专利名称：细胞特异性坏死的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱导细胞特异性坏死作为，如提高植物对致病因子的抗性的方式。
在WO 89/10396中已经提到，用一个含有组织特异性启动子和一个编码RNA或者多肽的基因的构建体转化植物，当该构建体在启动子特异的细胞中产生时，能够严重干扰细胞代谢。在EP412911中发表了一种通过表达另一种RNA或者多肽来抵抗代谢干扰的程序。正如WO 92/21757中所公开的，有人已提出了类似的有关阻碍植物线虫抗性主题的技术。EP 537399也提出了一个破坏/抑制机制。
本发明提供了一个在有机体特异性细胞中诱导坏死作用的方法。用两个嵌合基因转化植物，其中的一个基因的编码序列编码第一个细胞坏死分子，另一个基因的编码序列编码第二个分子。第二个分子是所说的第一个分子坏死作用的抑制剂。这两个基因都各含有一个启动子，这两启动子共同对施用于所说的有机体的特异性刺激产生应答，这样①第一种分子对所述细胞的坏死作用不受抑制;②在其它的细胞中第一种和第二种分子的表达(有机体为了有一个健康的状况和不致于坏死需要其它细胞)是在所说的其它细胞中第一个分子对其它细胞的坏死作用受到抑制。
本发明的优点就是不必要用细胞特异性启动子就可获得细胞特异性坏死。也就是说，采用两种启动子可得到细胞特异性坏死，而采用两个中的任何一个则不能引导细胞特异性表达。然而，两个启动子的重叠表达特性及对施用的刺激的不同反应会影响效应子基因和抑制子基因表达的方向，从而使得在(而且是仅在)特异性的细胞中产生所说的两种分子的致死不平衡。
这种有机体可以是植物。
有可能当有机体，如特异性细胞受到刺激时，特异性细胞中的第一种分子才会表达。在这种情况下，根据所受的刺激，启动子共同作用以确保特异细胞中第一种和第二种分子的相对水平，而使第一种分子坏死作用不受抑制。类似地，有可能在施用刺激之前，在其它的细胞中没有第一种分子的表达。在这种情况下，这两个启动子共同作用以确保在施用刺激之后其它细胞中第一种和第二种分子的相对水平，从而使第一个分子的坏死作用受到抑制。
如果在应用刺激之前特定的细胞中已有第一种分子的表达，那么两个启动子共同作用，确保特异性细胞中的第一种和第二种分子的相对水平根据所使用的刺激发生变化。这样就使得其从第一种分子的坏死作用受抑制状态转变为不再受抑制的状态。
如果在应用刺激之前其它的细胞中已有第一种分子的表达，那么在受到刺激之前和受到刺激之后其它细胞中第一种和第二种分子的相对水平使得第一种分子对所说的其它细胞的坏死作用受到抑制。
本行业熟练技术人员显而易见，对于所施用的刺激，特异性细胞中第一种和第二种分子的相对水平的变化会受到含有编码第一种分子的基因的嵌合基因的启动子活性的增高水平和/或嵌合基因中另一个基因的启动子活性降低水平的影响。自然也有可能第一种分子和第二种分子的水平都增高或者都降低，只要相对水平的变化导致特异性细胞中第一种分子的坏死作用不再被第二种分子所抑制。
在本文的附图中，
图1的图A-F通过例示表示第一种分子(有阴影的条)和第二种分子(无阴影的条)的表达水平(Y-轴)。图A表示在按本发明转化的靶细胞(特异性)中的相对表达水平，它可能在施用刺激之前就已存在。图A也可能表示其它的非靶细胞在施用刺激前后的相对水平。图B-F则显示了在受到所说的刺激后靶细胞中第一种分子及其抑制物第二种分子不同的相对水平。箭头表示与图A各水平相对应的表达水平的升高或者降低。值得注意的是，在图B-F的任何一个中，第一种分子在过量的抑制剂存在的情况下表达。这样，在每种情况下靶细胞就会发生坏死。
在实施本发明时，第一种分子可以是RNase第二种可以是RNase抑制剂。
其它的第一种和第二种分子是限制性内切酶及对应的DNA修饰酶;蛋白酶及对应的蛋白酶抑制剂;关键的调控或结构基因的反义及正义RNA。
就本发明而言，施于植物的所说刺激可能由病原物的侵袭构成。
本行业熟练技术人员将会认识到，本发明已广泛应用于植物界来保护其不受如真菌，线虫，细菌和病毒的侵袭的感染以及其它目的。
本发明可以用来选择性破坏或者抑制稳定的植物器官，例如刺、附芽、花或者刚毛的发育。在这种情况下，所说的刺激可以是植物自然发育的结果或者人工刺激如用于植物的化学药剂。
可以理解的是，正如这里所用的，“坏死作用”包括代谢实质性损伤这个概念，这样就能实现采用本发明的目标，如病害的防护。
本行业熟练技术人员人将会认识到，有关本发明的概念可以应用到非植物界。
下面将以根结线虫侵染烟草植株的例讲述实施本发明的一个优选的程序烟草的生长与感染烟草C319的种子在以下的条件在FisonsF1混合肥料中萌发光照强度4500-5000Lux，16小时光照间隔8小时的黑暗，温度在20-25℃之间。三周后幼苗在自来水下轻轻冲洗，去掉土，并将之转入袋中(每袋2株，Northrupking)，在25℃，光强5500Lux，16小时光照间隔8小时黑暗的Conviron生长箱中再生长一周。在袋的背后将根抬高，并用WhatmanGF/A玻璃纤维纸支撑根尖端，向这些根尖用10μl(50条线虫)一小等份释放三日龄的线虫，再在根尖放一张GF/A纸，将根尖完全包住。在线虫侵染24小时后去掉GF/A纸以确保线虫同步侵染。侵染3天后，将根结切下(留下根尖及健根组织)，立即放入液氮中冷冻，从80株接种线虫的植株可以收获大约0.5-1.0克被感染的根组织。
染色以观察受感染根中的线虫为了确定感染的质量，测定每个根尖中感染的线虫的数量。从感染3天后的植株收获根，将之浸入95℃的含有0.1%棉染兰的乳酚溶液中90秒，随后用水清洗5秒，再将之放入室温的乳酚中浸泡3-4天，使根透明。用光学显微镜就可以观察到被染色的线虫。
健根和受感染根组织中RNA的提取根组织在用液氮预冷的研钵中研磨成细粉。将100mg的一小等份加入经类似预冷的Eppendorf离心管中。加入300μl热酚抽提缓冲液(50%苯酚，50%提取缓冲液0.1M氯化锂.0.1MTris-HCLpH8.0(室温)，10mMEDTA，1%SDS)，80℃温育5分钟，然后加入等体积的氯仿，并将匀浆液在4℃微超速离心15分钟。水相再用600μl的酚/氯仿抽提，并微超速离心同上。随后，再将水相移出，然后加入等体积的氯化锂，4℃过液沉淀RNA，室温微超速离心15分钟得到沉淀饼。用70%乙醇洗涤沉淀，然后将沉淀饼冷冻干燥，再用DEPC处理的水将沉淀悬浮，用分光光度计对其进行测试。RNA的质量通过变性胶电泳确定(根据Shirzadegan等1991的方法改进)。
感染特异性cDNA的扣除克隆按照生产者提供的方法，用磁性寡聚dTDynabead从200μg取自C319健根和受侵染的根组织的总RNA样品中分离Poly(A)+-RNA(mRNA)。第一股cDNA链的合成是在结合有以健康组织中得到的Poly(A)+组分的Dynabead上原位完成的。这是驱动DNA(DriverDNA)。从受侵染组织中提取的Poly(A)+RNA结合到Dynabead柱，进行原位合成第一股和第二股莲，这是靶DNA(Target DNA)。所有的cDNA合成反应都是采用Pharmacia的cDNA合成试剂盒并按生产者提供的方法进行。采用Maniatis等(1982)的方法，用T4多聚核苷酸激酶对三个寡核苷酸，SUB21(5′CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3′)，SUB25(5′TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3′)(序列来自Duguid和Dinauer，1990)和LDT15(5′GACAGAAGCGGATCCd(T)153′)(O′Reilly等，1991)进行激酶处理。再将SUB21和SUB25退火形成一个衔接物，然后将它按照King和Blakesley(1986)的方法用T4DNA连接酶与靶DNA连接。用TE充分洗脱携带靶DNA的珠子，而cDNA的第二股链用5×SSC在95℃洗脱。
结合列到含有驱动DNA的Dynabead上的RNA可以通过加热以除下。洗脱下来的靶DNA在55℃下5×SSC中与驱动DNA杂交5小时。按生产者提供的方法，在室温条件下从结合有驱动DNA的珠子上分离未杂交的靶DNA，随后，采用相似的方法在95℃下从结合有驱动DNA珠子上分离杂交靶DNA。室温下洗脱的靶DNA再加到驱动DNA中，重复杂交。重复此过程，直至与驱动DNA杂交的靶DNA的量不再超过不杂交的靶DNA的量。用按照生产者提供的方法，采用Invitrogen的DNA-Dipstick仪确定的DNA的浓度。
用一小等份最终室温洗脱成分进行PCR扩增(Eckert等，1990)，生成克隆到质粒载体中的双链cDNA。按照Frohman等(1988)提出的条件，用SUB21和LDT15引物及杂交热循环仪进行靶DNA的扩增。再将PCR的产物连接到Smal消化的pBluescript载体上(King和Blakesley，1986)。
用反向Northern分析筛选扣除文库通过落菌PCR鉴定重组体。(Gussow和Clackson，1989)。按Pall Biodyne膜生产者提供的使用方法，在此膜上以一式三份对扩增的插入片段进行Southern印迹。预杂交和杂交在相同的温度及缓冲液中进行42℃，5XSSPE，0.05%BLOTTO，50%甲酰胺。分别与从健康组织，受感染组织中得到的cDNA探针(见下文)及含有从最终的扣除物扩增的靶DNA的探针对膜进行杂交。选择仅表现出与从受感染组织得到的cDNA探针杂交的克隆以及与扣除的探针但不是cDNA探针表现出杂交信号的克隆作进一步的分析。
cDNA探针的产生为了获得供差示筛析用的具有高度特异性的探针，用总RNA合成无同位素标记的cDNA。接着用寡标记标记合成的产物。先用2.5单位的DNaseI在37℃条件下处理从健康的和受感染的组织中得到的10μg总RNA样品15分钟，接着在cDNA合成进行之前在95℃下变性DNase10分钟(标准Pharmacia程序)。在0.4MNaOH存在的情况下，室温处理10分钟，除去RNA。通过旋转的Sephacry1400HR柱纯化DNA，用DNA Dipstick仪(Invitrogen)测定DNA的量及浓度，接着按Pharmacia寡标记标准程序标记cDNA产物(浓度，35ng/探针)。
Northern印迹为了确定从不同的植物组织中通过反向Northern技术选择到的cDNA的表达特性，在对从健康及受侵染的根、茎、叶、花中得到的总RNA或Poly(A)+-RNA进行Northern分析时用这些克隆作为探针。总RNA印迹每一泳道含有25μgRNA;而Poly(A)+-RNA印迹每一泳道含有0.5μg-1μgRNA。按照Fourney等(1988)所描述的方法，在甲醛凝胶中进行RNA电泳，并将RNA印迹PallBiodyneB膜上。按前文所描述的方法，将探针标记和杂交至印迹上。
Southern印迹为了确定cDNA是来源于植物还是线虫，按Gawel和Jarret(1991)的方法制备C319和M Javanica的DNA。进行Southern印迹时，每个泳道含有10μgEcoRⅠ和HindⅢ消化的DNA。按照前文描述的方法，将印迹杂交至寡标记探针上。
原位杂交为了确定在饲入地点我们所感兴趣的cDNA表达的位点，进行了原位杂交。按Jackson(1991)的方法将健根组织及受感染的根组织包埋于蜡中，切片，然后与探针进行杂交。
mRNA5′末端的分离在分离mRNA启动子序列之前，确定所感兴趣的RNA的5′-末端。按Frohman等(1988)所述的5′-RACE，可以完成此工作。
启动子区的分离采用一种称做载体连接PCR的过程分离我们所感兴趣的基因的启动子区。室温条件下用100ng限制性核酸内切酶酶解的C319基因组DNA样品与100ng pBluescript样品(用能产生可相容末端的限制性酶酶解)连接4小时(King&Blakesley，1986)。比较典型可使用的酶有EcoRⅠ，BamHⅠ，Hind Ⅲ，BGlⅡ，XhoⅠ，ClaⅠ，SalⅠ，KpnⅠ，PstⅠ和SstⅠ。用载体引物如-40测序引物及mRNA5′末端互补的引物对连接产物进行PCR反应，然后对PCR产物进行克隆和测序。如有必要，用一个新的与启动子片段5′端互补的引物重复进行PCR以确保分离到启动子的控制序列。
双元植物转化载体pStarnase的构建图2图示了双元植物转化载体pStarnase的T-DNA区段。这个区包括NPTⅡ基因(可用Kanamycin筛选转基因植株)。CaMV35S启动子控制的barstar ORF以及中间具有供插入刺激反应启动子的近端的NotⅠ限制性位点的barnase ORF。1994年5月5日这个载体已被英国阿伯丁的工业及海洋细菌国家收藏中心的保存，其登记号为NCIMB40634，并受到《专利程序目的的微生物保存的国际认可布达佩斯条约》保护。
图2的图解A-右边界B-NPTⅡC-Nos终止子D-Barnase ORFE-CaMV 35S启动子F-Barstar ORFG-Nos 终止子H-左边界I-NotⅠ位点转基因植株的生产转基因植物，如烟草，可以通过Horsch等(1985)所描述的标准农杆茵(Agrobacterium)介导的叶盘法产生。这样就可以获得抗根结线虫植物。可以将本发明得到的植物种子或其它的繁殖体保存起来作进一步的使用。
本行业熟练技术人员会意识到，对于某些纲的植物，采用非农杆菌介导的方法转化植物则是比较恰当的或者是必需的。
实施例KNTI植物寄生线虫诱导基因的范例及按本发明应用其启动子产生抗植物寄生线虫的植株。
采用上文的步骤，从烟草中分离并鉴定到一个KNTI基因。尽管其在健康植株中的表达水平很低，但Northern印迹表明根结线虫M.Javanica的感染可以强烈诱导其表达。按前文的方法分离到一个长约0.8kb的从转录起始位点开始的KNTI启动子片段，并将其插入到Gus-报道载体pBI101中(Jefferson等，1987)。这样就得到了称为pG21.08的构建，可以用它来转化烟草植株。可以看到，在健康的植株中，这个启动子序列能够引导GUS基因仅在尖端及横向分生组织中表达。当受到M.Javanica的侵染，这些组织中Gus基因的表达不发生变化，而在饲入位点则可以看到的Gus基因的强烈表达。再将这个启动子序列插入到pStarnase的NotⅠ位点，这样它就可以控制barnase ORF的表达。这就产生了构建pS21.08。可以看到用这个构建转化植物对根结线虫的侵染具有抗性。
KNTI基因表现出与其它非烟草植物种类的同源性。这些种类包括，但不仅限于马铃薯，番茄和甜菜。我们还可以看到KNTI基因能被根结线虫及胞囊本线虫所诱导。1994年5月5日该构建载体pS21.08已被英国阿伯丁的工业及海洋细菌国家收藏中心所保存，其登记号为NCIMB40635，并受到《专利程序目的的微生物保存的国际认可布达佩斯条约》保护。
参考文献DUGUID，J.R.&DINAUER，M.C.(1990)Nucleic Acids Research 18(9)2789-2792.
ECKERT，K.A.&KUNKEL，T.A.(1990)Nucleic Acids Research 18(9)3737-3744.
FOURNEY，R.M.，MIYAKOSHI，J.，DAY Ⅲ，R.S.&PATERSON，M.C.(1988)Focus 10(1)5-7.
FROHMAN，M.A.，DUSH，M.K.&MARTIN，G.R.(1988)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 858998-9002.
GAWEL，N.J.&JARRET，R.L.(1991).Plant Molecular Biology Reporter 9(3)262-266.
GUSSOW，D.，&CLACKSON，T.(1989).Nucleic Acids Research 174000-4008.
HORSCH，R.B.，FRY，，J.E.，HOFFMANN，N.L.，EICHOLTZ，D.，ROGERS，S.G.&FRALEY，R.T.(1985).Science 2271229-1231.
JACKSON，D.(1991).Molecular Plant Plant PathologyA Practical Approach.IRL Press，oxford.
JEFFERSON，R.A.，KAVANAGH，T.A.&BEVAN，M.W.(1987)EMBOJ 6(13)3901-3907.
KING，P.V.&BLAKESLEY，R.W.(1986)Focus 8(1)1-3.
MANIATIS，T.，FRITSCH，E.F.&SAMBROOK，J.(1982)Molecular Cloning;A Laboratory Manual.N.Y.Cold Spring Harbour Laboratory.
O′REILLY，D.，THOMAS，C.J.R.&COUTTS，R.H.A.(1991)Journal of General Virology 721-7.
SHIRZADEGAN，M.，CHRISTIE，P.&SEEMANN，J.R.(1991).Nucleic Acids Research 19(21)6055.
权利要求
1.一种在有机体特异性细胞中诱导坏死作用的方法，其中有机体用两个嵌合基因转化，其中的一个所述基因的编码序列编码第一种细胞坏死分子，而另一个所述的基因的编码序列编码第二种分子，其第二种分子是第一种分子的坏死作用的抑制剂，所述的两个基因各包含一种启动子，它们的启动子共同作用，对有机体所受的特异性刺激产生应答，这样，i)所述的第一种分子对所述细胞的坏死作用不受抑制，且ii)在其它的细胞中第一种和第二种分子的表达(有机体为了有一个健康的状况而不致于坏死需要其它细胞)是在所述的其它细胞中第一个分子对其它细胞的坏死作用受到抑制。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的有机体是植物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的第一种分子是RNase，第二种分子是一种RNase抑制剂。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的第一种分子是barnase，第二种分子是barstar。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述的第一种分子是限制性内切酶，第二种分子是对应的DNA修饰酶。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述的第一种分子是蛋白酶，第二种分子是对应的蛋白酶抑制剂。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述的第二种分子是关键的调控或结构基因的mRNA，第一种分子是其对应的反义RNA。
8.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求3-7中的之任一的方法，其中所述的刺激由对所述植物的致病侵染所构成。
9.根据权利要求8的方法，其中病原物包括真菌、线虫、细菌和病毒。
10.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求3-7中之任一的方法，其中所述的刺激是植物自然进化的结果或者是施用到植物上的人工刺激的结果。
11.一种经权利要求1的方法处理而具有抗病性的植物。
12.根据权利要求11的植物，所述的植物为烟草。
全文摘要
用两个基因转化植物，它们的启动子共同作用，以便对施用到植物上的刺激产生应答，这种刺激包含病原物的侵袭。由第一个基因编码的第一种分子对植物特异性细胞的坏死作用不受第二个基因编码的分子的抑制，而在其它的细胞中所提到的第一个分子的坏死作用则被第二个分子抑制。转化植物表现出对线虫侵袭的抗性。
文档编号C12N15/55GK1098436SQ9410696
公开日1995年2月8日 申请日期1994年5月18日 优先权日1993年5月18日
发明者K·S·布兰迪, D·奥赖利 申请人:先进技术(剑桥)有限公司