专利名称：识别表皮生长因子受体的新的单克隆抗体，生产这种抗体的细胞和方法以含有这种抗体 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体领域并提供一种筛选产生能识别EGF受体(一种存在于上皮组织来源的正常细胞和肿瘤细胞中的抗原)的单克隆抗体的杂合体的方法。这类抗体具有优越的性能，并可将其用于恶性肿瘤和其它疾病的诊断、治疗和研究。
本发明还涉及使用了这种抗体的治疗用和诊断用组合物。
表皮生长因子(EGF)是一种能刺激表皮细胞和间质细胞增殖、分子量为6KD、由53个氨基酸组成的多肽，它一直被认为是与恶性转化有关的生长因子之一(Cohen S.，Carpenter G.，PNAS USA 72，1317，1975)。这种作用主要是通过其膜受体(一种由1，186个氨基酸组成的重170KD的糖蛋白)实现的，表皮生长因子受体(EGF-R)在癌症研究中越来越受到亲睐(Carpenter G.，Cohen S.,Recepter Regulation(B Serie)Vol 13,41,Lefkowitz,Ed.Chapman and Hall)。
在表皮组织来源的恶性肿瘤，如乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺癌、脑肿瘤和食道癌中检测到高水平的EGF-受体。EGF及其受体在调节肿瘤生长中的作用尚不清楚，不过据信EGF-受体在肿瘤细胞中的表达提供了一种自泌(autocrine)生长刺激机理，这种刺激会导致无约束的增殖(Schlessinger J.，Schreiber A.B.,Levi A.，Liberman T.,Yarden Y.Crit.Rev.Biochem.1983,14(2)93-111)。
肿瘤细胞中EGF-R的出现已被证实是人类乳腺癌预后不良的标志。而且还认为这种生长因子受体还拓宽了乳腺癌中激素依赖性的概念(Perez R.，Pascual M.R.,Maclas A.,Lage A.,Breast Cancer Research and Treatment 4,189-193,1984)。
已有一些用抗EGF受体的单克隆抗体(MAbs)进行研究的报道，这些研究特别是选择有阻断EGF同EGF-R结合的抗原识别能力的单克隆抗体。用这种抗体进行的一些初步研究已经表明，EGF受体具有优先在表皮组织来源的肿瘤中累积的特点。因此在这类肿瘤的免疫检测和免疫治疗中应用这种单克隆抗体具有潜在价值(Mondelsohn)J.，Masui H.,Macleod C.Proc.Am.Assoc.Can.Res.26,287-294,1985;Gullick W.J.,Marsden J.J.,Whitle N.,Ward B.，Borrow,L.and Waterfield M.D.Cancer Research 46:285-292,1985)。
采用生物反应效应物来设计针对不同疾病的治疗方案，构成了极为诱人的可选方案。单克隆抗体包括一组用于此种目的的生物分子(Deush K.,Mauthe B.,Reiter C.,Endres N.,Classen M.,Riethmuller G.,Proceeding of the International Congress of Immunollogy,Budapost Hungary,11,1992)。很多研究人员都研究了采用单克隆抗体的免疫治疗法，以测试其在治疗不同的部位肿瘤时的效果(Frodin J.E.,Philstedt P.,Lefvert A.K.,Mellstedt H.Hybridoma,Vol 7,No.4,1988)。已提出过多种治疗方案，其中包括天然的、与药物结合使用的、双特异性的、抗独特型和人的单克隆抗体。分化较差的表皮肿瘤中EGF受体的高表达，提供了将这种天然抗体或者与药物、毒素或放射核素结合以后作为用于肿瘤特异治疗方法的可能性。(Vollmar A.M.,Banker D.E.,Mendelsohn J.,Herschman.H.R.J.Cell Physil.,1987,131,418-428)。采用这种单克隆抗体治疗恶性肿瘤的临床试验正在进展之中(Magdelenat H.,Delarue J.Y.,Mady E.,Faillot T.,Vega F.,Poisson M.,Proceedings of VI Conference of MESTOM International Journal of Tumor Markers,Nice,France,1991年11月)。
已被用于治疗的抗EGF受体的抗体，首先要选择其抗原识别作用，通过这一抗原识别过程产生抑制肿瘤生长的作用。该抑制作用是通过涉及EGF受体的信号转导机制发生的(Mendolsohn J.,Kawamoto T.，Sato G.， Sato D.;Schlesinger J.Civol D.，Kris R.,美国申请号23988，EPO-0359282)。
另一方面，某些神经节苷被视为EGF受体磷酸化作用抑制剂和导致细胞增殖抑制的细胞信号转导抑制剂。这表明，神经节苷脂可作为不同部位肿瘤，尤其是具有EGF受体的肿瘤的有效治疗剂(Daris R.J.，J.Biol.Chem.1990年，26512059-12066)。
此外，还描述了某些肿瘤中，包括其自身生长因子对增殖作用的，自泌生长控制作用的可能性。这启发我们采用这种机理，通过抗生长因子和生长因子受体的单克隆抗体来抑制肿瘤生长，并将其作为治疗恶性肿瘤的另一个可行方案(Todaro C.J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5258-5262,1980)。而且，本发明的作者已获得了乳腺瘤中存在EGF和EGF受体的实验证据(未发表)。
迄今为止，还没有人评价筛选能产生具有如下理想特征单克隆抗体的杂交瘤的可行性抗原识别能力，补体介导的或由抗体产生的细胞毒性作用，肿瘤生长抑制作用以及通过与神经节苷脂或抗EGF的单克隆抗体结合后对某些细胞系增殖抑制的增效作用。仅对通过抑制由EGF受体所产生的转导信号来抑制肿瘤生长的可能性有所评价。
在迄今所采用的方法中，已根据抗原识别性筛选出了杂交体，此外，还通过用肿瘤细胞系所产生的抗原进行免疫获得了抗体，并根据由这种抗原识别作用所产生的抗肿瘤的活性对其进行了筛选。
本领域的研究者没有考虑到这种单克隆抗体通过补体介导或抗体依赖细胞毒作用所可能产生的抗肿瘤作用，也没有考虑到将这种抗EGF受体的单克隆抗体与其它生物分子如神经节苷脂或生长因子或其它抗生长因子的抗体结合应用以产生抑制癌细胞系增殖的增效作用。
本发明提供了一种能产生具有数量上良好特性的单克隆抗体的杂交体的筛选方法，可将其用于发展诊断系统、治疗和研究。
如上所述，本发明的主要目的是提供具有优良特征的单克隆抗体，这种抗体可以高亲和力识别人体胎盘或A-431细胞中的EGF-受体，能够抑制EGF与受体结合，它还具有产生抗体依赖的细胞作用的能力，产生补体介导的细胞毒作用的能力，它还具有抑制某些细胞系中肿瘤生长的特征，当其与神经节苷脂或抗EGF的单克隆抗体结合使用时还表现出抑制这些细胞系增殖的增效作用。
本发明的另一个目的是提供一种筛选能产生上述单克隆抗体的新的杂交细胞系的方法。
本发明再一个目的是提供符合筛选标准的能产生单克隆抗体的杂交瘤。
本发明最重要的目的之一是提供一种含有这种抗EGF受体的单克隆抗体和神经节苷脂或抗EGF单克隆抗体的药物组合物，它会产生抑制细胞生长的增效作用。
这种制剂的重要性体现在在治疗肺癌、表皮组织、神经系统来源任何其它肿瘤或具有EGF-受体的任何其它肿瘤时均有显著效果。
因此，本发明提供了获得以这种方式制备单克隆抗体的筛选方法，以及用于诊断和治疗目的的、采用这种抗体的组合物。
本发明包括用部分纯化的人体胎盘表皮生长因子受体成分使小鼠免疫;切除其脾脏并制备成细胞悬液;在融合促进剂存在的条件下使脾细胞与骨髓瘤细胞融合;稀释并培养这些细胞;确定含有上述杂交瘤的上清液;筛选并克隆能产生具有如下特征的抗体的杂交瘤能识别EGF受体。具有高亲和力，具有抑制EGF同其受体结合的能力，具有产生抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用的能力，具有抑制某些细胞系中肿瘤的生长，并在与神经节苷脂或抗EGF的单克隆抗体结合使用抑制这些细胞系增殖时表现出增效作用的能力从上述上清液中回收抗体并收集含有所需抗体的恶性腹水和血清。
通过以下的说明和实施例可更好地理解杂交瘤和它所产生的抗体的筛选制备和特征。
杂交瘤制备方法通常包括下述步骤，其中包括筛选杂交瘤的方法。
A.用部分纯化的人体胎盘的EGF-R成分使小鼠免疫。尽管已证实雌性Balb/C小鼠是最好的，但其它品系的小鼠也可使用。免疫程序和抗原浓度必需认真测量，以制备有用量的，适当刺激的脾细胞。已证实好用的方法之一是在间隔0天、14天、21天和28天的时候，每只小鼠用溶于0.2ml磷酸缓冲的生理盐溶液中的25μg的免疫原进行免疫，在0天时用完全佐剂，在14、21和28天时用不完全佐剂。在细胞融合之前最后一次接种是静脉注射50μg的免疫原。
B.切除每只免疫小鼠的脾脏并用适量的培养基制备脾细胞悬浮液。按照现有的实验技术每个脾脏用大约50ml培养基是合适的。
C.在融合剂的作用下，将脾细胞悬浮液与适当细胞系的鼠骨髓瘤细胞融合。优选比例为，每个骨髓瘤细胞10个脾细胞。每108个细胞采用总体积约为0.5-ml的融合培养基是恰当的。多种鼠类骨髓瘤细胞系是公认的并可从学术机构或专业保存所获得。不过所用细胞系应当是“抗药”型的，这样，融合的骨髓瘤细胞在选择培养基中不能存活，而杂交细胞则可以存活下来。最常用的种类是抗8-氮鸟嘌呤的细胞系，它缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-核苷酸转移酶，因此，在HAT培养基(次黄嘌呤-氨喋呤和胸苷)中不能存活。也有普遍采用所谓“非分泌型”骨髓瘤细胞系的，因为它本身不产生抗体。不过，如有必要，也可采用能分泌抗体的类型。
尽管优选的融合促进剂是平均分子量约为1000-4000的聚乙二醇，也可采用其它类型的促进剂。
D.将非融合脾细胞、非融合骨髓瘤细胞和融合细胞的混合物稀释并于培养板孔中以非融合骨髓瘤细胞不能存活选择性培养基(即HAT)培养。一周之后，非融合脾细胞停止繁殖。另一方面，融合细胞由于从亲代骨髓瘤继承来的恶性特征以及亲代脾细胞在选择环境中的存活能力而能够继承繁殖。
E.杂交瘤筛选方法1.检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定抗体的存在，这种抗体能以高的亲和力选择性地识别人体胎盘的EGF受体和A-431肿瘤细胞系中的这种受体，这些单克隆抗体还能够抑制EGF与受体结合。这种检测可以按照优选的放射性受体测定法或免疫测定法进行，以富含EGF受体的细胞系和按照下述的亲和纯化方法部分纯化过的人体胎盘中的这种受体为抗原。
2.检测每孔中的杂交瘤上清液，以确定具有抑制肺癌细胞肿瘤生长特性的抗体的存在。将不同浓度的单克隆抗体加入细胞悬浮液中，并用一个不加抗体，另一个加入不相关抗体的对照组进行比较。蛋白质浓度的测定由Lowry-Rosebrough法进行，但是任何测定总蛋白浓度的方法均可使用。
3.检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定具有产生抗体依赖细胞毒性特征的抗体的存在，用标准测量方法测量这种活性，该方法采用了51Cr标记的靶细胞，效应器细胞和不同浓度的单克隆抗体。
4.检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定是否存在具有产生补体介导的细胞毒性特征的抗体的存在。采用标准的测量方法测量这种活性，该方法利用了51Cr标记的靶细胞、兔的补体和不同浓度的单克隆抗体。
5.检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定是否存在具有在与神经节苷脂共同使用时产生抑制细胞增殖的增效作用特征的抗体。
获得细胞悬浮液并将其再悬浮于培养基中，以0.5～50μM的浓度加入神经节苷脂，然后以10～100μg/ml的浓度加入单克隆抗体(上清液);在第3和第6天测量总蛋白质浓度，最好采用Lowry-Rosebrough方法，但是任何其它方法均可采用。
6.检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定是否存在具有在与抗EGF的单克隆抗体共同使用时产生抑制细胞增殖的增效作用特征的抗体。
可以获得细胞悬浮液并再悬浮于培养基中，以适当浓度加入抗EGF的Mab，并且将该单克隆抗体以10～100μg/ml的浓度加入。在第3天和第6天时测量总蛋白质浓度，采用Lowry-Rosebrough方法较好，但是，测量总蛋白质浓度的任何方法均可使用。
F.筛选(即通过限制性稀释)和克隆产生该抗体的杂交瘤。
一旦理想的杂交瘤被筛选和克隆至少2次以后，即可用下列两种方法之一制备抗体。
a)单克隆抗体可以通过在适当培养基中将杂交瘤体外培养一指定时间，随后从上清液中回收所需抗体进行制备。适当的培养基和培养时间是已知的或易于确定的。这种体外培养技术所产生的基本上是单一特异抗体，基本上免除了抗人体特异性免疫球蛋白。由于培养基中含有少量的异种血清(胎牛血清或新生牛血清)，也有少量其它免疫球蛋白存在。这种体外方法可以在生物反应器中按比例地扩大，以获得适量的所需单克隆抗体。
b)另一种生产方法包括将杂交瘤注射到同基因的小鼠体内。在培养一个适当时期之后，会导致能产生抗体的非坚固型肿瘤的形成。这样就可以在鼠类宿主的血液和腹膜渗出液(腹水)中产生高浓度的所需抗体(5-20mg/ml)。虽然在这种宿主的血液和腹水中也存在正常抗体，但是单克隆抗体的浓度更高一些。此外，由于这种正常抗体没有抗人体的特异性，所得到的单克隆抗体基本上不受任何抗人体免疫球蛋白的污染。由骨髓瘤轻链掺入所产生的免疫球蛋白是非特异性的无关肽类，它仅仅稀释单克隆抗体而不影响基特异性。
与此一致的是，本发明提供了能够产生具有如下特征的单克隆抗体的杂交瘤细胞系这种抗体能够以高亲和力识别EGF受体，能够抑制EGF同受体结合，能够产生抗体依赖的细胞毒性，能够产生补体介导的细胞毒性，可以抑制某些细胞系的肿瘤的生长，当与神经节苷脂或抗EGF的单克隆抗体共同使用时能产生抑制这种肿瘤生长的增效作用。
上述抗体可被用于发展免疫检测技术，用于发展采用生物分子的新治疗方法，用于研究抗原的分子拓扑结构，用于发展抗独特型和人化的抗体，研究它在免疫网络中独特型调控中的作用，以及在免疫纯化和它能识别的抗原结构特征分析上的作用。
G.含有所获得的单克隆抗体，能产生免疫作用的治疗组合物的获得。
一旦得到纯化的抗体，即可开发出含有有效量的任何单克隆抗体治疗用组合物，这些单克隆抗体是由通过杂交瘤筛选方法获得的杂交瘤产生的，且该组合物具有免疫作用。按照这些条件所筛选的抗体具有补体介导的细胞毒性和抗体依赖的细胞毒性等特征。这些可采用标准方法加以证实;以用51Cr标记的A-431细胞系作为靶细胞。将适当浓度的靶细胞用移液管移到有单克隆抗体的微培养皿上。补体来源可以是加入培养基中的人血清或兔血清。H-125细胞系与MAb的培养表明，在存在补体时有细胞毒作用。由抗体介导的细胞毒性是以Balb/C小鼠腹膜巨噬细胞作为效应细胞实现的，从而得到细胞分解效应。
在该制剂中，应使用药物载体，这些载体可以是常规药典中应用的任何一种载体，或者是麦芽糖、或海藻糖、蔗糖或聚乙二醇800或将这些载体以不同浓度与Zn离子剂结合使用。该制剂可由所说的抗体或其片段(Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2)制成，或由人化的、嵌合的、“重新构型的”、双特异性的抗体或与毒素、放射性核素或任何其它可用药物结合的上述任何一种抗体制成，或者它可由所获得的、针对所说抗体的抗独特型抗体(AB2、AB)制成;以用于治疗或预防恶性肿瘤或肿瘤前疾病，尤其是发生在中枢神经系统中的肿瘤、头部和颈部的肿瘤，以及乳腺和肺部腺癌。
H.由所得单克隆抗体与神经节苷脂组合所获得的治疗组合物。
一旦获得纯化的单克隆抗体，即可发出含有效量的任何单克隆抗体的治疗用组合物，这些单克隆抗体是由通过杂交瘤筛选方法获得的杂交瘤生产的，它还包括适当浓度的神经节苷脂。
已经显示通过将这种单克隆抗体与不同神经节苷脂混合使用所产生的增效作用。不同浓度的神经节苷脂在与抗EGF受体的单克隆抗体其同使用时会产生抑制细胞增殖的生长抑制作用。
分别从H-125和U-1752细胞系得到细胞悬浮液，并将其再悬浮于培养基中。以0.5-50μM的浓度加入神经节苷脂并以10-100μg/ml的浓度加入抗EGF-受体的单克隆抗体。
在第3天和第6天用Lowry-Rosebrough方法(Loury D.H.1951 J.Biol.Chem.193:265)测定总蛋白质浓度，不过，其它任何方法均可采用。与试验中所用对照相比，观察到了神经节苷脂-抗EGF受体的组合物在抑制肺癌细胞系增殖方面的增效作用。
与对照相比，对增殖的抑制约为100%，结合后所产生的作用大于两种分子单独使用时作用的简单相加。
在该制剂中应当采用药品载体，它可以是常规的药典中所用的任一种载体，或麦芽糖或海藻糖、蔗糖或聚乙二醇-800或是上述载体以不同浓度与Zn离子的混合物。这种制剂可由上述抗体或它的片段(Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2)制成，或是由人化的、嵌合的、“重新构形的”、双特异性抗体或与毒素、放射性核素或任何可用药品结合的上述任何抗体制成，或是由抗上述抗体的抗独特型抗体(AB2、AB)制成;用于治疗或预防恶性肿瘤或肿瘤前疾病，特别是中枢神经系统肿瘤、头部和颈部肿瘤，以及乳腺和肺部腺癌。
Ⅰ.由所得单克隆抗体与抗EGF的单克隆抗体组合物所得到的治疗组合物。
一旦得到纯化的抗体，便可开发出含有通过杂交瘤筛选方法所得到的杂交瘤产生的、有效量的任何单克隆抗体的治疗用组合物，包括适当浓度抗EGF的单克隆抗体，和药物载体，这些载体可以是常规药典中所采用的，或麦芽糖、或海藻糖、蔗糖或聚乙二醇-800或上述物质以不同浓度与Zn离子的混合物。该制剂可由上述抗体或其片段(Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2)制成，或是由人化的、嵌合的、“重新构形的”、双特异性抗体制成，或是由抗上述抗体的抗独特型抗体(AB2、AB)制成;用于治疗或预防恶性肿瘤或肿瘤前疾病，特别是中枢神经系统肿瘤、头颈部肿瘤，以及乳腺和肺部腺癌。
实施例1杂交瘤筛选方法a)根据抗原识别方法筛选杂交瘤。
对每个孔中杂交瘤上清液进行测定，以确定是否存在这样一种抗体它能以高亲和力选择性地识别表皮组织来源的人体胎盘EGF受体和A-431细胞系EGF受体，还可抑制EGF同受体结合。
在细胞融合之后，将细胞于37℃，5%CO2的潮湿条件下在选择性HAT培养基(次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷)中培养。
3周之后，从培养物中取出10μl含有杂交瘤的上清液并将其加入预先涂有含有EGF受体的胎盘膜提取物或A-431细胞系提取物的聚氯乙稀板上的小孔中，A-431细胞系的保藏号为ATCC-CRL-1555。通过固相、间接的免疫酶学测定法检测能与在膜提取物中表达的抗原反应的抗体。通过用部分纯化的、可溶EGF受体涂敷聚氯乙烯板固化抗原。采用10mM HEPES,PH7.5的缓冲液。用作第二抗体的探针中结合有抗小鼠抗体(Amersham)的过氧化物酶。
筛选含有能与含受体的膜提取物反应的抗体的杂交瘤上清液，并按照有限稀释方法在调理细胞存在的条件下将其克隆两次。
该方法具有同时筛选针对以下两种抗原的抗体的特征来自人体胎盘的受体，它具有正常的抗原决定簇;来自A-431细胞系的受体，其抗原决定簇在恶性发展期间出现，这意味着，通过筛选方法在抗体中选择的抗原决定簇存在于正常组织里的受体分子中，而且还出现在上皮组织来源的肿瘤组织中的大多数受体分子中。
b)根据抗肿瘤活性选择杂交瘤检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定是否存在能抑制肺癌细胞系U-1752和H-125(NCI，Bethersda,Maryland)的肿瘤生长的抗体。这些细胞系的增殖表现出对EGF的依赖性。所用培养基是补充5-10%牛血清的RPMI-1640(Gibco,USA)。将上述细胞在恒温箱中，于37℃在潮湿的CO2空气(95%-5%)中培养。
测定单克隆抗体对在胰蛋白酶悬浮液中的细胞以及以2.5×104个细胞/ml的浓度再悬浮于培养基的细胞中的抑制效应，其中，加入不同浓度的单克隆抗体10、30和100μg/ml。同样以100μg/ml的浓度用无关的抗体对对照组进行研究。将细胞悬浮液放在24孔的培养板上(每孔1ml)，并对每个样品测试3次。为每个细胞系制备培养板并于不同的处理时间(1、3、5和7天)进行分析。根据总蛋白质的定量测定法(D∶H∶Lowry)测定总细胞数。
与对照相比较，对H-125和U-1752肺癌细胞系增殖的抑制作用达50%，这一结果可从
图12上出。
该选择方法的这一部分具有这样的特征所筛选的杂交瘤产生的单克隆抗体具有对抗原的特异识别力，同时具有抑制肿瘤生长的能力。
c)根据产生抗体依赖性细胞毒性的能力筛选杂交瘤。
检测每个孔中的杂交瘤上清液，以确定能产生抗体依赖性细胞毒性的抗体的存在。采用测定这种活性的标准技术;以用51Cr(100μCi)标记的A-431细胞系为靶细胞。
效应细胞是采用Ficoll-Hypaque梯度制备的正常成年人的血细胞，其中，从外周血液中分离出单核细胞，清洗3次并调整至2001的效应细胞/靶细胞的比例。将浓度为104的靶细胞移液至含有25μl单克隆抗体(腹水液稀释1/10)的96孔培养板上。将有靶细胞和抗体的板在4℃培养30分钟。将效应细胞(100μl)加到板上并立即离心，100×g，2分钟。然后将其在37℃、含有5-95% CO2空气的潮湿恒温箱中培养4小时。由本实验可以证实有22%的抗体依赖性抑制作用。
在该筛选方法的此部分，已经获得了产生单克隆抗体的杂交瘤，它同时具有三个特征抗原识别能力，抑制肿瘤生长的能力，同时还具有抗体依赖性细胞毒性。
d)根据产生补体介导的细胞毒性选择杂交瘤。
采用标准测量方法检测每个孔中的上清液，以确定能产生补体介导的细胞毒性的抗体的存在将用51Cr(100μCi)标记的A-431细胞系用作靶细胞。
将浓度为104的靶细胞移液至含有25μl单克隆抗体(腹水液稀释1/10倍)的96孔培养板上。
补体来源为100μl在培养基中浓度为25%的兔血清。将其放在潮湿的、具有5-95%CO2空气的、37℃的恒温箱中培养4小时。然后将培养板离心，在γ-计数器上测量100μl上清液每分计数(cpm)。
试验了抗体的几种工作液，以检验其最大毒性值。
在该实验中证实了有60%的补体介导的抑制作用，如图14所示。
e)根据与N-乙酰GM3合用后产生增效作用的能力筛选杂交瘤。
将表达104-105个EGF受体结合位点并分类为肺腺癌的H-125细胞系用作筛选的实验模型。获得浓度为104-105个细胞/ml的细胞悬浮液，并将其再悬浮于培养基中。然后以5μM的浓度加入N-乙酰GM3，以30μg/ml的浓度加入抗EGF受体的单克隆抗体。
在第3天和第6天上用Lowry-Rosebrough方法测量总蛋白质浓度。
与本试验中所用的对照相比，可看出N-乙酰GM3-抗EGF受体的单克隆抗体合用在抑制肺癌细胞系增殖方面的增效作用。与对照相比，对增殖的抑制几乎达100%。因此，由这种合用所产生的作用比这两种分子独自所起作用的简单相加大得多。
该结果可从图15中看出。
f)根据与抗EGF的单克隆抗体合用后产生增效作用的能力筛选杂交瘤。
将表达104-105个EGF受体结合位点并分类为肺腺癌的H-125细胞系用作筛选的实验模型。获得浓度为104-105个细胞/ml的细胞悬浮液，并将其再悬浮于培养基中。以5μg/ml的浓度加入抗EGF的MAbs，以30μg/ml的浓度加入抗EGF受体的单克隆抗体。在第3天和第6天采用Lowry-Rosebrough方法测量总蛋白质浓度。
与该试验所采用的对照相比较，可以看出抗EGF的MAbs-抗EGF受体的单克隆抗体合用在抑制肺癌细胞系增殖方面的增效作用。
根据这种筛选方法所得杂交瘤产生的抗体具有优越的特性，并使其具有如下区别特征以高亲和力识别EGF受体抗原;抗体依赖的细胞毒性;补体介导的细胞毒性;抑制细胞系肿瘤生长的能力以及与N-乙酰GM3或抗EGF的MAbs合用所产生增效作用的能力。
实施例2通过该筛选方法所获得单克隆抗体的生化特征。
所得单克隆抗体是IgG2a型免疫球蛋白，它是由SP2/Ag14鼠骨髓瘤与用部分纯化的人体胎盘EGF受体免疫过和Balb/C鼠脾淋巴细胞的融合细胞所分泌的。溶解EGF受体的纯化是通过亲和层析法纯化的。简言之在室温下在1小时内将胎盘粗制膜馏份溶解在Tris-HCL 20mM缓冲液中，PH7.4，含甘油10%、Triton X-1001%。匀浆以10，000×g离心，上清液加到EGF亲和基质上。富含EGF的馏份用PH9.7，含有10%甘油和0.1% Triton X-100溶液的5mM乙醇胺缓冲液洗脱。这种富含可溶性EGF受体的馏分具有与125Ⅰ-EGF结合的能力，并在SDS平板电泳时出现170kd的主带。每次处理100克。每克湿组织的平均产率是15-25μg部分纯化的EGF受体。
这种单克隆抗体具有如下特征根据所得到的半饱和浓度曲线计算出KD值为10-9M的对受体的高亲和力，如图1所示，该亲和力类似同EGF的受体亲和力。
它可以抑制125Ⅰ-EGF′S与采用人体胎盘微粒体馏分的膜受体结合(图2和4)，从其10-8MKi值可以推论出其结合位点与表皮生长因子的不同，且其抑制作用是通过构型效应或位阻效应激发的。这种单克隆抗体可抑制EGF对A-431细胞系的作用，在有增效剂如γ-IFN存在时也是如此(图6和7)。这种MAbs还能够抑制依赖于EGF的NRK细胞的无性生长，并能抑制被视为细胞增殖信号转导的关键步骤的依赖于EGF受体的自磷酸化(图8)，这证实了这种单克隆抗体所起的EGF-拮抗作用。
证实这种作用的研究由Mab及其通过木瓜蛋白酶消化的Fab片段进行(图9和10)。这种作用被证实是剂量依赖性的。该片段保留抑制EGF细胞增殖的相同能力。
这种单克隆抗体抑制不同细胞系增殖的能力同样得到证实。在所研究的肺癌细胞系(M-125和U-1752)中发现，当这种抗体的施用浓度为10μg/时，生长略有减弱，与对照相比无明显差异;然后，当使用浓度为30μg/ml时，实现了对生长的抑制，在培养到第3天时保持稳定，在第5天时，与对照相比表现出50%的抑制(图12和图13)。
这种单克隆抗体还具有补体介导的细胞毒性和抗体依赖的细胞毒性。
通过与单克隆抗体一起培养H-125细胞系证实，在存在兔补体的情况下，当抗体浓度为12.5μg/ml时，细胞毒性作用为60%(图14)。抗体介导的细胞毒性试验是这样进行的以Balb/C鼠腹巨噬细胞为效应细胞，效应细胞靶细胞之比为1101，产生22%的细胞分解作用。
这种单克隆抗体与不同浓度的神经节苷脂合用所产生的增效作用也得到证实。这种结合能对细胞的增殖产生生长抑制作用。N-乙酰GM3以5μM的浓度添加，以30μg/ml的浓度添加Mab。
与该试验所用对照相比，观察到了N-乙酰GM3-抗EGF受体的单克隆抗体合用在抑制肺癌细胞系增殖方面的增效作用。
与对照相比，对增殖的抑制接近100%，这种合用所产生的作用大于将两种分子独自作用的简单相加的结果(图15)。
所获免疫球蛋白重链可变区的序列分析通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增至少2个独立的PCR样品，至少采用2个独立的PUC19克隆来确定序列。一旦轻链和重链的可变区得到扩增，将其克隆在PUC 19载体序列中，重链的序列得到确定。根据Kabat Database，该序列被分类成不同的组。
重链可变区的重新排序限定了EGF受体的抗原决定簇，该部位能被这种单克隆抗体识别。
实施例3通过该筛选方法所获得单克隆抗体的反应性特征。
选择新鲜组织用于研究，这些组织包括心脏、前列腺、肝、肺、肾、脾、卵巢、胰脏、脑、睾丸、肾上腺、垂体、淋巴节、髓质、甲疚腺、扁桃体、胃、小肠、结肠、皮肤、颌下腺、胎盘和小脑。还研究了几种神经组织、造血组织肿瘤和肉瘤。
将这些鲜组织在液氮中冷冻并在-20℃保存。采用苏木精-曙红染色的切片进行病理组织学检测研究。对用于病理组织学检测的部分连续切片采用免疫过氧化酶技术染色。
采用生物素-链球菌-抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物(Amersham,U.K.)验证组织的反应性。该研究包括阳性的部分(表皮部分)和阴性的部分(Tris缓冲的盐溶液)的对照。与酶反应后生成褐色沉淀，并可分成下列类型＊ 无反应(-);
＊ 轻度反应(+);
＊ 中度反应(++);
＊ 强反应(+++)。
从刚解剖的尸体上采取新鲜的正常组织，按照用胰脏和睾丸建立的模式来看，该组织的反应性是强度的。
从刚鲜剖的尸体上采取新鲜的正常组织，按照用胎盘、皮肤、前列腺、肝、肾、卵巢、甲状腺、小肠和非淋巴扁桃体组织所建立的模式来看，组织的反应性是中等强度的(见表1)。
按照所建立的模式，表皮瘤和中枢神经系统瘤如神经胶质瘤、脑膜瘤、恶性组织细胞瘤、神经纤维肉瘤，以及乳腺瘤和鼻咽瘤表现出强反应，而且与取自相同来源的正常组织相比浓度更高(表2)。
检测阳性只发生在含有受体的组织，这证实了对分子的抗原决定簇的识别是特异性的，以及其独特性和在其它抗原中缺乏相关的抗原决定簇。
实施例4能产生免疫作用的治疗用化合物的开发。
开发出了一种含有有效量的单克隆抗体的治疗用化合物，这种单克隆抗体是由通过杂交瘤筛选方法所获得的杂交瘤生产的，能产生抗体依赖性细胞毒性。为此，我们采用了测定这种活性的标准测量技术，将用51Cr的(100μCi)标记过的A-431细胞系用作靶细胞。效应细胞是血细胞，取自正常成年人，采用Ficell-Hypaque梯度制备，通过它从外围血液中分离出单核细胞，洗涤3次，并调整至2001的效应细胞/靶细胞之比。
将有靶细胞和抗体的培养板在4℃温度下培养30分钟。将效应细胞(100μl)加到该板上并立即以100Xg的速度离心2分钟。然后将其放在具有5-95%CO2空气的37℃的潮湿洹温箱中培养4小时。在γ-计数器上测量100μl上清液每分钟的计数(cpm)。
采用标准的测量方法以用51Cr放射性(100μCi)标记的A-431细胞为靶细胞，测量补体介导的细胞毒性。
将浓度为104的靶细胞移液至含有25μl被稀释1/10倍的单克隆抗体(腹水液)的96孔培养板上。
补体来源是在培养其中浓度为25%的100μl的兔血清。将其在具有5-95%的CO2空气的湿恒温箱中在37℃培养4小时。随后将培养板离心，并在γ-计数器上测量100μl上清液每分钟的计数。试验了几种抗体工作液，以找到其最大毒性。
这些实验表明，在有兔补体的条件下，浓度为12.5μg/ml时细胞毒性活性为59%，而且由腹膜巨噬细胞所进行的抗体介导的细胞毒性能产生22%的细胞分解效果。
该制剂包括一种药物载体，它含有2.55mg的一碱价磷酸钠，9.00mg二碱价磷酸钠，43.00mg氯化钠、1mg多乙氧基醚-80和5.00注射水。
实施例5含N-乙酰GM3的治疗用化合物的开发。
开发出了一种含有有效量的、由通过杂交瘤筛选方法所杂交瘤生产的单克隆抗体和N-乙酰GM3的治疗用化合物。
观察到N-乙酰GM3与单克隆抗体合用后在抑制肺癌细胞系增殖方面的增效作用。
为了实施本实验，获得了细胞悬浮液并将其再悬浮于培养基中，以5μM的浓度加入N-乙酰GM3，以30μg/ml的浓度加入Mab。在第3天和第6天用Lowry方法测量总蛋白。
与对照相比，对增殖的抑制为100%，而且所产生的效果大于简单的加性效应。
该制剂包括一种药物载体，它含有2.55mg的一碱价磷酸钠，9.00mg二碱价磷酸钠，43.00mg氯化钠，1mg多乙氧基醚-80和5.00ml注射水。
实施例6含抗EGF的MAB的治疗用化合物的开发。
开发出了一种含有有效量的、由通过杂交瘤筛选方法所获得杂交瘤所生产的单克隆抗体以及抗EGF的Mab和一种药物载体的治疗用组合物，该载体含有2.55mg-碱价磷酸钠，9.00mg二碱价磷酸钠，43.00mg氯化钠，1mg多乙氧基醚-80和5.00ml注射水。
图1表示对胎盘膜和A-431细胞馏分的固相ELISA期间所得到的饱和曲线。横座标轴线表示抗体浓度的对数。将一种无关的抗体作用作阴性对照(抗体浓度为0.5-7500ng/ml)。
图2表示通过放射受体分析法所得的位移曲线。竞争试验用人体胎盘的微粒体馏分和不同浓度的抗体以及阻性对照(抗细胞角蛋白单克隆抗体)进行。EGF位移曲线用作阳性对照。
图3表示单克隆抗体与A-431细胞纯化的EGF-R的免疫反应性测定(斑点吸印)。将纯化EGF-R(30ng/ml)和3.0μl、1.0μl、0.1μl试样加到硝酸纤维素上并与不同浓度的抗体孵育。
图4表示用125-Ⅰ标记的抗EGF受体的不同单克隆抗体之间的竞争试验。
图5表示采用人体胎盘微粒体馏分与不同浓度抗EGF-R的单克隆抗体所做的竞争试验。将用125-Ⅰ标记的EGF用作放射示踪物。
图6表示单克隆抗体对A-431细胞的作用。将细胞与EGF(1μg/ml);Gamma-IFN(100μg/ml);EGF+G-IFN;以及不同浓度的单克隆抗体单独或与Gamma-IFN的混合物一起孵育。在培养的第7天测定单层细胞里的蛋白质。
图7反映了单克隆抗体对EGF的生物活性的拮抗作用。将细胞与EGF(1μg/ml);Gamma-IFN(100μg/ml);EGF+G-IFN;以及合用用Gamma-IFN和EGF的单克隆抗体一起孵育。在培养的第7天测定单层细胞里的蛋白质。
图8表示因胎盘膜组织中由单克隆抗体所引起的对EGF激励的自磷酸化的抑制。膜与32P标记的ATP一起在无EGF(1道)或有EGF(2.8道)的情况下培养，并通过聚丙稀酰胺凝胶电泳和放射性自显影进行分析。通过在EGF-R中整合P-32观察到了Mab浓度增加的效应。2道和3道没有Mab;4道1.8μg/ml Mab;5道6μg/ml Mab;6道18μg/ml Mab;7道60μg/ml Mab; 8道180μg/ml Mab。
图9表示在A-431细胞中Fab片段具有与单克隆抗体一样能抑制EGF同它的受体结合的能力。采用人体胎盘的微粒体与不同浓度的Mab及其Fab进行竞争试验。Ⅰ-125标记的EGF被用作示踪物。
图10表示在对A-431细胞的EGF的拮抗效应方面Fab片段与天然单克隆抗体具有相同的能力。细胞与不同浓度的Mab及其Fab培养。在培养原第7天测定单层细胞的蛋白质。
图11表示乳腺癌的免疫细胞化学分析结果。侵入性导管癌上皮细胞着色较重。
图12表示Mab对H-125细胞系的作用;可看出对照组的生长加快(其生长速度翻了好几倍)。用最低浓度(10μg/ml)处理的组其生长仅略慢于对照组。用较高浓度处理的组表现出在第1、2天细胞有一些生长。在第3天开始，培养物进入无生长的稳定期，第5天，与对照相比，对生长的抑制为50%。
图13表示Mab对U-1752细胞系的作用。与对照相比，用最低浓度(10μg/ml)处理的组无生长差别。用较高浓度处理过的组在前1.2天表现出一些生长，在第3天开始，培养物进入无生长的稳定期，第5天，与对照相比，对生长的抑制为50%。
图14表示Mab在兔补体存在时对H-125细胞系的细胞毒性作用。
图15表示与对照相比，固定浓度的Mab与两种不同浓度X-乙酰-GM3合用的效果。
对照组1与抗EGF-R的MAb浓度相同的无关抗体。
对照组2和3含有相同浓度的同一种无关抗体和两种不同浓度的GM3。
对照组4仅含有浓度为30μg/ml的单克隆抗体。
对照组5和6含有浓度为30μg/ml的抗EGF受体的单克隆抗体的浓度分别为2.5和5μg/ml的N-乙酰GM3。
表1和2Mab对进行了冷冻切片的新鲜正常组织和肿瘤组织的识别状况。
表1 Mab在正常器官中的识别能力器官 反应性- -/+ + ++ +++心脏 3/3前列腺 2/2肝 3/3肺 3/3肾 2/2-脾 2/2卵巢 2/2胰脏 1/2 1/2睾丸 1/2 1/2肾上腺 1/1垂体 2/2淋巴节 2/2髓质 1/1甲状腺 2/2扁桃体 3/3胃 2/2小肠 2/2大肠 2/2皮肤 2/2颌下腺 2/2胎盘 1/1大脑 1/1小脑 1/1附注无反应(-);
弱反应(+);
中度反应(++);
强反应(+++)。
低温切片表2 Mab对肿瘤的识别能力器官 反应性- -/+ ++ +++神经胶质瘤 1/1脑膜瘤 1/1恶性组织细胞瘤 1/1神经纤维肉瘤 1/1乳腺癌 4/14 5/14 5/14肺癌 3/3头颈肿瘤 5/5基底癌 1/1附注无反应(-);
弱反应(+);
中度反应(++);
权利要求
1.一种识别人体表皮生长因子(EGF)受体的单克隆抗体，它能够抑制EGF与受体结合并能抑制依赖EGF的肿瘤细胞的生长，此外，还具有下列特征中的至少一种a)具有抗体依赖性细胞毒性，b)具有补体介导的细胞毒性，c)如果同神经节苷脂合用，能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用，d)如果同抗EGF的单克隆抗体合用，能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。或是从它的人化的、嵌合的、重新构型的、双特异性的、结合的和抗独特型的形式中选出来的上述单克隆抗体的衍生物，或是上述单克隆抗体的片段或从它的Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段中选出的衍生物。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，它具有抗体依赖性细胞毒性和补体介导的细胞毒性。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，它如果与神经节苷脂合用，可以产生抑制肿瘤细胞拉殖的增效作用。
4.根据权利要求2或3所述的单克隆抗体，它如果与抗EGF的单克隆抗体合用，可产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体，它能够识别人体正常细胞和肿瘤细胞中的EGF受体。
6.根据权利要求5项所述的单克隆抗体，它能够识别人体胎盘EGF受体和A-431肿瘤细胞系的EGF受体。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的单克隆抗体，它可以抑制EGF-依赖性肺癌细胞系U-1752和/或H-125的生长。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体，它在以A-431细胞系为靶细胞的试验中具有抗体依赖性细胞毒性。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的单克隆抗体，它在以A-431细胞系为靶细胞的试验中具有补体介导的细胞毒性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的单克隆抗体，如果同神经节苷脂N-乙酰GM3合用，它能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中所述肿瘤细胞H-125细胞。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的单克隆抗体，如果同抗EGF的单克隆抗体合用，它能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
13.根据权利要求12所述的单克隆抗体，其中所述肿瘤细胞是H-125细胞。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的单克隆抗体，它是IgG2a型免疫球蛋白。
15.一种组合物，包括根据权利要求1～14中任一项所述的单克隆抗体，以及载体、稀释剂或其赋形剂。
16.一种用于治疗或预防治疗恶性肿瘤和肿瘤前疾病的药物组合物，包括能起到治疗和预防作用的量的、根据权利要求1～14中任一项所述的单克隆抗体，以及载体、稀释剂或其赋形剂。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，它含有一种神经节苷脂。
18.根据权利要求16或17所述的药物组合物，它含有抗EGF的单克隆抗体。
19.一种制备识别人体EGF-R的单克隆抗体的方法，包括用人体EGF-R或它的抗原衍生物或其片段使实验动物免疫;从免疫的动物体内分离产生抗体的细胞;保存产生该抗体细胞;从所保存的中筛选能产生单克隆抗体的细胞，这种单克隆抗体识别人体的EGF-R，能够抑制EGF依赖性肿瘤细胞的生长，此外还具有下列特征中的至少一种a)具有抗体依赖性细胞毒性，b)具有补体介导的细胞毒性，c)如果与神经节苷脂合用，能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用，d)如果与抗EGF的单克隆抗体合用，能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用，以及分离由所筛选的细胞产生的单克隆抗体。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于保存从免疫动物体内分离出的产生抗体细胞的保存步骤是通过将该细胞和骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞而实现的。
21.根据权利要求19和20所述的方法，其特征在于免疫步骤所用的实验动物是啮齿动物，最好是小鼠或大鼠。
22.根据权利要求19～21中任一项所述的方法，其特征在于实验动物用人体胎盘EGF-R免疫。
23.根据权利要求19～22中任一项所述的方法，其特征在于筛选出来的单克隆抗体具有抗体依赖性细胞毒性和补体介导的细胞毒性。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于筛选出来的单克隆抗体如果与神经节苷脂合用能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于筛选出来的单克隆抗体如果抗EGF的单克隆抗体合用能产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
26.根据权利要求19～25中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体能够识别存在于人体正常细胞和肿瘤细胞中的EGF-R。
27.根据权利要求19～26中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体能够识别人体胎盘EGF-R和A-431肿瘤细胞系的EGF-R。
28.根据权利要求19～27中任一项所述的方法，其特征在于所筛选的单克隆抗体能够抑制EGF-依赖性肺癌细胞系U-1752和/或H-125的生长。
29.根据权利要求19～28中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体在以A-431为靶细胞的试验中具有抗体依赖性细胞毒性。
30.根据权利要求19～29中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体在以A-431为靶细胞的试验中具有补体介导的细胞毒性。
31.根据权利要求19～30中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体如果与神经节苷脂N-乙酰GM3合用能产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述肿瘤细胞是H-125细胞。
33.根据权利要求19～32中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体如果与抗EGF的单克隆抗体合用能够产生抑制肿瘤增殖的增效作用。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述肿瘤细胞H-125细胞。
35.根据权利要求19～34中任一项所述的方法，其特征在于筛选出的单克隆抗体是IgG2a型免疫球蛋白。
36.根据权利要求19～35中任一项所述的方法，其特征在于对所保存的产生所选单克隆抗体的细胞可以采用在合适的组织的培养基中进行体外培养，或是在组织相容的体液中进行体内培养，或是在发酵罐如产物基质中培养，随后从上述基质中分离保存的细胞。
37.根据权利要求19～36中任一项所述的方法，其特征在于所产生的单克隆抗体被纯化并有选择地衍生化或片段化。
38.一种能产生根据权利要求1～14中任一项所述的单克隆抗体的保存细胞。
39.根据权利要求1～14中任一项所述的单克隆抗体的用途。
全文摘要
1.一种识别人体表皮生长因子(EGF)受体的单克隆抗体，它能够抑制EGF与受体结合并能抑制依赖EGF的肿瘤细胞的生长，此外，还具有下列特征中的至少一种a)具有抗体依赖性细胞毒性，b)具有补体介导的细胞毒性，c)如果同神经节苷脂合用，能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用，d)如果同抗EGF的单克隆抗体合用，能够产生抑制肿瘤细胞增殖的增效作用。
文档编号C12N5/20GK1103404SQ9410409
公开日1995年6月7日 申请日期1994年2月26日 优先权日1993年3月1日
发明者A·F·奥道尼兹, C·M·梅特奥, A·E·M·亚伯拉罕, P·R·M·佩雷兹, B·R·T·布雷弗, R·P·罗德里戈兹 申请人:分子免疫中心