一种分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用层析技术从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：1)低温反复冻融、溶菌酶破碎菌体；(2)盐析：饱和硫酸铵溶液沉淀；(3)离子交换层析样品制备：用阳离子交换层析柱结合缓冲液重悬沉淀，制得上样样品；(4)阳离子交换层析柱纯化：所得上样样品经阳离子交换层析柱纯化，收集上样穿透液体；(5)阴离子交换层析柱纯化：NaCl分段洗脱，收集洗脱液，得到谷氨酸脱羧酶酶液。本发明公布的纯化工艺中将阳离子交换柱层析柱与阴离子交换柱层析柱串联，大大缩短纯化时间，简化样品处理过程。利用本发明公布的方法所得谷氨酸脱羧酶回收率约为60％，纯化倍数为20左右。
【专利说明】一种分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，尤其涉及一种利用层析技 术从宿主菌中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] γ -氨基丁酸（GABA)存在于哺乳动物脑、脊髓中，是一种抑制性神经传递物质，由 谷氨酸脱羧酶（GAD)催化谷氨酸得到。GABA具有调节血压与心律、营养神经细胞、促进精神 安定、促进脑部供血、促进长期记忆、促进激素分泌、肾功能活化等作用。
[0003] γ -氨基丁酸的生产基本采用化学合成、植物富集法和生物合成法。其中化学合成 成本高且因使用有毒试剂，存在安全性差，且反应中间产物多，产物纯度难保证。生物合成 法下游分离纯化难度高且难获得谷氨酸脱羧酶活性高的微生物菌株。植物富集法含量低， 反应液天然成分复杂，同样存在纯化问题。
[0004] 筛选具有相对高活力的谷氨酸脱羧酶的微生物并扩大培养使其过量或高表达谷 氨酸脱羧酶，进而催化谷氨酸底物生成γ -氨基丁酸，即酶催化方法逐渐受到研宄者的亲 睐，用于生产γ-氨基丁酸。
[0005] 目前报道的谷氨酸脱羧酶的分离纯化方法比如常规的盐析法、离子交换法、凝胶 色谱法等多用于进行谷氨酸脱羧酶的酶学性质研宄，不追求回收率和比活，且纯化工艺未 经优化，存在工艺复杂、生产周期长等问题，导致所得酶产品难以商业化。因此，改进现有生 产技术以生产高纯度高比活的谷氨酸脱羧酶是非常有必要的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用层析技术从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方 法，该方法利用常规盐析法、离子交换法等技术，合理设计纯化路线并优化得到。
[0007] 本发明所采用的技术方案如下：
[0008] 一种利用层析技术从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：（1) 菌体破碎：将表达谷氨酸脱羧酶的微生物细胞培养离心，制得湿菌体细胞，将所得湿菌体 细胞在-20°c反复冻融1-3次，加入菌体裂解缓冲液、溶菌酶，冰浴30-60min，加入聚乙二醇 辛基苯基醚，冰浴10_30min，离心取上清，制得菌体破碎液；（2)盐析：向所得菌体破碎液加 入2倍饱和硫酸铵溶液，4°C静置过夜，10000rpm4°C离心30min，收集沉淀；（3)制备离子交 换层析上样样品：用阳离子交换层析柱结合缓冲液重悬沉淀，制得上样样品；(4)阳离子交 换层析柱纯化：所得上样样品经阳离子交换层析柱纯化，其中结合缓冲液PH高于谷氨酸脱 羧酶等电点，收集上样穿透液体；(5)阴离子交换层析柱纯化：穿透液体经阴离子交换柱层 析柱纯化，NaCl分段洗脱，收集洗脱液，得到谷氨酸脱羧酶酶。
[0009] 优选的，步骤（1)中所述菌体裂解缓冲液配方为50mM PB，pH6. 0、500mM NaCl、lmM 二硫苏糖醇。
[0010] 优选的，步骤（1)中所述聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0. 1%。
[0011] 优选的，步骤（1)中所述溶菌酶的终浓度为〇. 2mg/mL。
[0012] 优选的，步骤（3)中所述阳离子交换层析柱结合缓冲液为50mM磷酸缓冲液， pH6. 0, ImM二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸钠，0. 1 %聚乙二醇辛基苯基醚，5 %甘油，50mM NaCl0
[0013] 优选的，步骤（4)中所述阴离子交换柱层析柱结合缓冲液为50mM磷酸缓冲液， pH6. 0, ImM二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸钠，0. 1 %聚乙二醇辛基苯基醚，5 %甘油，50mM NaCl，步骤（4)所得的穿透液体直接作为阴离子交换柱层析柱的上样样品。
[0014] 优选的，步骤（5)所述的谷氨酸脱羧酶酶液经超滤膜过滤浓缩或透析袋透析浓 缩，收集浓缩液，制得谷氨酸脱羧酶。
[0015] 更进一步的，根据本发明所述的方法得到的谷氨酸脱羧酶于_20°C或_80°C低温 保存，
[0016] 更进一步的，将根据本发明所述的方法得到的谷氨酸脱羧酶冷冻干燥，低于4°C保 存。
[0017] 本发明的有益效果是：1、利用谷氨酸脱羧酶的等电点pH约在5. 0左右，设计阴阳 离子交换柱层析，使二者的缓冲体系相同，阳离子交换柱层析的穿透液体可直接作为后续 阴离子层析柱的上样样品，因此可将阳离子交换柱层析柱与阴离子交换柱层析柱串联，大 大缩短纯化时间，简化样品处理过程；2、采用低温反复冻融破碎和溶菌破碎具体菌体，破碎 彻底，提高谷氨酸脱羧酶产量。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
[0019] 实施例一
[0020] 谷氨酸脱羧酶酶活测定方法
[0021] 采用比色法测定。
[0022] 1个GAD活力单位（U)定义为：在37°C，pH5. 5条件下，每分钟每毫升酶液中催化 谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成1 μ mol的GABA所需酶量。
[0023] 纯化倍数为纯化所得酶液比活力与菌体破碎液比活力的比值。
[0024] 回收率为（纯化所得酶液活力*体积）与（菌体破碎液活力*体积）的比值。
[0025] 实施例二
[0026] 谷氨酸脱羧酶纯化方法
[0027] 菌体裂解缓冲液配方：50mM PB，pH6. 0、500mM NaClUmM二硫苏糖醇。
[0028] 聚乙二醇辛基苯基醚母液浓度：10%。
[0029] 溶菌酶母液浓度：5mg/mL。
[0030] 阳离子交换层析柱结合缓冲液配方：50mM磷酸缓冲液，pH6. 0, ImM二硫苏糖醇， 2mM乙二胺四乙酸钠，0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚，5%甘油，50mM NaCl。
[0031] 阴离子交换层析柱结合缓冲液配方：50mM磷酸缓冲液，pH6. 0, ImM二硫苏糖醇， 2mM乙二胺四乙酸钠，0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚，5%甘油，50mM NaCl。
[0032] 表达谷氨酸脱羧酶的菌种为大肠杆菌埃希氏菌CICC2190,购自中国工业微生物菌 种保藏管理中心（CICC)。
[0033] 菌种培养方法见专利CN201310244021。
[0034] 阳离子层析柱为：SP-Sepharose fast flow
[0035] 阴离子层析柱为：Q-Sepharose fast flow
[0036] 离子层析柱为：纯化步骤：
[0037] (1)将IOOOmL表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌埃希氏菌菌体培养液4000rpm/min 离心30min，制得湿菌体细胞，将所得湿菌体细胞在-20°C反复冻融3次，加入IOOmL菌体裂 解缓冲液，4mL溶菌酶母液，冰浴60min，加入0. ImL聚乙二醇辛基苯基醚，冰浴10-30min， 10000rpm/min离心30min取上清，制得菌体破碎液；
[0038] (2)盐析：向所得菌体破碎液搅拌缓慢加入200mL预冷的饱和硫酸铵溶液，4°C静 置过夜，IOOOOrpm 4°C离心30min，收集沉淀；
[0039] (3)制备离子交换层析上样样品：用IOOmL阳离子交换层析柱结合缓冲液重悬沉 淀，制得阳离子交换层析柱上样样品；
[0040] (4)安装阳离子交换层析柱，柱规格I. 6cmX 20cm，柱体积IOml ;用10倍柱体积的 去离子水洗绦，5倍柱体积的阳离子交换层析柱结合缓冲洗绦；2mL/min流速上样，收集穿 透液；
[0041] (5)安装阴离子交换层析柱，柱规格I. 6cmX 20cm，柱体积IOml ;用10倍柱体积的 去离子水洗涤，5倍柱体积的阳离子交换层析柱结合缓冲洗涤；
[0042] 2mL/min流速上样；5倍柱体积的阳离子交换层析柱结合缓冲洗绦；100mM、200mM、 300mM、400mM、500mM NaCl分段洗脱，分别收集洗脱液；
[0043] (6)GAD活性检测，收集GAD酶液_20°C低温保存。
[0044] SDS-PAGE纯度检测，Bradford蛋白定量，比色法测定GAD活性。
[0045]
【权利要求】
1. 一种利用层析技术从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤： 步骤（1)菌体破碎：将表达谷氨酸脱羧酶的微生物细胞培养离心，制得湿菌体细胞，将 所得湿菌体细胞在_20°C反复冻融1-3次，加入菌体裂解缓冲液、溶菌酶，冰浴30-60min，加 入聚乙二醇辛基苯基醚，冰浴10-30min，离心取上清，制得菌体破碎液； 步骤⑵盐析：向所得菌体破碎液加入2倍饱和硫酸铵溶液，4°C静置过夜， 10000rpm4°C离心30min，收集沉淀； 步骤（3)离子交换层析样品制备：用阳离子交换层析柱结合缓冲液重悬沉淀，制得上 样样品； 步骤（4)阳离子交换层析柱纯化：所得上样样品经阳离子交换层析柱纯化，其中结合 缓冲液pH高于谷氨酸脱羧酶等电点，收集上样穿透液体； 步骤（5)阴离子交换层析柱纯化：所得穿透液体经阴离子交换柱层析柱纯化，NaCl分 段洗脱，收集洗脱液，得到谷氨酸脱羧酶酶液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌体裂解缓冲液为50mM磷酸盐缓冲 液 pH6. 0、500mM NaCl、lmM 二硫苏糖醇。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为 0? 1%〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶的终浓度为0. 2mg/mL。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱结合缓冲液为 50mM磷酸缓冲液，pH6. 0，lmM二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸钠0. 1%，聚乙二醇辛基苯基 醚，5%甘油，50禮恥(：1。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子交换柱层析柱结合缓冲液为50mM 磷酸缓冲液，PH6. 0, ImM二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸钠0. 1 %，聚乙二醇辛基苯基醚，5% 甘油，50mMNaCl，步骤（4)所得的穿透液体直接作为阴离子交换柱层析柱的上样样品。
7. 根据权利要求6所述的方法得到的谷氨酸脱羧酶酶液经超滤膜过滤浓缩或透析袋 透析浓缩，收集浓缩液，制得谷氨酸脱羧酶。
8. 根据权利要求7所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于谷氨酸脱羧酶于-20°C或-80°C低 温保存，或将所得谷氨酸脱羧酶冷冻干燥，低于4°C保存。
【文档编号】C12N9/88GK104480094SQ201410708189
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司