专利名称：：用固定化细胞催化氧化低碳烃的过程的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用微生物催化氧化挥发性强的或气态有机化合物的过程。随着生物催化的发展，发现了许多以烃类为唯一碳源和能源的具有活化分子氧能力的微生物，例如可使丙烯直接氧化成环氧丙烷的甲烷菌类微生物就是这一类微生物的突出代表。Colby，Dolton等发现甲烷菌之所以具有这一种功能是由于含有甲烷单加氧酶(MMO)，正是由于MMO的存在才能使丙烯直接被分子氧氧化成环氧丙烷。C.T.Hou等发现，单独的MMO不能催化这一反应，必须在反应体系中添加MAOH作为辅酶。辅酶主要起电子给体作用，在反应中是逐渐消耗的，目前还找不到有效的方法进行再生。为此C.T.Hou(US4348476)将甲烷菌细胞分别吸附在多孔玻璃球、活性碳、陶瓷、砂子等载体上制备成固定化细胞，作为活化分子氧使气态有机化合物发生催化氧化的催化剂，该类生物催化剂特别适用于丙烯环氧化制环氧丙烷和能被甲烷单加氧酶催化的类似反应，但是操作6小时后催化剂即失活，将失活的细胞用甲醇再生一次催化剂活性下降60%，经三次再生后催化剂已基本失活，很难做到催化剂的连续应用。US4368267中记载了一种低碳α-烯烃、二烯烃或乙烯基芳香化合物环氧化的生物催化过程，在微生物或微生物中提取的酶存在下将上述化合物进行环氧化反应，所用微生物是甲基营养菌，尤其是在好氧条件下以甲烷为营养的微生物。本发明在包埋活细胞制得的固定化细胞作用下，氧化挥发性强的或气态有机化合物，并用可给固定化细胞提供能量的相应低碳烷烃或烯烃与空气的混合气对其固定化细胞进行处理，以达到提供能量，带走有毒产物，增加还原当量，使一次投入的催化剂多次再生而不失活的目的。本发明的目的可由如下措施实现。将以气态低碳烷烃或烯烃作为唯一碳源和能源，辅以无机无碳培养基生长的好氧细菌、酵母、真菌，在可给上述微生物提供能量的相应的碳源气和空气的混合气中用无机无碳培养基于20-60℃培养48hr-144hr，然后用海藻酸钠溶液包埋微生物细胞，海藻酸钠溶液的溶剂为含金属离子的无菌蒸馏水或无机无碳培养基，这样有利于细胞包埋后的生存，再将含有菌体的海藻酸钠滴加到0.1MCaCl2溶液中，制成2mm小球，放入4℃的冰箱中增加催化剂的强度，最后洗去催化剂上的CaCl2加入培养基，充入可给微生物提供能量的相应低碳烷烃或烯烃碳源气与空气的混合气，其中碳源气的范围为1-99%，在摇床上培养48hr-120hr备用。本发明制固定化细胞所采用的微生物可以是甲烷营养菌甲基囊菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基无芽胞杆菌属乙烷营养菌假单胞菌属、土壤杆菌属、短杆菌属、分枝杆菌属丁烷营养菌假单胞菌属、土壤杆菌属乙烯营养菌分枝杆菌属丙烯营养菌诺卡氏菌、假单胞菌属钢绿色极毛杆菌。取一定量湿重的催化剂小球放入填充式反应器中，空气和下述一种的气态或挥发性强的C1-C4烷烃、C2-C4烯烃或二烯烃、乙烯基芳香化合物、甲基环己烯、C＝C-C-C-Br、C＝C-C-C-Cl等，分别经过增湿器后进入反应器，气体的总流量1-10ml/min，pH为3-10，反应温度20-80℃，反应6小时后，停止供应原料气，将反应器的温度调至所用菌体的最适培养温度，即20-60℃，通入(上述所提及)可给微生物提供能量的相应的低碳烷烃或烯烃碳源气和空气的混合气，其中碳源气占1-99%，以提供能量，带走有毒产物，增加还原当量，这一再生过程和反应过程交替进行。上述所提及的可给微生物提供能量的相应碳源气可以是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯，实验证明，用包埋法制备的固定化催化剂经上述方法再生，催化剂至少可再生8次而活性仍不下降。本发明与已有技术相比具有如下优点，1、用海藻酸钙包埋法制备生物催化剂，不仅方法简便，有利于大规模生产，而且，固定化生物催化剂经多次再生，催化剂活性不降。2、用填充式反应器，可直接通入碳源气和空气，而不必把催化剂从反应器中取出，即可进行再生。现进一步通过最佳实施例来阐述发明的实现方式实施例[1]本发明将成都微生物研究所提供的甲基单胞菌属(Methylononas)成都761(Appl.EnvironMicrobiol.，1984，Vol.48，No.4，PP.807～812)，用无机无碳培养基，在甲烷∶空气＝1∶1的气氛中，温度为30℃下培养，培养周期为4天。将静止培养好的菌液用接种环取上层菌体放入2.7%的海藻酸钠溶液中(溶剂为培养基，这有利于细胞被包埋后的生存)。用10ml的注射器，5号针头将含有菌体的海藻酸钠溶液滴入0.1M的CaCl2溶液中，制成直径约2mm的小球。并在4℃的冰箱中放置5小时，用灭菌蒸馏水洗去催化剂上的CaCl2，最后用培养基洗一次。将洗好的催化剂小球放入250ml的三角瓶中加入适量培养基，充入1∶1的甲烷空气混合气在摇床(32℃，220rpm)上培养85小时备用。实施例[2]取包埋培养好的固定化细胞8.91g(每克固定化细胞中含有细胞5.9mg)，装入φ1×20cm的填充式反应器中，反应器装有夹层，用循环水控制反应温度，40℃下反应。空气和丙烯分别经过增湿器，然后以1∶1的比例进入反应器，气体的总流量为2ml/min，由于环氧丙烷的沸点为34.2℃，生成的环氧丙烷随气体从反应器中流出被吸收在由冰水冷却的装有1ml水的吸收器中。反应6小时后共生成1.6μmol的环氧丙烷，这时催化剂已失活。将反应器的温度改为32℃，通入1∶1的甲烷空气混和气，流速为2ml/min，进行辅酶再生，再生时间为16小时。再生完毕后。将反应器温度调成40℃，通入反应气(1∶1的空气丙烯混合气)进行同样条件下的反应。催化剂失活后再进行同样条件的再生。发现经8次再生，催化剂活性不降。将一次投入的催化剂每次再生后所达到的活性列入表Ⅰ。</tables>实施例[3]取包埋培养好的固定化细胞16.4g(每克固定化细胞含有6.8mg细胞)放入250ml的三角瓶中，加入30ml培养基作反应液，将其中的空气尽可能抽尽，加入60ml丙烯，其余用氧气充满，在32℃、220rpm的摇床上反应。反应6小时后催化剂失活，共生成11.1μmol的环氧丙烷，用蒸馏水把催化剂洗净，最后用培养基洗一次。加入40ml培养基，充入1∶1的空气甲烷混合气，在32℃，220rpm摇床上再生16小时。洗净，做同样条件下的环氧化反应，催化剂失活后进行同样条件下的再生。将催化剂再生次数与活性关系列入表Ⅱ。</tables>权利要求1.一种在微生物催化剂存在下，氧化挥发性强的或气态有机化合物的过程，其特征在于上述化合物和空气在通过包埋活细胞制得的固定化细胞作用下反应，其中包埋活细胞微生物是指以气态的低碳烷烃或烯烃作为唯一碳源和能源，辅以无机无碳培养基生长的好氧的细菌、酵母、真菌，反应完毕后，用可给微生物提供能量的相应碳源气与空气的混合气，在再生条件下，对其固定化细胞进行再生。2.如权利要求1所述的氧化过程，其特征在于有机化合物和空气分别通过增湿器后，进入装有固定化细胞的填充式反应器，总流速1-10ml/min，pH为3-10，反应温度20-80℃，反应毕后，将反应器温度调至20-60℃，用可给微生物提供能量的相应碳源气与空气的混合气对固定化细胞再生，其中碳源气占1-99%，反应与再生两过程交替进行。3.如权利要求1所述的氧化过程，其特征在于其中固定化细胞的制取方法包括(a)将微生物用无机无碳培养基，在低碳烷烃或烯烃和空气的混合气气氛中培养，(b)取静止培养好的菌液于2.7%的海藻酸钠溶液中，(c)将含有菌体的海藻酸钠溶液滴入0.1NCaCl2溶液中，放入4℃的冰箱中存放5小时，(d)用灭过菌的蒸馏水洗去固定化细胞上的CaCl2，然后再用培养基洗一次，(e)将洗好后的催化剂小球，加入适量的培养基，充入可给微生物提供能量的相应低碳烷烃或烯烃和空气的混合气于摇床上培养。4.如权利要求1或2或3所述的氧化过程，其特征在于微生物是各种甲基营养菌、乙烯营养菌、丙烯营养菌。5.如权利要求1或2所述的氧化过程，其特征在于有机化合物是气态或挥发性强的C1-C4烷烃、C2-C4烯烃或二烯烃、乙烯基芳香化合物、甲基环己烯、C＝C-C-C-Br、C＝C-C-C-Cl。6.如权利要求1或2所述的氧化过程，其特征在于再生固定化细胞的混合气是可给微生物提供能量的相应低碳烷烃或烯烃和空气。7.如权利要求1所述的氧化过程，其特征在于微生物是甲烷营养菌甲基囊菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基无芽胞杆菌属，乙烷营养菌假单胞菌属、土壤杆菌属、短杆菌属、分枝杆菌属，丁烷营养菌假单胞菌属、土壤杆菌属，乙烯营养菌分枝杆菌属，丙烯营养菌诺卡氏菌、假单胞菌属钢绿色极毛杆菌。8.如权利要求3所述的氧化过程，其特征在于固定化细胞的直径1-20mm。9.如权利要求3所述的氧化过程，其特征在于海藻酸钠溶液可用含金属离子的无菌蒸馏水配制。10.如权利要求3所述的氧化过程，其特征在于海藻酸钠溶液可用无机无碳培养基配制。11.如权利要求3所述的氧化过程，其特征在于培养微生物的碳源气是可给微生物提供能量的相应甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯中的一种。12.如权利要求1或2所述的氧化过程，其特征在于丙烯和空气分别通过增湿器进入填充式反应器中，在海藻酸钙包埋甲基单胞菌属成都761制得的固定化细胞存在下反应制得环氧丙烷，反应温度为40℃。再将反应器温度调至32℃，用1∶1的甲烷和空气的混合气对固定化细胞进行再生。13.如权利要求6所述的氧化过程，其特征在于再生固定化细胞的碳源气是可给微生物提供能量的相应的甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯中的一种。全文摘要本发明涉及用微生物催化氧化挥发性强的或气态的有机化合物过程。本过程在海藻酸钙溶液包埋微生物细胞制得的固定化细胞存在下，使空气和一种挥发性强的或气态的有机化合物反应，反应完全后，用可给固定化细胞提供能量的相应低碳烷烃或烯烃和空气的混合气对其微生物催化剂进行再生，以提供能量，带走有毒产物，增加还原当量，使一次投入的催化剂经多次再生而不失活。海藻酸钙包埋法，方法简便，有利于大规模生产。文档编号C12P17/02GK1055201SQ9010457公开日1991年10月9日申请日期1990年7月7日优先权日1990年7月7日发明者李树本,高灿柱申请人:中国科学院兰州化学物理研究所