专利名称：蛋白质c衍生物的制作方法
技术领域：
本发明属于人类医学领域，特别是血凝固紊乱的治疗。最具体地说，本发明涉及人蛋白质C分子的衍生物、使用这些衍生物的方法以及含有这些蛋白质C衍生物的药物组合物。
蛋白质C是一种依赖于维生素K的血浆蛋白，该蛋白质主要以无活性的二硫键结合杂二聚体形式进行循环。该杂二聚体由一条约25千道尔顿的轻链和一条约41千道尔顿的重链组成。重链含有丝氨酸蛋白酶区域及其N末端活化肽，而轻链含有γ-羧基谷氨酸残基区，该区域对于依赖于钙的膜结合和功能活性是必需的。借助于凝血酶/凝血调理素复合物的作用可将无活性的人蛋白质C酶原转变为活化的蛋白质C。所述复合物的作用是切下活化肽(循环酶原的158至169位残基或前原酶原的200至211位残基)形成活化的蛋白质C。
蛋白质C作为治疗剂的作用已得到充分的认识(参见例如，Bang等人的美国专利4，775，624公开了编码人蛋白质C酶原的DNA序列;Bang等人的美国专利4，992，373公开了制备活化人蛋白质C的方法)。一种命名为FLIN的人蛋白质C衍生物由Gerlitz等人在欧洲专利申请91301450.2中公开。该FLIN衍生物在活化肽的167位(前原酶原的206位)含有Phe残基而不是Asp残基，在重链内的172位(前原酶原的214位)含有Asn残基而不是Asp残基。该该FLIN衍生物比野生型人蛋白质C酶原更容易受凝血酶的激活。Gerlitz等人在欧洲专利申请91301446.0中公开了其他人蛋白质C衍生物，命名为Q313和Q329。Q313衍生物在野生型酶原313位上含有一个Gln残基而不是Asn残基，而Q329衍生物在野生型酶原329位上含有一个Gln残基而不是Asn残基。这些Q313和Q329衍生物缺少一般情况下与野生型分子的这些位点上的Asn残基相结合的碳水化合物结构，因此这些衍生物的酰氨水解活性和功能活性增强。
本发明涉及经过修饰的人蛋白质C的衍生物，这些修饰作用是将天然人蛋白质C分子的313位氨基酸从天冬酰胺改变为谷氨酰胺;将天然人蛋白质C分子的第167位氨基酸从天冬氨酸改变为苯丙氨酸;将天然人蛋白质C分子的172位氨基酸从天冬氨酸改变为天冬酰胺。也可以通过将天然人蛋白质C分子的329位上的野生型天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基而修饰这些分子。329位残基的变化只能与313位残基的变化同时发生，或者也可以与167位和172位残基的变化同时发生。所说的人蛋白质C衍生物比野生型人蛋白质C分子或任何其他人蛋白质C衍生物更易受凝血酶激活，并具有更强的功能活性。
本发明也公开并要求保护用于制备新的人蛋白质C衍生物的重组DNA构建体、载体和转化体。此外，还公开和请求保护含有有效量的本发明人蛋白质C衍生物和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物，以及使用这些衍生物治疗和预防疾病的方法。
为了在本文中公开和请求保护的本发明的目的，下列术语和简写定义如下。
Q313-一种人蛋白质C衍生物，其中已将天然人蛋白质C分子313位上的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基。
Q329-一种人蛋白质C衍生物，其中已将天然人蛋白质C分子329位上的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基。蛋白质C衍生物Q313和Q329由Gerlitz等人(欧洲专利申请91301446.0)和Grinnell等人(J.Biol.Chem.2269778-9785，1991)公开，这些文献的内容引入本文作为参考。
Q3Q9-一种人蛋白质C衍生物，其中已将天然人蛋白质C分子313位的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺;将天然人蛋白质C分子的329位的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基。
F167-一种人蛋白质C衍生物，其中已将天然人蛋白质C分子167位的天冬氨酸残基改变为苯丙氨酸。蛋白质C衍生物F167由Bang等人(欧洲专利申请88312201.2)和E hrlich等人(EMBO J.92367-2373，1990)公开，这些文献引入本文作为参考。
LIN-一种人蛋白质C衍生物，其中天然人蛋白质C分子172位的天冬氨酸残基已改变为天冬酰胺残基。
FLIN-一种人蛋白质C衍生物，其中天然人蛋白质C分子167位的天冬氨酸残基已改变为苯丙氨酸残基;天然蛋白质C分子172位的天冬氨酸残基已改变为天冬酰胺残基。蛋白质C衍生物LIN和FLIN已由Gerlitz等人(欧洲专利申请91301450.2)和Grinnell等人(《蛋白质C和相关抗凝剂》，Bruley，D.和Drohan，W.编，第13-46页，Gulf Publishing Co.，Houston，1990)公开，这些文献引入本文作为参考。
FLIN-Q313-一种人蛋白质C衍生物，其中已将天然人蛋白质C分子167位的天冬氨酸残基改变为苯丙氨酸残基;将天然蛋白质C分子172位的天冬氨酸残基改变为天冬酰胺残基;将天然蛋白质C分子313位的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基。
FLIN-Q3Q9-一种人蛋白质C衍生物，其中已将天然人蛋白质C分子167位的天冬氨酸残基改变为苯丙氨酸残基;将天然蛋白质C分子172位的天冬氨酸残基改变为天冬酰胺残基;将天然蛋白质C分子313位的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基;将天然蛋白质C分子329位的天冬酰胺残基改变为谷氨酰胺残基。
GBMT转录单位-一种经修饰的转录控制单位，它包括靠近腺病毒主要晚期启动子(MLTF)上游调控成分的BK病毒P2增强子、腺病毒-2主要晚期启动子、一个其定位能刺激所说启动子的多聚GT成分，以及一个含有腺病毒拼接三重前导序列的DNA序列。
新生蛋白质-由mRNA转录本经转译产生的尚未进行任何转译后修饰的多肽。但是，在蛋白质从mRNA转录本全部转译前可能已开始进行如谷氨酸残基的γ-羧基化以及天冬氨酸残基的羟基化这样一些转译后修饰。
蛋白质C活性-负责蛋白水解、酰氨水解、酯水解和生物学(抗凝或血纤维蛋白原溶解)活性的任何人蛋白质C的特性。用于检测蛋白质抗凝活性的方法是本领域内熟知的，即见Grinnell等人，Bio/Technology 51189-1192，1987。
酶原-蛋白质水解酶的无酶活性的前体。本文所用的蛋白质C酶原一词，是指已分泌的非活性形式的蛋白质C，无论是一条链还是两条链。
本公开中使用的所有氨基酸缩写都是由美国专利和商标局按37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)的规定得到认可的缩写。
本发明提供了已改变了糖基化模式并且还改变了活化区的人蛋白质C衍生物。具体地说，这些衍生物包括Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9。Q3Q9衍生物在蛋白质C分子的313和329位上含有谷氨酰胺残基(而不是通常在这些位置上存在的天冬酰胺残基)。FLIN-Q313衍生物在该分子的167位含有苯丙氨酸残基;在该分子的172位含有天冬酰胺残基(而不是通常在这些位置上存在的天冬氨酸残基);并且在313位含有谷氨酰胺残基(而不是通常在这些位置上存在的天冬酰胺残基)。在FLIN-Q3Q9衍生物中，已将167位的残基由天冬氨酸改变为苯丙氨酸;172位的残基由天冬氨酸改变为天冬酰胺;313位的残基由天冬酰胺改变为谷氨酰胺;329位的残基由天冬酰胺改变为谷氨酰胺。
FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9衍生物由凝血酶单独活化时显示出极高的活化速率。再者，与其他野生型人蛋白质C不同，FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9两种衍生物都可由人血浆凝固时产生的凝血酶激活，从而抑制进一步形成凝块。这种由凝块激活的酶原比天然蛋白质C的活化形式具有明显较大的比活性和明显较长的半存留期。因此本发明的衍生物可用作为位点激活的抗血栓形成剂，除在有显著量的凝血酶生成的情况下，它没有抗凝活性。
本发明还提供了用于制备蛋白质C衍生物的DNA化合物。这些DNA化合物包含人蛋白质C轻链的编码序列，该序列的位置紧接野生型蛋白质C酶原的前原肽序列的下游，并与之共处于转译阅读框内。这些DNA序列也编码在蛋白质C分子的成熟期间进行加工的Lys-Arg二肽，以及活化肽和蛋白质C分子的重链。在167位、172位和313位上氨基酸残基的变化改变了该分子的活化过程，而在313和329位上氨基酸残基的变化则改变了该分子的碳水化合物含量。
本领域技术人员将会认识到，由于遗传密码的简并性，许多种DNA化合物都可以编码上述多肽。Bang等人的美国专利4，775，624(其全部内容引入本文作参考)公开并要求保护编码野生型人蛋白质C分子的DNA序列。据此，技术人员可以容易地确定，DNA序列中的哪些变化可用于构建能编码本发明所公开的具体多肽的另一些DNA顺序，本发明并不限于通过保藏而公开的特定的DNA序列。因而，下文中和所附实施例中描述的本发明优选的DNA化合物、载体以及转化体的构建，仅是为了说明而不限制发明范围。另外，在313位和329位用Gln置换Asn是为了说明而不限制发明范围，因为除Cys或Pro外也可使用其他氨基酸置换。
本发明中所有的DNA化合物都是通过将人蛋白质C基因进行定位诱变制备的。然后将经诱变的酶原编码分子插入到真核表达载体中，使GBMT转录单位能驱动酶原基因的表达。将这些载体转化到大肠杆菌K12 AG1细胞中，并于1992年1月14日保藏在美国北方地区研究实验室(Peoria，Illinois 61604)并构成该保藏机构永久性原种培养物的一部分。具体的培养物及保藏号列于下表Ⅰ中。
表Ⅰ培养物 保藏号大肠杆菌K12 AG1/pGT-h-Q3Q9 NRRL B-18938大肠杆菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313 NRRL B-18939大肠杆菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9 NRRL B-18940
利用常规方法获得这些培养物并分离出质粒，然后可直接转染到真核宿主细胞中用于制备人蛋白质C衍生物。优选将质粒转染到能表达腺病毒E1A最早期基因产物的宿主细胞中，因为GBMT转录控制单位中存在的BK增强子在E1A存在下可最有效地增强表达。Berg等人在欧洲专利申请91301451.0中对GBMT转录控制单位进行了更详细的描述，该文献的全部内容引入本文作为参考。技术人员可以认识到，许多宿主细胞都表达或可以使之表达大DNA病毒的最早期基因产物。用于表达本发明人蛋白质C衍生物的最优选的细胞系是人肾293细胞系，该细胞系已由Bang等人在美国专利4，992，373中公开，该文献的全部内容引入本文作为参考。在该细胞系中表达之后，利用Yan的美国专利4，981，952的方法，从细胞培养上清液中纯化这些衍生物，上述文献的全部内容引入本文作为参考。
利用化学方法，或通过将限制性片段组合，或将本领域内的已知技术联合使用，可合成本发明的DNA序列。可利用现有的DNA合成仪合成本发明的DNA化合物。
本发明的示例性载体包含GBMT转录单位，其定位可通过腺病毒晚期启动子刺激编码序列的转录。本领域技术人员明白，许多真核启动子、增强子和表达载体都是本领域内已知的，并可用于表达DNA序列以制备本发明的蛋白质C衍生物。本领域技术人员还明白，在没有增强子成分时真核表达载体也能起作用。本发明的关键方面并不在于用于表达衍生物的特定增强子或启动子，而在于新的DNA序列和从这些序列制备的相应蛋白质。
可将本发明的载体转化至各种各样的真核尤其是哺乳动物宿主细胞中并在其中表达。
在北方地区研究实验室保藏的载体都含有潮霉素抗性基因。但是，可方便地构建不含选择性标记的载体，并可将其用于进行瞬时性检测分析，或将其与其他含选择性标记的载体一起共转化至细胞系中。本发明的载体还可包含能在大肠杆菌中进行复制的序列，因为在大肠杆菌中比在其他宿主有机体中制备质粒DNA通常更为有效。
可以对本发明的示例性DNA序列和质粒进行许多修饰和改变。例如，遗传密码的简并性允许在整个多肽编码区和转译终止信号内进行核苷酸置换而不会改变所编码的多肽编码序列。可从人蛋白质C的已知氨基酸或DNA序列推导出这些可置换的序列，并且可用下列常规合成方法或定位诱变方法构建这些序列。可以基本上按照Itakura等人(Science 1981056，1977)和Crea等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 755765，1978)的步骤完成合成方法。因此，本发明决不仅限于具体例举的DNA序列和质粒。
用于将酶原形式的人蛋白质C活化为活化人蛋白质C衍生物的方法是本领域内熟知的老方法。蛋白质C可由凝血酶单独激活，或由凝血酶/凝血调理素复合物，或用Russell′s蝰蛇毒液或采用各种其他手段激活。在用凝血酶激活后，可利用总酰氨水解分析或抗凝分析测定人蛋白质C衍生物的活性。凝血酶激活试验和蛋白质C分析试验(酰氨水解和抗凝)是按照Grinnell等人(Bio/Technology 51187-1192，1987)的方法完成的，该文献的全部内容引入本文作为参考。
可用本发明的重组人蛋白质C衍生物预防和治疗各种各样的涉及血管内凝血的获得性疾病，包括深层静脉血栓形成、肺栓塞、外周动脉血栓形成、起源于心脏或外周动脉的血栓、急性心肌梗塞、血栓形成性中风、不稳定性心绞痛、外周血管手术、器官移植和传播性血管内凝血。这些蛋白质C衍生物也可有效地用于治疗大量表现出阵发性深层静脉血栓形成的杂合蛋白质C缺陷症患者，以及用于治疗患有暴发性紫癜的纯合蛋白质C缺陷症患者。活化蛋白质C衍生物的另一种治疗应用是预防目前用低剂量肝素治疗的深层静脉血栓形成和肺栓塞。
按照已知方法可以将本发明的衍生物及其活化形式配制成可药用的组合物，使本发明的人蛋白质C衍生物或活化的蛋白质C衍生物与可药用的载体混合。合适的载体及其配制，包括其他人蛋白质(如人血清白蛋白)，由Remington′s Pharmace utical Sciences(1980年第16版，Mack Publishing Co.，Osol等人编，引入本文作为参考)作了描述。这样的组合物含有有效量的蛋白质C衍生物或其活化形式，以及适量的载体，以便制备适于有效给予宿主的可药用组合物。蛋白质C衍生物组合物可非肠道给药，或者通过可确保以有效形式释放到血流中的其他方法给药。
下面提供的实施例作为说明本发明的手段，不要误认为是限制本发明。
实施例1人蛋白质C衍生物的制备基本上按照Bang等人的美国专利4，992，373(引入本文作为参考)的方法，从大肠杆菌细胞中分离本发明的表达载体，然后转化到293细胞中，在37℃下选择转化体，然后培养，以制备人蛋白质C衍生物。基本上按照Yan的美国专利4，981，952(引入本文作为参考)的方法从细胞培养上清液中纯化出衍生物。
实施例2抗凝活性按照Parkinson等人(J.Biol.Chem.26512602-12610，1990，引入本文作为参考)的描述，用10nM凝血酶与可溶性重组人凝血调理素TMD-75的复合物激活，获得完全激活的蛋白质C。利用活化的部分凝血致活酶时间凝血分析法测定活化分子的抗凝活性。结果列于表Ⅱ中。
表Ⅱ蛋白质C 抗凝活性 相对活性(单位/mg)野生型 325+/-65 1Q313 577+/-17 1.8LIN 289+/-13 0.8F167 283+/-27 0.9FLIN 313+/-65 1FLIN-Q313 552+/-37 1.7实施例3活化速率在含有20mM Tris pH7.4、0.15M NaCl、0.1mg/ml BSA和3mM CaCl2的反应混合物中，用人凝血酶(10nM)测定活化速率。在活化反应中纯化蛋白质C(野生型和衍生物)的浓度是0.81至1.61μM。在不同的时间点从活化反应混合物中移出等份样品到96孔平板上测定活化速率，在加入终浓度为0.75mM的生色底物(S-2366)后，按在ThermoMax动力学微量滴定平板读数器(Molecular Devices)上405nm处光吸收单位/分的变化测定酰氨水解活性。利用测得的每一种蛋白质的比活性，将光密度/分钟变化值换算为活化蛋白质C的生成量，并相对于活化时间作图，从而测出活化速率。在所有试验中活化蛋白质C的生成量低于总起始材料的10%。结果列于表Ⅲ中。
表Ⅲ蛋白质C 由凝血酶 相对活化速度率活化的速率(ng/分)野生型 0.53+/-0.1 1Q329 0.23a0.4Q313 1.1+/-0.2 2Q3Q9 1.62a3.3LIN 2.2+/-0.4 4F167 6.3+/-1.0 12FLIN 15.9+/-4.0 30FLIN-Q313 32.3+/-6.4 61FLIN-Q3Q9 45.0a84a.没有标准偏差的速率来自n＝2的实验另外，用凝血酶和凝血调理素以相同的分析系统测定了相对活化速率。所使用的凝血调理素分子是Parkinson等人(见上文)的可溶性人凝血调理素。结果列于表Ⅳ中。
表Ⅳ蛋白质C 由凝血酶和凝血调理素活化的相对速率野生型 1aQ313 2.6+/-0.6LIN 2.1+/-0.2F167 3.5+/-0.8FLIN 2.7aFLIN-Q313 9.2+/-1.0a.没有标准偏差的速率来自n＝2的实验实施例4在人血浆凝固中的抗凝活性以20nM的浓度将野生型人蛋白质C和FLIN-Q313衍生物与Helena标准APTT试剂一起加入到人血浆中，并在37℃保温5分钟。加入终浓度为8mM的CaCl2启动血浆的凝固，并测定凝固时间。在同时进行的平行实验中，将能中和活化蛋白质C活性的单克隆抗体加入到对照血浆以及含有野生型蛋白质C酶原或FLIN-Q313的血浆中。结果列于表Ⅴ。
表Ⅴ蛋白质C 凝固时间(秒)+Ab -Ab无(对照) 30+/-4 32+/-3野生型 36+/-4 32+/-5FLIN-Q313 36+/-4 75+/-5通过改变野生型人蛋白质C和FLIN-Q313衍生物的浓度测定在血浆凝固中诱导的凝固活性水平，数据以延长的凝固时间来表示。该分析中的基础凝固时间为27至33秒。结果列于表Ⅵ中。
表Ⅵ蛋白质C 剂量(nM) 延长的凝固时间(秒)野生型 8 0+/-3FLIN-Q313 8 20+/-6野生型 16 0+/-5FLIN-Q313 16 37+/-+6野生型 32 0+/-6FLIN-Q313 32 77+/-6野生型 64 0+/-5FLIN-Q313 64 235+/-6实施例5相对半存留期的测定通过用100nM活化人蛋白质C、活化FLIN-Q313或酶原(非活化)FLIN-Q313与正常人血浆(加了柠檬酸盐)共同保温，测定血浆中人蛋白质C的抑制。在最终反应中血浆浓度为90%(V/V)，其余体积由含有3mM CaCl2、150mM NaCl、20mM Tris pH7.4和1mg/ml BSA的缓冲液组成。在所选择的时间点取等份样品，用终浓度为1mM的S-2366测定活化蛋白质C的酰氨水解活性，或通过活化部分凝血致活酶时间来测定活化蛋白质C活性。按照实施例4中描述的方法测定FLIN-Q313的凝块激活活性水平。在约25分钟后，活化蛋白质C和活化FLIN-Q313的活性损失都在50%以上，而酶原FLIN-Q313在45分钟后仍保留至少80%活性。
权利要求
1.一种人蛋白质C衍生物，它选自Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9。
2.权利要求1的人蛋白质C衍生物，它是Q3Q9。
3.权利要求1的人蛋白质C衍生物，它是FLIN-Q313。
4.权利要求1的人蛋白质C衍生物，它是FLIN-Q3Q9。
5.一种重组DNA分子，它编码权利要求1的人蛋白质C衍生物。
6.权利要求5的重组DNA分子，它编码蛋白质C衍生物Q3Q9。
7.权利要求5的重组DNA分子，它编码蛋白质C衍生物FLIN-Q313。
8.权利要求5的重组DNA分子，它编码蛋白质C衍生物FLIN-Q3Q9。
9.权利要求5的重组DNA分子，它是一种质粒。
10.权利要求9的重组DNA分子，它选自pGT-h-Q3Q9质粒(NRRL B-18938)、pGT-h-FLIN-Q313质粒(NRRL B-18939)、pGT-h-FLIN-Q3Q9质粒(NRRL B-18940)。
11.一种宿主细胞，它已用权利要求9的重组DNA质粒转化。
12.权利要求11的宿主细胞，它选自293细胞和大肠杆菌细胞。
13.权利要求12的宿主细胞，它是293/pGT-h-Q3Q9、293/pGT-h-FLIN-Q313、293/pGT-h-FLIN-Q3Q9、大肠杆菌K12 AG1/pGT-h-Q3Q9(NRRL B-18938)、大肠杆菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313(NRRL B-18939)和大肠杆菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9(NRRL B-18940)。
14.一种药物制剂，它含有作为活性成分的选自Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9的蛋白质C衍生物，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
全文摘要
描述了具有高活性并且对凝血酶活化作用的依赖性较低的人蛋白质C衍生物。这些衍生物在其较高的活化速率、功能活性和碳水化合物结构方面与天然形式的人蛋白质C不同。还描述了用于制备这些衍生物的DNA化合物、转移载体、表达载体以及转化体。
文档编号C12N1/21GK1080658SQ9310621
公开日1994年1月12日 申请日期1993年5月20日 优先权日1992年5月21日
发明者B·E·杰里茨, B·W·格林内尔 申请人:伊莱利利公司