉）、中国台湾、伊拉克、印度；澳洲的澳大利亚；太平 洋群岛的新西兰；大西洋群岛的百慕大群岛；南美洲的巴西，以及北美洲的美国东部等国 家和地区。我国大陆于2012年7月在北京市朝阳区首次发现甘蓝粉虱危害菊科杂草抱茎 苦荬菜，2013年8月在新疆乌鲁木齐和吐鲁番发现其危害生菜。甘蓝粉虱最嗜食十字花科 和菊科植物，而我国幅员辽阔，除海南省地处热带以外，横跨暖温带和亚热带；菊科植物是 我国主要观赏植物类型，而十字花科植物是我国主要的蔬菜种植类型，在青海和西藏以外 的全国各省市区均有种植。甘蓝粉虱是新传入我国的一种粉虱类入侵害虫，目前仅在北京 和新疆发现，一旦发生即可造成严重危害。而蔬菜花卉的调运以及观光旅游等是甘蓝粉虱 进一步扩散蔓延的主要方式，因此加强对甘蓝粉虱的检疫和监测检测是杜绝其进一步传播 扩散的根本途径。
[0004] 甘蓝粉虱体型微小，雌性成虫体长I. 5mm，雄性个体稍小；卵长约0. 3mm，初产蜡白 色，半透明；初孵若虫体长约〇.4_，淡黄绿色；卵及初孵若虫肉眼均难以发现。而加强检疫 和监测检测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于甘蓝粉虱鉴定的方法 主要是：1)形态特征鉴定。而且目前国内针对甘蓝粉虱尚没有标准的检测方法。
[0005] COI技术曾用于鉴别甘蓝粉虱的近缘种。mtDNA COI技术检测是利用通用型的引 物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根 据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术 的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的 有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性 和稳定性强等优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的为提供一对甘蓝粉虱特异性SS-COI引物。
[0007] 本发明的另一目的为提供一种甘蓝粉虱的特异性快速PCR检测方法。
[0008] 本发明的再一目的为提供一种甘蓝粉虱的特异性快速PCR检测试剂盒。
[0009] 本发明根据甘蓝粉虱的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对甘 蓝粉虱具有扩增能力。是对甘蓝粉虱形态学鉴定识别方法的补充和改进。同时，本方法采 用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在甘蓝粉虱检测/监 测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、有机蔬菜生产基地、鲜切花生 产基地，以及蔬菜和观赏植物种苗及植株等的调运中推广。
[0010] 根据本发明的一对甘蓝粉虱特异性SS-COI引物为：
[0011] $*APZYJF:5，-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3，jn
[0012] 引物 PPZYJR :5，-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3，。
[0013] 根据本发明的甘蓝粉虱种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR扩 增的步骤。
[0014] 根据本发明的甘蓝粉虱种特异性检测试剂盒包括上述甘蓝粉虱特异性SS-COI引 物。
[0015] 本发明的甘蓝粉虱种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测甘蓝 粉虱。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
[0016] 1)检测准确性高。本方法根据甘蓝粉虱种特异性SS-COI标记设计的引物APZYJF 和APZYJR，在PCR快速检测甘蓝粉虱时，可扩增出384bp的片段，不仅对甘蓝粉虱的单头成 虫和2龄、三龄、四龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检测。
[0017] 2)操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过 程可在5个小时内完成。
[0018] 3)特异性强。本发明设计的引物可特异性检测甘蓝粉虱，在其近缘种、属粉虱中无 扩增产物。
[0019] 因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱及其近缘种、属粉虱的SS-COI PCR扩增结 果，
[0021] M:分子量标准 Trans2K? ;1:甘蓝粉風 Aleyrodes proletella(L. ) ;2:双钩巢粉 虱；3:螺旋粉虱；4:烟粉虱Asia 113隐种；5:烟粉虱Asia IIl隐种；6:烟粉虱Chinal隐 种；7:烟粉虱Asia I隐种；8:烟粉虱MED隐种；9:温室粉虱；10:柑橘粉虱；11:非洲小粉 虱；12:阴性对照（超纯水）。
[0022] 图2为引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱不同虫态和性别的SS-COI PCR扩增结果，
[0023] M:分子量标准Trans2K? ;1:单粒卵；2: -龄若虫；3:二龄若虫；4:三龄若虫；5: 四龄若虫；6:雌性成虫；7:雄性成虫；8:阴性对照（超纯水）。
[0024] 图3为引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱检测阈值的测定，
[0025] M:分子量标准 Trans2K? ; 1-16 分别为 1:1/25 ;2:1/50 ;3:1/100 ;4:1/200 ; 5:1/400 ；6: 1/800 ；7: 1/1600 ；8: 1/3200 ；9:1/6400 ；10: 1/12800 ；11 : 1/25600 ； 12:1/51200 ;13:1/102400 ;14:1/204800 ;15:1/409600 ;16:1/819200 头雌性成虫；17:阴 性对照（超纯水）。
【具体实施方式】
[0026] 实施实例1 :引物APZYJF/APZYJR对甘蓝粉虱的扩增效果
[0027] 1)粉虱模板DNA的制备
[0028] 将单头粉虱置于滴有20 μ L提取缓冲液（50mM Tris-HClUmM EDTA、1% SDS、20mM NaCl，pH8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微 量移液器移入I. 5mL离心管；然后以200 μ L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管， 混匀，加入5yL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60°C水浴Ih(中途混匀1次）；然后沸 水浴8min，加入220 μ L氯仿/异戊醇（V: V = 24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置 30min ;4°C、12000r/min离心20min，取上清液，加入440μ L预冷的无水乙醇，轻轻混勻，待 出现少量絮状沉淀后于_20°C放置30min ;4°C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。 加入50(^1^预冷的75%乙醇洗涤，41：、1200017 /1^11离心151^11，小心弃去上清液；然后将 离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入50 μ L超纯水，充分溶解后于-20°C 保存备用。
[0029] 2)检验甘蓝粉虱的特异性引物的合成
[0030] Primer APZYJF ：5; -CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3;
[0031] Primer APZYJR :5' -CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3'由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。
[0032] 3) PCR扩增反应
[0033] 反应体系为 20μ L，其中 10XPCR buffer(含Mg2+)2. 0μ UdNTP(IOmM)O. 3μ UTaq 聚合酶（2. 5U/yL)0. 2yL、上游引物和下游引物（10μΜ)各0. 3yL、模板DNA2. OyL、超纯 水 14. 9 μ L。
[0034] 4) PCR扩增程序
[0035] 94?预变性 IOmin ;35 个循环：94°C 30sec、52°C 30sec、72°C 30sec ;最后 72? 延伸lOmin。
[0036] 5) PCR产物的鉴定
[0037] 取5 μ L PCR产物用1. 0% (重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
[0038] 实施结果
[0039] 利用引物primer APZYJF/APZYJR以甘蓝粉虱线粒体DNA为模板，以不同隐种的烟 粉虱（包括=Asia 113隐种、Asia IIl隐种、Chinal隐种、Asia I隐种、MED隐种）以及双 钩巢粉虱、螺旋粉虱、温室粉虱、柑橘粉虱、非洲小粉虱等5种其他常见种类的粉虱为对照 进行SS-COI PCR扩增。在1泳道的甘蓝粉虱中扩增出了 384bp的目的条带（见附图1的 1泳道），在其他10种近缘种、属的粉虱中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自甘蓝粉虱 线粒体DNA的特异性SS-COI PCR扩增引物的特异性强。
[0040] 384bp片段的序列：
【权利要求】
1. 甘蓝粉虱特异性SS-COI引物对，其特征在于，所述引物对包括以下引物： 引物 APZYJF : 5' -CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3';和 引物 APZYJR : 5' -CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3'。
2. -种甘蓝粉虱特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述 SS-C0I引物对进行PCR扩增的步骤。
3. -种甘蓝粉虱检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所 述的甘蓝粉虱特异性SS-C0I引物对。
4. 用于检测甘蓝粉虱的特异性序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104263728SQ201410596872
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】张桂芬, 万方浩, 郭建洋, 郭建英, 李小凤, 陈苗苗 申请人:中国农业科学院植物保护研究所