一种使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法
【专利摘要】本发明公开一种使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法，将黑曲霉菌种置三角瓶培养基中培养48h，按质量百分数为2％的比例将菌丝均匀添加到湿润为2:1的虎杖根茎中，于40℃恒温下堆积发酵30h。本发明采用固体堆积发酵法将虎杖中虎杖苷转化成白黎芦醇，并对固体发酵条件进行优化。此方法既没有强烈的酸碱反应发生，又无需粗提苷，同时不需添加贵重设备，易于推广。本发明白藜芦醇提取得率提高至1.197％，比现有方法产率提高了30％，取得了非常显著的技术效果。
【专利说明】
一种使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，涉及黑曲霉的应用，具体涉及一种利用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法。
【背景技术】
[0002]虎杖Polygonumcuspidatum的有效成分主要为二苯乙烯类和蒽醌类化合物,前者主要是白藜芦醇及其糖苷，后者主要是大黄素及其糖苷，其中以二苯乙烯类化合物具有显著独特的功效。白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和对冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等具有防治作用，白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。据报道，干燥虎杖根茎中白藜芦醇的含量为0.1%?0.2%，而虎杖苷含量为2%左右，如何高效地把虎杖苷转化为白藜芦醇已成为研究热点。
[0003]目前，有人用酸碱水解或改性纤维素酶解法对虎杖苷进行分解，但是酸碱会造成环境污染，降低产量，而生物酶解成本较高，工艺较为复杂，因此都不利于推广应用。也有采用浸没发酵方式用产酶微生物直接转化虎杖苷为白藜芦醇的报道，但设备及操作要求高，基础建设投入大。
[0004]中国专利201110374767.7公开了一种黑曲霉，保藏编号:CCTCC No:M 2011358，
其生物转化处理的虎杖中白藜芦醇含量，达到了 0.92%。但该方法还有进一步提升的空间。
【发明内容】
[0005]鉴于此，本发明目的在于提供一种工艺简单、易于推广的使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法。
[0006]解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法，将黑曲霉菌种置三角瓶培养基中培养48h，按质量百分数为2%的比例将菌丝均匀添加到湿润为2:1的虎杖根茎中，于40°C恒温下堆积发酵30h。
[0007]进一步地，所述培养基是以察氏培养基为基础，去掉其中的蔗糖，加质量百分数为I %的过80目的虎杖粉。
[0008]与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点:
[0009]1、本发明采用固体堆积发酵法将虎杖中虎杖苷转化成白黎芦醇，并对固体发酵条件进行优化。此方法既没有强烈的酸碱反应发生，又无需粗提苷，同时不需添加贵重设备，易于推广。
[0010]2、本发明白藜芦醇提取得率提高至1.197%,比现有方法产率提高了 30%，取得了非常显著的技术效果。
【具体实施方式】
[0011 ] 下面结合具体实施例进行说明。
[0012]黑曲霉菌株堆积发酵转化虎杖中虎杖苷的条件主要有:温度、接种量、接种菌龄、发酵湿度。
[0013]将接种量、菌龄、湿度分别固定为2%、36h、2:1，发酵温度设定为30、40、50、601:4
个梯度，进行堆积发酵，每隔6h取样分析虎杖苷转化白藜芦醇的情况。发酵前期虎杖苷转化速度随发酵温度上升而加快，转化程度也随之提高，但温度高于40°C时，白藜芦醇含量在发酵30h时达到峰值后，后逐步下降。
[0014]菌龄不同的菌株体内酶系发育情况不同，适应环境的能力也不同。将接种量、温度、湿度分别固定为2%、40°C、2:1，菌龄设定为24、36、48、60h，4个梯度，进行堆积发酵，每隔6h取样分析虎杖苷转化白藜芦醇的情况。对于霉菌液体培养而言，发酵24h往往是菌株对数生长前期，而发酵60h则菌体进入次级代谢初期，因培养基配比及发酵条件变化，略有出入。当用菌龄为24h菌株发酵，最大白藜芦醇含量仅为0.75%，而用菌龄为60h菌株发酵，菌内酶系浓度虽然高，但菌繁殖速度慢，导致转化程度低于菌龄为36h和48h的菌。综合菌繁殖和菌产酶能力，选择将菌龄为48h的菌接种入虎杖进行堆积发酵为宜。
[0015]将菌龄、温度、湿度分别固定为48h、40°C、2:1，发酵接种量设定为1%、2%、3%、4% 4个梯度，进行堆积发酵，每隔6h取样分析虎杖内虎杖苷转化白藜芦醇的情况。接种量在堆积发酵过程中的影响如同液体浸没发酵，即接种量小，则发酵迟滞期延长，对发酵而言意味着生产强度降低和发酵染菌风险提高；但接种量过大，意味着作为种子培养增加，成本也增加，因此接种量选择2%为宜。
[0016]将接种量、温度、菌龄分别固定为2%、40°C、48h，发酵添加水与虎杖干质量的比例设定为1.8:1.2:1、2.2:1、2.5:1共4个梯度，堆积发酵，每隔6h取样分析虎杖内虎杖苷转化白藜芦醇的情况。发酵过程中水活度增加，即湿度提高，有助于菌体生长和外泌酶的扩散，因此湿度增加能够加快虎杖苷的酶解和提高白藜芦醇提取率；但另一方面，湿度提高却增加白藜芦醇提取过程的能耗，使分离纯化过程成本上升。因而在堆积发酵时，湿度必然有一最适值。通过实验发现，当湿度由1.8:1提高至2:1时，发酵产白藜芦醇含量提高幅度较大；而进一步提高湿度时，白藜芦醇含量增幅减缓。因此，选择湿度为2:1，虎杖发酵较为理本巨
ο
[0017]将黑曲霉菌种置三角瓶培养基中培养48h，培养基是以察氏培养基为基础，去掉其中的蔗糖，加质量百分数为1%的过80目的虎杖粉。待菌丝长好后，与适量水及虎杖根茎混匀。水与虎杖根茎的质量比为2:1，代菌丝的菌株接种量为虎杖干重的2%。在40°C恒温下堆积发酵30h。
[0018]发酵的样品提取白藜芦醇时，先通风干燥发酵好的虎杖，后加入定量的乙醇，恒温加热提取一定时间，抽滤。取一定量的提取液分别用乙醚、乙酸乙酯萃取，分离得到白藜芦醇、虎杖苷。
[0019]米用紫外分光光度法作定量分析，白藜芦醇在306nm、白藜芦醇苷在325nm处有最大吸收。提取液用有机溶剂萃取分离后，用756MC型紫外可见分光光度计分别在各有效成分的最大吸收波长处测定吸光度值，由标准曲线计算出各有效成分的质量浓度，从而计算出提取率。通过计算，白藜芦醇提取得率提高至1.197%，该提取率较现有技术中0.92%的提取率提高了 30%，取得了非常显著的技术效果。
【权利要求】
1.一种使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法，其特征在于，将黑曲霉菌种置三角瓶培养基中培养48h，按质量百分数为2%的比例将菌丝均匀添加到湿润为2:1的虎杖根茎中，于40°C恒温下堆积发酵30h。
2.根据权利要求1所述的使用黑曲霉发酵提高白藜芦醇收率的方法，其特征在于，所述培养基是以察氏培养基为基础，去掉其中的蔗糖，加质量百分数为1%的过80目的虎杖粉。
【文档编号】C12P7/22GK104388478SQ201410681191
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司