一种转化芽孢杆菌的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体为一种转化芽孢杆菌的方法。该方法首先诱导芽孢杆菌进入可被转化的状态，再与含有重组质粒的大肠杆菌进行共培养，期间添加多粘菌素，杀死大肠杆菌，释放出质粒。共培养之后的菌株再涂布到对应抗生素平板上进行筛选，得到被转化的菌株。该转化方法操作简单，不需要特殊的设备；不仅可用于枯草芽孢杆菌的模式菌株的转化，还可用于野生型菌株的枯草芽孢杆菌转化和其它芽孢杆菌属的细菌转化，适应性广。
【专利说明】一种转化芽孢杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体为一种转化芽孢杆菌的方法。
【背景技术】
[0002]数千年前，人类已经开始采用发酵来制作酒、泡菜、酸奶等食品。但是随着现代微生物学的发展，我们可以通过发酵生产更多的产品，包括:1、菌体，益生菌、酵母粉等，2、初级代谢产物，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、乙醇、柠檬酸、丙酮、谷氨酸、赖氨酸、核苷酸、维生素等，3、次级代谢产物，如青霉素、卡那霉素、四环素、抗菌肽等物质，4、产品转化，如将牛奶转化为酸奶，淀粉转化为乙醇等。这些产品都极大地改善了我们的生活。
[0003]发酵技术除了需要特定的发酵工生产艺外，发酵技术的关键点在于拥有独特的菌株。在现代微生物学的促进下，可以通过菌株筛选和诱变，得到拥有独特性质的菌株。但是该过程周期较长，并且具有不确定性。随着分子生物学的兴起，通过基因工程改造菌株，可以快速高效地获得拥有独特性质的菌株，基因工程的改造技术的前提技术之一就是细菌转化技术，只有将需要改造的目的片段导入到目标菌株之后才能对目标菌株进行改造。
[0004]芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，不含有内毒素。芽孢杆菌属下的枯草芽孢杆菌种还被？0八认为具有生物安全性的菌株。目前芽孢杆菌可用于生产蛋白酶、淀粉酶等产品，也可作为益生菌添加到食品中。因此建立芽孢杆菌的转化方法和基因改造方法具有重要的科研和经济价值。
[0005]芽孢杆菌的转化方法可以分为化学转化法、原生质体转化法和电转化法。化学转化法是由31)1212611在上世纪五十年代末建立的，该方法利用芽孢杆菌从丰富培养基转移到低营养培养基上生长后，在一段时间内呈现可被转化状态的原理，复合钙离子和镁离子刺激的方法，可将0應片段或者质粒转入细菌中。但是该转化方法转化效率较低，只能用于枯草芽孢杆菌模式菌株168等特定菌株。原生质体法是通过溶菌酶降解细菌细胞壁产生原生质体，在采用等物质刺激就可以将细胞外的0嫩转入细胞内。但是该方法操作繁琐，条件不容易控制，转化效率不高，已经很少采用。电转化法是上世纪八十年代末开始建立的方法，将生长到一定阶段的芽孢杆菌放入特定的电转化液中，施加强电场，击穿细胞壁，让转化液中的0嫩进入细胞。到目前为止，文献报道的用于芽孢杆菌的电转化方法不下于数十种。最近几年仍然有人在改进芽孢杆菌的转化方法，1116等人在1999年建立了一种利用甘露醇和山梨醇配制高渗的转化液，可显著提高转化效率(111油081110181-11:7
1111^)^0^65 七 116 6160^^0-^1^8115^0^1118^1011 6^10161107 0？七 116 ^8111-^)051^1^6 1380^61*18080111115 51113^1115 3,11(1 080111115 110116111^01-11115, ^0111*1181 0？ 1101*0131010^1081
16七110(18，1999，34:183 - 190。2006年，8011161*0等人发表了一种电转化原生质体的转化方法，可以转化一些不易转化的野生型菌株'脈11011 0？ 1111(1011165^108^6(1 5^1*81115
0？ 080111115 51113^1115 67 01*0七0口1已8七 6160^^0^)0^8^1011, ^0111*1181 0？ 1101*0131010^1081
16也0(18，2006，66:556 - 559^ ￠^0等人在高渗转化法的基础上，添加了海藻糖，可提高转化效率(八6160^0-^8115^01-1118^1011 1116七 110(1 080111115 51113^1115 3,11(1 1^53,^1103,110X1 111 七 116 ^1*0(1110^1011 0？ 811^111110^013181 11^0^6^^1(165, 010^60111101 乙6 七七
(2011) 33:1047 - 1050。！^饱3等人在高渗转化法的基础上，添加甜菜碱，可显著提高电击后细菌的存活率，提高转化效率。但是电转化法的菌株特异性较高，一种转化方法只能转化一些菌株。
[0006]在实际基因工程改造中，只能对菌株进行少量的改造，因此需要选择特性相对较好的野生型菌株进行改造。但是上述的转化方法局限性很大，只能转化少数野生型菌株。因此建立一种适应性较广的芽孢杆菌转化方法，可解决野生芽孢杆菌不能被转化的问题。
[0007]
【发明内容】
[0008]针对以上技术问题，本发明建立了一种全新的芽孢杆菌的转化方法。该方法首先诱导芽孢杆菌进入可被转化的状态，再与含有重组质粒的大肠杆菌进行共培养，期间添加多粘菌素，杀死大肠杆菌，释放出质粒。共培养之后的菌株再涂布到对应抗生素平板上进行筛选，得到被转化的菌株。该转化方法操作简单，不需要特殊的设备；不仅可用于枯草芽孢杆菌的模式菌株的转化，还可用于野生型菌株的枯草芽孢杆菌转化和其它芽孢杆菌属的细菌转化，适应性广。
[0009]本发明目的通过下述技术方案来实现:
一种转化芽孢杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤:
(1 ?、将待转化菌株划线接种到⑶平板上，于371的条件下培养16-241！；将含有待转化质粒的大肠杆菌划线接种到含有对应抗生素的⑶平板上，371下生长16-241！；
0、挑取步骤(1)中待转化菌株的单菌落接种到玻璃试管中，每支玻璃试管含有31111嫩培养基，于371,20011)111下培养15-1811，得待转化的菌株；将步骤(1)中的大肠杆菌接种到玻璃试管中，每管含有对应抗生素的⑶培养基4-601，于371，200印111下培养16-2211 ；所述的嫩培养基由以下成分构成:2父嫩%1。1%体积的50%的葡萄糖溶液，其中嫩“86和嫩％匕以10父母液配制，保存。10X1^ “86由108/1酵母提取物和2^/1胰蛋白胨构成。10X1/1 %匕由以下成分构成:150禮硫酸铵，800禮磷酸氢二钾，440禮磷酸二氢钾，35禮柠檬酸三钠和10禮硫酸镁。
[0010](3)取步骤(2)中待转化的菌株300111，接种到2.701嫩培养基中，然后置于玻璃试管中，371,20011)111 培养 311 ；
(4)取步骤(3)中的待转化菌株，然后稀释2-20倍接种到18培养基中，终体积为301，置于玻璃试管中，301 -371,20011)111下培养90-11 ；18培养培养基由以下成分构成:1父嫩13&86，IX嫩8311:，1%体积的50%的葡萄糖溶液，0.5禮氯化5禮氯化镁。其中嫩13886和嫩881^以10父母液配制，41保存；氯化钙、氯化镁以100X母液配制，41保存。
[0011](5)取步骤(2)中含有质粒的大肠杆菌菌液，13400X8离心加化，去上清，用18培养基洗涤两次，去除残余的抗生素；
(6)在步骤(5)中的大肠杆菌中加入0.2-1倍原始体积的4中的待转化菌液，终体积101，加入终浓度为5-301^/1多粘菌素8，正常筛选浓度的1/50-1/10的对应抗生素，置于玻璃试管中，371，200印111培养30-900111 ；作为优选，本步骤选取0.5倍原始体积的4中的的待转化菌液，终体积101，加入终浓度为1008/1多粘菌素8，正常筛选浓度1/20的对应抗生素，培养111 ；
(7)取步骤(6)中的菌液200-500111，涂布于含有5-30呢/1多粘菌素8以及含对应抗生素的平板上，培养20-401挑取生长的单菌落进行鉴定，得到转化的芽孢杆菌，作为优选，涂布于含有10 08/1多粘菌素8。
[0012]本发明的积极效果体现在:
该方法首先诱导芽孢杆菌进入可被转化的状态，再与含有重组质粒的大肠杆菌进行共培养，期间添加多粘菌素，杀死大肠杆菌，释放出质粒。共培养之后的菌株再涂布到对应抗生素平板上进行筛选，得到被转化的菌株。该转化方法操作简单，不需要特殊的设备；不仅可用于枯草芽孢杆菌的模式菌株的转化，还可用于野生型菌株的枯草芽孢杆菌转化和其它芽孢杆菌属的细菌转化，适应性广。
[0013]
【具体实施方式】
[0014]本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0015]以下采用物品的配制方法为:
溶液配制
10X1^ 1^86:称取18酵母提取物((^010),0.胰蛋白胨((^010)，加水定容到10001，121。。，20-灭菌后，4。。保存。
[0016]10X1^ %1丨:称取1.9?硫酸铵，18.268三水合磷酸氢二钾，5.998磷酸二氢钾，
0.908 二水合柠檬酸三钠，0.258七水合硫酸镁，加水定容到10001，121^,200111灭菌后，
41保存。
[0017]50%葡萄糖溶液:称取508葡萄糖，加水定容到1001111，1211，200111灭菌后，41保存。
[0018]250禮氯化镁:称取5.0?六水和氯化镁，加水定容到1001111，1211，200111灭菌后，4 0保存。
[0019]50禮氯化钙:称取0.558无水氯化钙，加水定容到10001，1211，200111灭菌后，
41保存。
[0020]嫩培养基:取21111 10X1^ “86，11111 10X1^ 8^1^, 100111 50% 葡萄糖溶液，加入无菌水6.91111，现配现用。
[0021]18 培养基:取 11111 10X1^ ^86,1^1 10X1^ 8^1^, 100111 50%葡萄糖溶液，10011125011)1氯化镁，100111 50禮氯化钙，加入无菌水1.了“，现配现用。
[0022]18培养基:称取108胰蛋白胨((^010)，酵母提取物((^010)，氯化钠108，定容至I』1匕邱调整到7.0。分装后，1211,20111111灭菌，室温保存。固体18培养基灭菌前加入
1.5%的琼脂粉，加入抗生素的培养基现配现用。
[0023]10111^/1111 多粘菌素 8:称取 0.25@ 硫酸多粘菌素 8 (^0171117^111 8 8111^81:6,600011/呢，^1111-6800),加水定容到251111，过滤灭菌，分装，4保存。
[0024]201118/1111卡那霉素:称取0.5^硫酸卡那霉素，加水定容到251111，过滤灭菌，分装，-201保存。
[0025]10008/1111氨苄霉素:称取2.氨苄霉素，加水定容到2501，过滤灭菌，分装，-201保存。
[0026]1001118/1111壮观霉素:称取2.壮观霉素，加水定容到2501，过滤灭菌，分装，-201保存。
[0027]251118/1111博来霉素:称取0.625〖博来霉素，加水定容到251111，过滤灭菌，分装，-201保存。
[0028]上面使用的试剂，除特别说明外，均购自于上海生工生物工程股份有限公司。
[0029]对比例1:
八、划线接种模式菌株88168到18平板上，含有-！'5-即？ (^081:即191434)的大肠杆菌I'叩10菌株到含有仙呢/!卡那霉素的⑶平板上，371培养2处。
[0030]8、于下午挑取三到五个168菌株单菌落，接种到31111嫩培养基中，371，200印111过夜培养；挑取一个10？10单菌落，接种到501含卡那霉素仙呢/!的⑶培养基中，371，200^111过夜培养。
[0031]0、次日9点，取300111 8中168菌液，接种到2.7^1新鲜嫩培养基中，37【，200印111
培养3匕。
[0032]0、取1.5爪1 0中菌液，加入1.5爪1 18培养基，37。。，200卬III培养洲―。
[0033]2、取11111 8中过夜培养的10？10菌液，13400\8离心1111111，去上清。加入101 18培养基，吹打混匀，13400 X 8离心去上清，重复该步骤一次。
[0034]？、在2中的菌体中，加入11111 0中的菌液，加入终浓度201^/1的多粘菌素8，2^/I 的卡那霉素，3700，2001-1)111 培养 30111111。
[0035]I取？中混合培养的菌液200111，涂布于含有20呢凡的多粘菌素8，20^/1的卡那霉素的⑶平板上。培养2处后，挑取菌落进行鉴定统计。因为质粒含有绿色荧光蛋白基因，生长出的菌落都有绿色的荧光，挑取部分菌落进行鉴定，结果都是阳性菌落。
[0036]注:上述步骤中提到的菌液培养，均在15111111*150111111的玻璃试管中进行。
[0037]对比例2:
本实施例中除步骤0更改为:取100111、300111、500111、800111、1 5^1 0中菌液，分别接种到 2.91111,2.71111,2.51111,2.21111,1.5爪1 18 菌液中，37。〇，200印111 培养 90111111。
[0038]其余步骤与实施例1相同。菌落统计时，300111-2.7^1组长出的带有绿色荧光蛋白的菌落最多。
[0039]对比例3:
本实施例中除步骤0更改为:取300111 0中菌液，接种到2.7^1 18菌液中，371或者30。〇，200印111 培养 90111111。
[0040]其余步骤与对比例1相同。菌落统计时，301组长出的带有绿色荧光蛋白的菌落多于371组。
[0041]对比例4:
除步骤0更改为:取300111 中菌液，接种到2.701 18菌液中，301，200印111培养90111；1110
[0042]另对步骤？中的加入菌液比例、多粘菌素浓度、卡那霉素浓度和培养时间进行正交优化。
[0043]其余步骤与对比例1相同。在菌落统计中，菌液稀释比为2，多粘菌素浓度为101^/[，卡那霉素浓度为11118/1，培养时间为化，平板上生长出的带有绿色荧光蛋白的菌落最多。
[0044]实施例1:
八、划线接种模式菌株88168到18平板上，含有-！'编号:^191434)的大肠杆菌10？ 10菌株到含有仙呢凡卡那霉素的⑶平板上，371培养2处。
[0045]8、于下午挑取三到五个168菌株单菌落，接种到31111嫩培养基中，371，200印111过夜培养；挑取一个10？10单菌落，接种到501含卡那霉素仙呢/!的⑶培养基中，371，200^111过夜培养。
[0046]0、次日9点，取300111 8中168菌液，接种到2.7^1新鲜嫩培养基中，37【，200印111
培养3匕。
[0047]0、取300111 0中菌液，加入2.7爪1 18培养基，30。。，200卬III培养洲―。
[0048]2、取21111 8中过夜培养的10？10菌液，13400\8离心1111111，去上清。加入101 18培养基，吹打混匀，13400 X 8离心去上清，重复该步骤一次。
[0049]？、在2中的菌体中，加入101 0中的菌液，加入终浓度川呢凡的多粘菌素8，1^/I的卡那霉素，3700，200^111培养比。
[0050]匕取？中混合培养的菌液200111，涂布于含有10呢凡的多粘菌素8，20^/1的卡那霉素的⑶平板上。培养2处后，得到了比较多的带有绿色荧光的菌落，挑取部分通过菌落进行？⑶鉴定，结果均为阳性。
[0051]实施例2:
除步骤八中待转化菌株改为￠1(^23708(枯草芽孢杆菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心)菌种外，其余步骤与实施例2相同。最后的菌落统计鉴定中，同源得到大量带有绿色荧光的菌落，菌落总数多余168菌株。挑取部分菌落进行？(?鉴定，结果都为阳性。
[0052]实施例3:
除步骤八中待转化菌株改为￠1(^10266(地衣芽孢杆菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心)菌种外，其余步骤与实施例2相同。最后的菌落统计鉴定中，同源得到大量带有绿色荧光的菌落，菌落总数少于￠1(^23708菌株。挑取部分菌落进行鉴定，结果都为阳性。
[0053]实施例4:
除步骤八中待转化菌株改为21077 (短小芽孢杆菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心)菌种外，其余步骤与实施例2相同。最后的菌落统计鉴定中，同源得到大量带有绿色荧光的菌落，菌落总数少于￠1(^23708菌株。挑取部分菌落进行？(?鉴定，结果都为阳性。
[0054]实施例5:
除步骤4中待转化菌株改为8^189 (枯草芽孢杆菌，本实验室从野外筛选)菌种外，其余步骤与实施例2相同。最后的菌落统计鉴定中，同源得到大量带有绿色荧光的菌落，菌落总数少于￠1(^23708菌株。挑取部分菌落进行鉴定，结果都为阳性。
[0055]实施例6:
除步骤八中待转化菌株改为￠1(^23708(枯草芽孢杆菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心),待转化质粒改为(实验室在基础上构建的一个重组质粒，大小为6吐，大于的3.6^0。其余步骤与实施例1相同。最后的菌落统计鉴定中，同源得到大量白色菌落，菌落总数少数实施例1。挑取部分菌落进行？⑶鉴定，结果都为阳性。
[0056]实施例7:
八、划线接种模式菌株0100 23708到18平板上，含有？06102 (懸I编号:即864235)的大肠杆菌10？ 10菌株到含有10008/1氨苄霉素的⑶平板上，371培养2处。
[0057]8、于下午挑取三到五个168菌株单菌落，接种到31111嫩培养基中，371，200印111过夜培养；挑取一个10？10单菌落，接种到501含10008/1氨苄霉素的⑶培养基中，371，2001-1)111过夜培养。
[0058]0、次日9点，取300111 8中168菌液，接种到2.7^1新鲜嫩培养基中，37【，200印111
培养3匕。
[0059]0、取300111 0中菌液，加入2.7爪1 18培养基，30。。，200卬III培养洲―。
[0060]2、取21111 8中过夜培养的10？10菌液，13400\8离心1111111，去上清。加入101 18培养基，吹打混匀，13400 X 8离心去上清，重复该步骤一次。
[0061]？、在2中的菌体中，加入101 0中的菌液，加入终浓度101^/1的多粘菌素8，5^/I的壮观霉素，3700，200^111培养1匕。
[0062]匕取？中混合培养的菌液200111，涂布于含有10呢凡的多粘菌素8，100^/1的壮观霉素的18平板上。培养2处后，挑取菌落进行鉴定统计。得到了比较多的白色菌落，挑取部分菌落进行鉴定，均为阳性；挑取部分菌落接种到含有2508/1博来霉素的⑶平板上进行生长鉴定，均为阳性。
【权利要求】
1.一种转化芽孢杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤: (I )、将待转化菌株划线接种到LB平板上，于37°C的条件下培养16-24h ;将含有待转化质粒的大肠杆菌划线接种到含有对应抗生素的LB平板上，37°C下生长16-24h ； (2)、挑取步骤(I)中待转化菌株的单菌落接种到玻璃试管中，每支玻璃试管含有3mlMA培养基，于37°C，200rpm下培养15_18h，得待转化的菌株；将步骤(I)中的大肠杆菌接种到玻璃试管中，每管含有对应抗生素的LB培养基4-6ml，于37°C，200rpm下培养16_22h ； (3)取步骤(2)中待转化的菌株300ul，接种到2.7mlMA培养基中，然后置于玻璃试管中，37°C，200rpm 培养 3h ； (4)取步骤(3)中的待转化菌株，然后稀释2-20倍接种到MB培养基中，终体积为3ml，置于玻璃试管中，30°C -37°C，200rpm下培养90min ； (5)取步骤(2)中含有质粒的大肠杆菌菌液，13400Xg离心lmin，去上清，用MB培养基洗涤两次，去除残余的抗生素； (6)在步骤(5)中的大肠杆菌中加入0.2-1倍原始体积的4中的待转化菌液，终体积lml，加入终浓度为5-30mg/L多粘菌素B，正常筛选浓度的1/50-1/10的对应抗生素，置于玻璃试管中，37 °C，200rpm 培养 30_90min ； (7)取步骤(6)中的菌液200-500ul，涂布于含有5-30mg/L多粘菌素B以及含对应抗生素的平板上，培养20-40h， 挑取生长的单菌落进行鉴定，得到转化的芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的转化芽孢杆菌的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的MA培养基由以下成分构成:2XMA base, I XMA salt，1%体积的50%的葡萄糖溶液，其中MA base和MA salt以1X母液配制，4°C保存。
3.根据权利要求1所述的转化芽孢杆菌的方法，其特征在于:步骤(4)中为 取步骤(3)中的待转化菌株，然后稀释10倍接种到MB培养基中，终体积为3ml，置于玻璃试管中，于30°C，200rpm的条件下培养90min。
4.根据权利要求1所述的转化芽孢杆菌的方法，其特征在于:步骤(4)中MB培养基由以下成分构成:1XMA base, I XMA salt, 1%体积的50%的葡萄糖溶液,0.5mM氯化I丐,2.5mM氯化镁；其中MA base和MA salt以1X母液配制，4°C保存；氯化钙、氯化镁以100X母液配制，4°C保存。
5.根据权利要求2或权利要求4所述的转化芽孢杆菌的方法，其特征在于:所述的10XMA base由以下成分构成:10g/L酵母提取物,2g/L胰蛋白胨，10XMA salt由以下成分构成:150mM硫酸铵，800mM磷酸氢二钾，440mM磷酸二氢钾，35mM柠檬酸三钠，1mM硫酸镁。
6.根据权利要求1所述的转化芽孢杆菌的方法，其特征在于:步骤(6)中为0.5倍体积的待转化菌液，10mg/L的多粘菌素B，正常筛选浓度1/20的对应抗生素，培养lh。
7.根据权利要求1所述的转化芽孢杆菌的方法，其特征在于:步骤(7)中多粘菌素B为.10 mg/L。
【文档编号】C12R1/125GK104388460SQ201410686389
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】任钧 申请人:成都美溢德生物技术有限公司