一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：将包含6个串联重复TCF4转录因子的7TFP质粒采用慢病毒转移的方式转染宿主细胞形成稳定细胞株，并种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样品，取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素酶基因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。本发明可以有效的准确的检测出组蛋白去乙酰化酶抑制剂，解决了了假阴性和假阳性的问题，降低了成本，具有简单，高效、低成本的特点。
【专利说明】一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方 法。
【背景技术】
[0002] 组蛋白去乙酰化酶（HDAC)抑制剂是一类新型的药物，在肿瘤、心血管等疾病的治 疗中存在重要的应用前景。一些重要的抑制剂业已进入临床阶段研究。比如，SAHA和FK228 已经被美国FDA批准用于CTCL的治疗，VPA也已进入临床II /III研究阶段。然而，要想获 得更多、更为有效的新型药物，必须有更加有效的筛选方案。
[0003] 在特定的结肠癌细胞中，HDAC可影响转录因子TCF4的转录活性。当采用小分子 化合物抑制HDAC活性时，TCF4的转录活性明显升高，其转录活性可以通过报告基因（荧光 素酶或者EGFP)加以测定。对一些已知HDAC抑制剂的分析均获得了一致的结果。此外，我 们采用RNAi技术干扰HDAC基因表达（同样达到抑制HDAC活性的目的），TCF4的转录活性 也明显升高。然而，在其它细胞如食管癌细胞中则没有这个效应。因此，在这个特定的结肠 癌细胞中，TCF4基因的表达可以反映出HDAC抑制剂的效应。
[0004] 目前获准的专利或发表论文中，在对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选时直接采用 的组蛋白去乙酰化酶基因的启动子驱动报告基因（荧光素酶）或者是采用P21基因启动子 驱动报告基因来进行筛选。尽管目前已知的多数抑制剂可以激活P21基因启动子的转录， 但这不是全部抑制剂均有的共同之处。因此，采用P21启动子筛选可能出现假阴性问题。另 夕卜，和P21启动子一样，采用组蛋白去乙酰化酶基因的启动子也可能不是特异的表现，存在 假阳性的问题。因此，这些方法均有一定的局限，本发明将TCF4反应元件分别与荧光素酶 基因（可通过法学反应测定荧光素酶基因表达强度）连接构建慢病毒报告载体，同时构建 不含TCF4反应元件的对照载体。将两种报告载体通过慢病毒转移至特定的结肠癌细胞中， 获得稳定表达报告基因的细胞株。在对（小分子）药物库进行筛选时，利用荧光素酶基因 报告体系进行精确筛选，可获得具有抑制HDAC活性的抑制剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是要解决临床对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的需求，针对现有筛选 利用P21基因启动子驱动报告基因来进行筛选，存在假阴性和假阳性的可能，旨在提供一 种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，具有简单，高效、低成本的特点。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] -种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：
[0008] 1)将质粒转染宿主细胞形成稳定细胞株；
[0009] 2)将获得的细胞株种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样 品；
[0010] 3)取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素 酶基因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶 抑制剂。
[0011] 所述的质粒为7TFP质粒，包含6个串联重复TCF4转录因子；
[0012] 所述的质粒转染采用慢病毒转移的方式；
[0013] 所述的宿主细胞为结肠癌细胞HCT116,同时还可以为EK293细胞或SW480细胞；
[0014] 所述的结肠癌细胞株可以稳定表达荧光素酶基因；
[0015] 本发明所述的结肠癌细胞中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂与TCF4基因表达呈负相 关，即当高表达HDAC时，TCF4转录活性降低，而当HDAC活性被抑制后，TCF4转录活性显著 增加。
[0016] 本发明的有益效果为：
[0017] 1)特异性，在特定的结肠癌细胞中，HDAC与TCF4基因表达呈负相关：即抑制HDAC 后TCF4的转录活性明显上升，而对TCF4的转录活性检测可以采用其特异的反应元件来驱 动报告基因来加以展示。因此，我们的筛选方案具有特异性。
[0018] 2)成本低，由于阳性药物可改变荧光素酶报告基因表达强度至上百倍，因此在检 测时可将十个药物分别处理细胞后合并检测，仍可以有效判断是否存在阳性药物。合并检 测可以达到降低成本的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1抑制剂对TCF4转录活性的影响；
[0020] 图2嘌呤霉素筛选的细胞克隆；
[0021] 图3基因组DNA中7TFP整合的PCR证实。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据 本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的 保护范围内。
[0023] 实施例1
[0024] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（NaB)的筛选方法，用曲古柳菌素（TSA)作为阳 性对照。
[0025] 实验材料：7TFP质粒来自Addgene，其序列60-161为TCF4反应元件。
[0026] 试验方法：分别将质粒7TFP通过慢病毒转移的方式转染结肠癌细胞形成稳定细 胞株TCF4+LUC，将所获得的TCF4+LUC细胞种植于96孔板，IO 4细胞/孔，过夜贴壁后更换培 养基，加入含NaB (浓度分别为0. 2, I. 0和5. OmM)和TSA (浓度分别为0. 1，0. 4和I. 0 μ M) 进行处理24小时，以未加药物处理的细胞为对照。取出培养板，吸取培养基，加入细胞裂解 液，37°裂解30分钟后取裂解液上清进行测定。采用化学发光方法测定荧光素酶活性。
[0027] 实验结果：经过测定发现荧光素酶活性明显增强，说明TCF4的转录活性增强，根 据当高表达HDAC时，TCF4转录活性降低，而当HDAC活性被抑制后，TCF4转录活性显著增 加的机理，表示抑制剂NaB和TSA对组蛋白去乙酰化酶（HDAC)具有很好的抑制作用，其对 TCF4转录活性抑制影响如图1。
[0028] 实施例2慢病毒的包装及细胞感染
[0029] 将7TFP质粒利用PstI (35)和NheI (174)双酶切再后利用核酸酶切平自连，转化 大肠杆菌，利用PCR方法筛选获得去除TCF4反应元件从而获得对照质粒7TFP-Con。
[0030] 常规方法培养包装细胞人胚肾293FT。将其种植于6孔板，待60%满底时进行脂 质体转染。质粒组合八:71卩卩+?]\?2丄+?8?412 ;8:71卩?-(：〇11+?]\?2丄+?8?412。三种质粒按 1: 1:1混合进行转染。转染48小时后收集培养上清液（含慢病毒颗粒）备用。
[0031] 常规方法培养结肠癌HCT116细胞。将其种植于6孔板，待60%满底时加入含病毒 的上清液感染4小时，换液后继续培养24小时。将培养基更换为含嘌呤霉素（2 μ g/mL)的 完全培养基，继续培养至细胞克隆团块出现图2。培养单个细胞克隆，分别命名为TCF4+Luc 细胞和Con-Luc细胞，各四个克隆株。为了证实慢病毒介导的外源DNA整合，提取细胞基因 组DNA进行PCR检测，结果发现病毒感染后所获得的HCT116细胞能扩增出特异条带图3。
[0032] 实施例3已知HDAC抑制剂的效应
[0033] 分别将TCF4+Luc细胞和Con-Luc细胞种植于96孔板，待60 %满底时加入 TSA(IyM)处理24小时。去培养基后裂解细胞测定荧光素酶活性。以每个细胞的TSA/N确 定细胞对药物的反应性，结果显示TCF4+Luc细胞均可被TSA激活，而Con-Luc细胞无显著 反应，如表1所示：
[0034] 表1荧光素酶活性测定
[0035]
【权利要求】
1. 一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将质粒转染宿主细胞形成稳定细胞株； 2) 将获得的细胞株种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样品； 3) 取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素酶基 因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶抑制 剂。
2. 根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所 述的质粒为HFP质粒，包含6个串联重复TCF4转录因子。
3. 根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步 骤（1)所述的质粒转染采用慢病毒转移的方式。
4. 根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所 述的宿主细胞为结肠癌细胞HCT116、细胞EK293或SW480。
5. 根据权利要求4所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所 述的结肠癌细胞株HCT116用于稳定表达荧光素酶基因的用途。
【文档编号】C12Q1/02GK104388538SQ201410672070
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】章波, 庞学利, 黄钢, 何刚, 徐小峰, 宋敏 申请人:中国人民解放军第三军医大学