专利名称：Gdnf突变体及其治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽。更具体地说，本发明涉及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的突变体。本发明还涉及含有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子、核酸构建体、载体、转化了上述核酸构建体或者载体的细胞，以及重组生产本发明多肽的方法。本发明最后涉及本发明多肽的用途，以及包含本发明多肽的药物组合物。
胶质细胞源性神经营养因子是近年来发现的一种新的神经营养因子(Lin LF等，Science.1993 May 21；260(5111)1130-2)。如其它神经营养因子一样，GDNF对中枢及外周的多种神经元具有较为广泛的神经营养作用，它是目前所发现的对多巴胺(DA)能神经元、运动神经元作用最显著的一类神经营养因子(Henderson等，Science.1994Nov11；266(5187)1062-4)。
人GDNF成熟肽是由134个氨基酸残基组成(参见SEQ ID NO1)，其分子结构中有7个位置相对保守的半胱氨酸残基，形成半胱氨酸绊环结构。由于此特点，将其归属于TGF-β家族，但GDNF分子中氨基酸残基的同源性与此家族成员中同源性最高的也不超过20％，因此，将其归属于一个新的亚家族。GDNF的活性形式是由一对链间二硫键形成的同亚基二聚体。在进化上，GDNF呈现相当的保守性，人与鼠GDNF分子同源性高达93％。目前已得到鼠GDNF分子的蛋白质晶体(EigenbrotC等，Nat Struct Biol 1997 Jun；4(6)435-8)，并以X-晶体衍射方法研究了分子的三维结构，在GDNFX-晶体衍射图谱上，N端氨基酸也许是柔性结构的缘故，第1-37位氨基酸残基的结构未能得到解析。
GDNF具有较广泛的促进神经元生长和分化的作用，尤其对多巴胺能神经元作用比较专一。离体实验中，GDNF可促进胎鼠中脑DA能神经元的生长和分化，使处于生长期的神经元细胞核周体增大，胞质丰富，轴突延长，树突生长广泛。GDNF的作用在于它能特异性增强DA能神经元对DA高亲和力摄取，而同时并不影响非多巴胺能神经元。GDNF不仅对离体培养的DA能神经细胞有营养和保护作用，在体实验也取得了相似的结论。GDNF对运动神经元也有很强的营养作用，在运动神经元的发育过程中，GDNF具有抑制细胞凋亡，促进细胞分化成熟的作用(Houenou LJ等，Cell Tissue Res 1996 Nov；286(2)219-23)。此外它是迄今为止所发现的对处于濒死状态的运动神经元最为有效的存活因子。小鼠体内实验中表明，对于作横切的面部运动神经元，外源性的GDNF不仅可阻止这些运动神经元因受损伤而死亡，而且它也是唯一能阻止受损伤的运动神经元萎缩的因子(Munson JB等，Eur JNeurosci 1997 Jun；9(6)1126-9)。因此，GDNF可作为治疗运动神经元功能丧失、退化和死亡的疾病如ALS和脊肌肉萎缩的生理神经营养因子和用于临床的候选药物。近年来，很多活体和离体实验结果都表明，GDNF对于治疗神经进行性退化疾病如帕金森氏症(PD)、脊髓侧索硬化症(ALS)等疾病有着令人乐观的应用前景。
GDNF主要是作为一种神经营养因子，促进神经元增殖、分化、存活。在神经元损伤后，由GDNF作为自泌分子所介导的Ret依赖的信号通路在脑及施旺细胞神经通路重建中起重要作用(Naveilhan P等，Eur JNeurosci 1997 Jul；9(7)1450-60)。同样，大量的研究证实，神经胶质瘤细胞能够大量分泌GDNF(马端端等，北京医科大学学报，1995，27(4)248)。这种过度表达和自分泌的GDNF可能通过胞内的信号转导途径促进自身的增殖和维持存活，从而延长瘤细胞的生存时间。一些研究也证实自身分泌的GDNF同样可促进胶质细胞增殖，因此，过度分泌的GDNF可能在肿瘤的发生、发展的过程中也起一定的促进作用。
现代生物学理论表明，GDNF发挥其增殖作用的机理在于，其与靶细胞表面的受体结合激活了细胞内一系列信号转导通路，包括Ras-MAPK通路(Worby CA等，J Biol Chem 1996 Sep 27；271(39)23619-22)，PI3K信号通路(van Weering DH等，Recent Results CancerRes 1998；154271-81)、JNK通路(Chiariello M等，Oncogene 1998May 14；16(19)2435-45)和PLC-γ信号通路(Borrello MG等，MolCell Biol 1996，162151-2163)，从而发挥促增殖作用。
因此，开发GDNF的一种竞争性拮抗剂，以竞争性地抑制GDNF与其受体的结合，从而阻断GDNF所介导的细胞内信号转导，由此解除其促增殖的功能，这在一些GDNF过表达相关疾病的治疗中将是十分有意义的。
本发明的一个目的是提供一种多肽，其含有选自下组的任何氨基酸序列(a)与胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)成熟多肽亲本的氨基酸序列相比大体上相同，只是其中至少有一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的氨基酸序列；和(b)与(a)中氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；并且所述多肽具有与GDNF受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
本发明的另一目的是提供含有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子。
本发明的又一目的是提供包含本发明多核苷酸，以及与之可操作连接、可指导多肽在适当表达宿主中生产的一或多个控制序列的核酸构建体。
本发明的又一目的是提供包含上述核酸构建体的载体、转化了上述核酸构建体或者载体的细胞，以及重组生产上述多肽的方法。
本发明最后涉及本发明多肽在制备可用于治疗或预防GDNF过表达相关疾病或者需要降低GDNF活性的状况的药物中的用途，以及包含本发明多肽以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。发明简述本发明涉及胶质细胞源性神经营养因子的突变体，更具体地说，本发明涉及一种多肽，其含有选自下组的任何氨基酸序列(a)与胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)成熟多肽亲本的氨基酸序列相比大体上相同，只是其中至少有一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的氨基酸序列；和(b)与(a)中氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；并且所述多肽具有与GDNF受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
本发明还涉及含有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子、核酸构建体、载体、转化了上述核酸构建体或者载体的细胞，以及重组生产本发明多肽的方法。
本发明最后涉及本发明多肽在制备可用于治疗或预防GDNF过表达相关疾病或者需要降低GDNF活性的状况的药物中的用途，以及包含本发明多肽以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。
图1显示GDNF-28 PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图。其中第1泳道为GDNF-28扩增条带，第2泳道为pBR322 DNA经Hinf I酶切的核酸分子量标准。
图2是GDNF N端缺失突变体GDNF-28的表达载体pBV-GDNF-28的构建图。
图3为携有各种载体的大肠杆菌JM103宿主细胞的表达产物的SDS-PAGE及其蛋白质印迹。其中第1泳道为蛋白质分子量标准，第2泳道为携有空载体pBV-220的大肠杆菌JM103作为阴性对照，第3泳道为携有表达载体pBV-GDNF-28的大肠杆菌JM103；第4、5道分别是第2、3泳道使用针对GDNF的多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)的蛋白质印迹。
图4为纯化的GDNF-28的SDS-PAGE电泳图。其中第一泳道为蛋白质分子量标准；第2、3和4泳道为纯化后的GDNF-28。
图5是GDNF重组表达载体pBV-GDNF的构建示意图。
图6显示重组表达的rhGDNF对体外培养的胶质细胞生长的影响。其中浅色框为PBS对照，深色框为rhGDNF。
图7显示通过流式细胞术检测重组表达的rhGDNF和rhGDNF-28与其受体的结合。其中A为KG-1a与PBS温育的阴性对照；B为KG-1a与荧光标记的rhGDNF温育后的结果；C为KG-1a与荧光标记的rhGDNF-28温育后的结果。
图8显示rhGDNF和rhGDNF-28的受体结合竞争实验。其中A为KG-1a与FITC-Avidine温育的阴性对照；B为KG-1a与荧光标记的rhGDNF温育后的结果；C为KG-1a与荧光标记的rhGDNF温育后，加入未荧光标记的rhGDNF-28的结果。
图9显示GDNF-28对8日龄鸡胚背根节突起生长的影响。其中A为用重组表达的GDNF-28进行处理的结果，显示背根节基本上无突起生长；B为用重组表达的GDNF进行处理的对照，显示背根节有明显突起生长。
图10显示各种浓度下GDNF-28对体外培养运动神经元细胞突起生长的影响。其中使用PBS与体外培养运动神经元细胞温育作为阴性对照(黑棱形框表示)；rhGDNF与体外培养运动神经元细胞温育作为阳性对照(正方形框表示)。表明GDNF-28与体外培养运动神经元细胞温育(三角框表示)后的突起细胞数与阴性对照组相当，而显著低于GDNF阳性对照组。
图11显示GDNF-28对体外培养运动神经元细胞存活率的影响。其中使用PBS与体外培养运动神经元细胞温育作为阴性对照(黑棱形框表示)；rhGDNF与体外培养运动神经元细胞温育作为阳性对照(正方形框表示)。表明GDNF-28与体外培养运动神经元细胞温育(三角框表示)后细胞存活率与阴性对照组相当，而显著低于GDNF阳性对照组。
在一个实施方案中，本发明涉及胶质细胞源性神经营养因子的突变体，更具体地说，本发明涉及一种多肽，其含有选自下组的任何氨基酸序列(a)与胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)成熟多肽亲本的氨基酸序列相比大体上相同，只是其中至少有一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的氨基酸序列；和(b)与(a)中氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；并且所述多肽具有与GDNF受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
在一个实施方案中，本发明多肽具有的氨基酸序列相比于其GDNF亲本，至少在N-端有一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。优选地，本发明多肽具有的氨基酸序列相比于其GDNF亲本，在N-端有一或多个缺失。
在一个上述方案中，本发明多肽衍生自哺乳动物来源的GDNF亲本多肽。更优选地，本发明多肽衍生自人来源的GDNF亲本多肽。最优选地，本发明多肽衍生自具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的GDNF亲本多肽。
优选地，本发明所述多肽与其GDNF亲本多肽相比，在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中第1位氨基酸Ser(1)至第32位氨基酸Arg(32)的区段内的至少约11个氨基酸残基，较好是至少约15个氨基酸残基，更好是至少约20个氨基酸残基，尤其是至少约25个氨基酸残基，最好是至少约28个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，只是缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约11个氨基酸残基，优选缺失了至少大约15个氨基酸残基，更优选缺失了至少大约20个氨基酸残基，还更优选缺失了至少大约25个氨基酸残基，尤其是缺失了至少大约30个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明多肽具有SEQ ID NO1中第11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32位氨基酸残基至第133或134位氨基酸残基所示的氨基酸序列。最优选地，本发明多肽具有SEQ ID NO1中Lys(29)至Cys(133)或Ile(134)所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明多肽具有与上述多肽的氨基酸序列至少约80％同源，优选至少约90％同源、更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列，该多肽具有与GDNF受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
在本发明中，“同源”的氨基酸序列指的是该氨基酸序列与参照氨基酸序列不同之处可能在于插入、添加和/或缺失1或多个氨基酸残基和/或有1或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代。优选地，氨基酸改变是性质改变较小的变化，即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸残基；有多达大约20-25个残基的小连接肽；或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。
保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白质》一书，Academic Press，New York中描述过。最常见的替换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。
本发明之核酸序列编码的多肽还包括在多肽或其片段的N-末端或C-末端融合了另一个多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合就可产生融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一读框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。
多核苷酸本发明还涉及含有编码本发明上述多肽的核酸序列的分离多核苷酸。在一个实施方案中，本发明多核苷酸编码的多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本上相同，只是在N-端取代、缺失和/或插入至少一个氨基酸残基。优选地，本发明多核苷酸编码的多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO1所示氨基酸序列的不同之处在于其缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约11个氨基酸残基，优选缺失了至少大约15个氨基酸残基，更优选缺失了至少大约20个氨基酸残基，还更优选缺失了至少大约25个氨基酸残基，尤其是缺失了至少大约30个氨基酸残基，所述多肽具有与GDNF的受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
在一个优选实施方案中，本发明多核苷酸含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的亚序列，其编码的多肽具有SEQ ID NO1中第11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32位氨基酸残基至第133或134位氨基酸残基所示的氨基酸序列，该多肽具有与GDNF的受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。本发明还包括编码上述氨基酸序列的核酸序列，它与SEQ ID NO1所示序列的亚序列因遗传密码的简并性而有所不同。优选地，本发明多核苷酸含有SEQ ID NO2中第85至399或402位核苷酸所示核苷酸序列或者其简并性核苷酸序列，其编码的多肽具有SEQ ID NO1中Lys(29)至Cys(133)或Ile(134)所示的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO3的核苷酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述多核苷酸包含大肠杆菌CGMCC No.0480.2内所含质粒pBV-GDNF-28中所具有的核苷酸序列。本发明还包括编码具有SEQ ID NO1中Lys(29)至Cys(133)或Ile(134)所示氨基酸序列的核酸序列，它与SEQ ID NO3所示序列因遗传密码的简并性而有所不同。本发明的核酸序列包括基因组序列，以及相应的cDNA和RNA序列。此处所用术语“核酸序列”应理解为包括合成DNA在内的所有这类变种。
本发明还涉及含有在SEQ ID NO3的多肽编码区内至少有一个突变的突变核酸序列的分离多核苷酸，其中该突变核酸序列编码具有SEQ ID NO1中Lys(29)至Ile(134)所示氨基酸序列的多肽。
本发明还涉及编码本发明多肽、与SEQ ID NO3多肽编码序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少约为70％、优选约80％、更优选约90％，还要优选的是约95％，最优选的是大约97％同源。就本发明目的而言，两个核酸序列间的同源程度是通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur & Lipman，1983，美国国家科学院学报80726-730)用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及相同性表和以下多重对比参数缺口罚分和缺口长度罚分均为10确定的。成对对比参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝20。核酸构建体本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的1或多个调控序列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以以多种方式操作编码本发明所述多肽的分离的核酸序列，使其表达所述变体。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
本文中术语“控制序列”定义为包括表达本发明多肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。
调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端既有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。表达载体本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
优选本发明所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就整合到宿主细胞基因组的情况而言，载体可以依赖于编码多肽的核酸序列或载体的其他元件，以便载体通过同源或非同源重组稳定地整合到基因组中。或者，载体可含有用于引导通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的附加核酸序列。附加的核酸序列能使载体整合到宿主细胞基因组中染色体上的精确位点。为了增加在精确位点整合的可能性，优选整合元件应含有足够数量的核酸，如100到1500个碱基对，优选400到1500个碱基对，最优选800到1500个碱基对，而且与相应靶序列高度同源，以增加同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，Ehrlich，1978，美国国家科学院学报751433)。
可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。宿主细胞本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，优选原核细胞，如大肠杆菌。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
制备方法本发明还涉及重组制备本发明多肽的方法，该方法包括(a)在适于产生该多肽的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码该多肽的核酸序列；和(b)回收该多肽。
在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在适合多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知针对所述多肽的特异方法检测多肽。这些检测方法包括特异性抗体的使用、活性检测实验等。
可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述变体多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，NewYork，1989)。
本发明所述多肽具有与GDNF的受体结合的活性，而基本上无GDNF的生物学活性。因此，GDNF变体可用于与GDNF竞争结合GDNF受体，作为GDNF的拮抗剂。
本发明还涉及含有本发明多肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于GDNF过表达相关疾病或者需要降低GDNF活性的状况，尤其是肿瘤，特别是神经胶质瘤的治疗或者预防中。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物可口服、直肠给药、非肠道给药、脑池内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种抑制神经胶质细胞生长的方法，包括使所述细胞与本发明多肽接触。
通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例实施例1GDNF cDNA的克隆在添加10％小牛血清和常规用抗菌素(青霉素100U/ml，链霉素50μg/ml)的IMDM培养基(购自GIBCO公司)中，37℃、5％CO2条件下培养人星形胶质细胞瘤细胞BT-325(购自首都医科大学天坛医院神经外科研究所)。收获生长良好的BT-325细胞，按照改良的酸酚-SDS一步法提取细胞总RNA(赵永芳编，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1988152)。
根据Lin等(见上文)报道的GDNF cDNA序列设计合成如下引物上游引物5’-AAATGTCACCAGATAAACAA-3’下游引物5’-CGGGATCCTTAGATACATCCACACCT-3’(下划线为引入的BamHI酶切位点)采用Promega公司的RT-PCR试剂盒，在50μl的反应体系中进行RT-PCR。简而言之，在0.5ml离心管中混合下述组分25mM MgSO42μl，10x缓冲液5μl，10mM dNTP 1μl，RNA 1μg，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，AMV逆转录酶0.5μl，TF1 0.5μl及适量经DEPC处理过的水。采用下述反应循环参数48℃45分钟进行逆转录反应；然后94 ℃变性1分钟，48℃退火1分钟，68℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后在68℃延伸5分钟，从而进行PCR反应扩增。以1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到约400bp的扩增片段，与实验设计相同大小。经DNA自动测序仪分析，结果表明，PCR反应所得的DNA序列与实验设计完全相符(参见Lin等，出处同前)。实施例2GDNF-28变体DNA序列的克隆为获得N-端1-28位氨基酸残基缺失的GDNF变体，参照Lin等(出处同前)设计如下引物上游引物5′-CGGAATTCAAATGAAAGGTCGGAGAGGC-3′(下划线为引入的EcoR I限制性内切酶位点)；下游引物5′-CGGGATCCTTAGATACATCCACACCT-3′(下划线为引入的BamHI限制性内切酶位点)，以实施例1获得的野生型GDNF cDNA作为模板，利用所设计的引物进行PCR反应扩增，得到GDNF-28 DNA序列。简而言之，在0.5ml离心管中混合下述组分25mM MgSO42μl，10xPCR缓冲液5μl，10mM dNTP1μl，DNA 1μg，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，Taq DNA聚合酶(购自Promega公司)2.5U及适量水至终体积50μl。 PCR反应条件为94℃变性1分钟，50℃退火，40秒，72℃延伸，1分钟，共进行30个循环，最后在72℃延伸5分钟。以1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果表明得到约300bp的扩增片段，与实验设计相同大小，如图1。按照试剂盒说明，将此片段插入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)中，得到pGEM-Teasy-GDNF-28，参见图2。经DNA自动测序仪分析，结果表明，PCR反应所得的DNA序列与实验设计完全相符。实施例2GDNF N端缺失突变体GDNF-28表达载体的构建选择pBV220表达载体(张智清等，病毒学报，1990；6(2)111)进行GDNF-28的重组表达。pBV220表达载体长约3.66kb，含有PLPR二个串联的启动子，有很强的rnn终止子序列。利用EcoRI和BamHI将目的片段GDNF-28从载体pGEM-Teasy-GDNF-28上切下，用相同双酶切处理表达载体pBV200，利用玻璃奶回收试剂盒(华美生物工程公司产品)按照生产商说明回收DNA片段，在10μl连接体系中加入100ng载体DNA片段和50ng目的小片段，加入10x连接缓冲液1μl和1-3weiss的T4 DNA连接酶(购自Promega公司)，16℃过夜连接。参照Sambrook等(分子克隆实验指南，第2版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过提取质粒鉴定得到阳性重组子DH5α/pBV-GDNF-28。表达载体pBV-GDNF-28的构建示意图如图2。从阳性重组子DH5α/pBV-GDNF-28中按常规方法提取质粒pBV-GDNF-28。实施例3GDNF N端缺失突变体GDNF-28在大肠杆菌中的表达及蛋白印迹将所构建的表达质粒pBV-GDNF-28转化大肠杆菌感受态细胞JM103，参照Sambrook等(见上文)所述方法在5mlLB培养基中诱导表达4小时后收获细菌，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表达。结果显示，携有表达载体pBV-GDNF-28的大肠杆菌JM103(第3泳道)与经过同样处理的携有空载体pBV-220的大肠杆菌JM103阴性对照(第2泳道)相比，分子量小于14kDa的蛋白质表达明显增多，如图3所示，因此可能表达了分子量约为11.6kDa的目的蛋白rhGDNF-28。经薄层扫描分析，rhGDNF-28在大肠杆菌JM103中的表达水平可达全菌总蛋白的25％以上。根据Sambrook等(见上文)所述方法，采用ECL Westernboltting analysis system(Amersham公司产品)对表达的外源蛋白利用GDNF多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)进行蛋白质印迹分析。结果表明，在大肠杆菌JM103中重组表达的人GDNF-28蛋白质(rhGDNF-28)可特异性地与GDNF多克隆抗体结合。如图3第5道所示。实施例4rhGDNF-28的纯化和复性将转化了pBV-GDNF-28的JM103细胞在2000ml LB中按照实施例3所述进行诱导表达，并按照Sambrook等(出处同前)进行蛋白质的纯化和复性。简单地说，即将细菌发酵培养物于4℃、4000rpm离心30min后，将细菌沉淀重悬于50ml TE中，加入溶菌酶，超声波破碎(6×30秒)后，菌体裂解物经10000rpm离心10分钟，沉淀经2％TritonX-100和3mol/L尿素洗涤之后，包涵体的纯度可达78％。将包涵体溶解于8mol/L尿素后，选用Sephacryl-200(S-200)柱，经凝胶过滤法进行进一步的纯化。洗脱样品用自动收集器收集后，用SDS-PAGE鉴定各个洗脱峰的组份，经考马斯亮蓝染色后，电泳凝胶上显示有分子量约11.6kD的预期条带，而无其它的杂带，如图4。经薄层扫描鉴定，目的蛋白的纯度达到90％以上。
向经S-200纯化后的各级分中加入复性缓冲液(100mmol/L Na2HPO4，2mmol/L Cys，0.2mmol/L连四硫酸钠，pH8.3)，将蛋白浓度稀释至0.1mg/ml，5℃进下复性72小时。将复性后的蛋白质经常规方法浓缩、冻干。实施例5GDNF重组蛋白的制备将实施例1中克隆的GDNF cDNA插入pBV220载体中(参见图6)，构建GDNF的重组表达载体pBV-GDNF，得到阳性重组子DH5α/pBV-GDNF。与实施例2-4所述类似地制备和纯化GDNF重组蛋白rhGDNF。实施例6GDNF对体外培养的胶质细胞的作用本实验以新生2天的大鼠大脑皮层胶质细胞作为实验材料，以MTT法初步探讨了rhGDNF对大鼠胶质细胞生长的影响。取新生2天的Wistar大鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，在无菌条件下剪开脑部皮肤，剖开软硬脑膜，剖出大脑皮层，将组织块剪碎，以0.25％的胰酶在37℃消化30min；收集细胞悬液，按1×105细胞/ml将细胞接种于涂有多聚赖氨酸的培养皿中，培养条件为含10％FCS，2mmol/L-谷氨酰胺，0.6％葡萄糖的DMEM(购自GIBCO公司)，于36℃，10％CO2条件下培养，每3天换液一次。传代2次后胶质细胞已得到大量增殖，采用MTT法(孙卫民等编，细胞因子研究方法学，人民卫生出版社，1999年，65页)分析rhGDNF对胶质细胞生长的影响。收取细胞，并调整细胞数为1.2x105细胞/ml，以无血清培养基(2mmol/LL-谷氨酰胺，0.6％葡萄糖的DMEM)接种细胞，接种细胞的同时加入不同浓度rhGDNF(浓度分别为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml)，于36℃，10％CO2条件下培养48h后，加入20ulMTT的稀释液(5mg MTT/ml于pH7.4的PBS中)继续培养4h；加入10％SDS-0.01mol/L NH4Cl(100ul/孔)，36℃过夜培养，酶联检测仪测定OD570。对照组加入PBS。结果发现rhGDNF均可促进胶质细胞的增殖，与对照组相比，细胞数目有明显的增加，表明GDNF可明显促进胶质细胞的增殖。如图6.实施例7rhGDNF-28的受体结合活性据Gattei V.等(Blood，1997，April15，89(8)2925-2937)报道，人髓系白血病细胞KG-la表达GDNF的受体复合物的两个组份GDNFR-α和RET，因此利用KG-a细胞研究rhGDNF-28的受体结合活性。在含有10％小牛血清，青霉素100U/ml，链霉素50μg/ml的PRMI1640培养基(购自GIBCO公司)中，于37℃，5％CO2条件下培养KG-1a细胞(军事医学科学院基础研究所刘荷中博士惠赠)。利用生物素-亲和素系统(均购自Sigma公司)，参照徐宜为编著(免疫检测技术(第三版)，1991，科学出版社)所述方法对纯化复性后的rhGDNF和rhGDNF-28进行标记和检测。将KG-1a细胞与荧光标记的rhGDNF和rhGDNF-28在4℃温育90分钟，反应完成后利用流式细胞仪测定荧光阳性细胞数以确定rhGDNF和rhGDNF-28与存在于KG-1a表面受体GDNFR-α结合的情况。采用KG-1a细胞与FITC-Avidin温育作为阴性对照。结果表明，rhGDNF和rhGDNF-28在以下浓度10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml下，与阴性对照的荧光曲线(图7A)相比，GDNF-28(图7C)与野生型GDNF分子(图7B)的荧光曲线明显右移，且右移程度相似，显示结合能力相似。如图7所示。其中rhGDNF的荧光阳性细胞计数为27.8％，rhGDNF-28的荧光阳性细胞计数为22.3％，而阴性对照的荧光阳性细胞计数仅为0.2％。
还进行了GDNF-28与GDNF的结合竞争实验。在该实验中，首先用以200ng/ml生物素标记的野生型GDNF与KG-1a细胞受体结合，测定荧光阳性细胞数(图8B)，然后再在此反应体系中加入相同量的未用生物素标记的GDNF-28，再次测定荧光阳性细胞数(图8C)，同样以KG-1a细胞与FITC-Avidin温育作为阴性对照(图8A)。结果表明，生物素标记的野生型GDNF与KG-1a细胞受体结合再加入未标记的GDNF-28，与加入未标记的GDNF-28之前相比，其荧光吸收明显左移，荧光阳性细胞数由33％降为15％，说明GDNF-28可与野生型GDNF分子竞争性与其受体GDNFR-α结合。实施例9GDNF N端缺失突变体rhGDNF-28的生物学活性分析最常用的神经营养因子测活方法是以E8-E10鸡胚背根节神经元作为材料，培养24h后观察神经元细胞突起生长状态。从8日龄鸡胚(购自中国农科院畜牧研究所)分离背根神经节，种植于涂有多聚赖氨酸，并用Hank’s液平衡好的24孔细胞培养板或培养瓶培养，每瓶种1-2个节；37℃，5％CO2下贴壁1h，然后加入无血清培养基DMEM(购自GIBCO公司)，分别以50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml三种浓度在鸡胚背根节培养液中加入纯化复性的重组因子rhGDNF和rhGDNF-28，结果表明，三种浓度下rhGDNF均能促进E8鸡胚整体背根节生长出大量突起，而rhGDNF-28组在背根节组织周围仅有少量的成纤维细胞迁移出来，显示此突变体丧失了生物学活性。如图9.实施例10 rhGDNF-28对体外培养胎鼠脊髓前角运动神经元突起生长的作用断头处死孕14天的Wistar大鼠(购自北京医科大学实验动物中心)，在无菌环境下打开腹腔，剖出胎鼠，在体视镜下从背侧剪开皮肤，取出整条脊髓，解剖刀切取腹侧部分，将组织块剪碎，以0.125％胰酶(Sigma公司产品)在37℃消化30min；收集细胞悬液，按105细胞/ml细胞数将细胞接种于涂有多聚赖氨酸(Sigma公司产品)的培养皿(运动神经元培养条件1％B27添加剂、1％N2添加剂、98％神经细胞无血清培养基，均购自GIBCO公司)，两组实验组分别加入5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml和500ng/ml的重组因子rhGDNF和rhGDNF-28，阴性对照组加入相同体积的PBS，36 ℃，10％CO2条件下培养16h，倒置显微镜下计数各组突起细胞数。实验结果表明，在实验所给的六种浓度下rhGDNF均可明显促进运动神经元细胞突起的生长，但rhGDNF-28组与对照组相比无显著差异。如图10。实施例11 rhGDNF-28对培养E14大鼠脊髓前角运动神经元存活率的影响同实施例10中所述方法分离E14大鼠脊髓前角运动神经元细胞，按105细胞/ml细胞数将细胞接种于涂有多聚赖氨酸的培养皿，两组实验组接种细胞的同时分别加入10ng/ml rhGDNF和rhGDNF-28，阴性对照组加入相同体积的PBS。细胞培养条件同实施例10，在细胞培养过程中，每周换液两次，换液时补加相应的营养因子rhGDNF和rhGDNF-28，每次换液量为原液的一半，在神经元培养的第5-7天(视胶质细胞生长状况而定)以3μg/ml终浓度加一次阿糖胞苷，抑制胶质细胞的生长。分别计算培养3天、7天、14天及21天时运动神经元存活率。实验结果表明，rhGDNF可显著提高体外培养3天、7天、14天和21天运动神经元细胞的存活率，但rhGDNF-28组与对照组相比无显著差异。如图11。
上述结果说明，该GDNF N端缺失突变体GDNF-28能够竞争性抑制GDNF与其受体的结合，从而作为GDNF的拮抗剂，抑制GDNF的促进神经元存活和增殖作用。
以下生物材料已遵循Budapest条约的规定，保藏在中国北京中关村，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号如下保藏物 保藏号保藏日期DH5α/pBV-GDNF-28 GMCCNo.0480.22000年8月17日DH5α/pBV-GDNF GMCCNo.0480.12000年8月17日本文所描述和要求保护的发明并不限定在所公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案意在举例说明本发明的几个方面。任何等价的实施方案均包括在本发明的范围内。事实上，除了本文所示和所述，对本发明的修改方案在参照前面的描述后对本领域内技术人员而言是显而易见的。这些修改也包含在所附权利要求书的范围内。有冲突时，以本文公开内容，包括定义为准。
本文引用了很多文献，它们均全文引入作为参考。
序列表<110>申请人中国人民解放军军事医学科学院基础研究所<120>发明名称GDNF N端缺失突变体的治疗应用<150>申请号待定<151>申请日待定<160>序列数3<210>1<211>134<212>蛋白质<213>人<400>1TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT 30Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro16AGA AGA GAG CGG AAT CGG CAG GCT GCA GCT 60Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala11 16GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT 90Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly21 26CGG AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT 120Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly31 36TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT TTA AAT GTC 150Cys Val Leu Thr Aal Ile His Leu Asn Val41 46ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG 180Thr Asp Leu Gly Leu Gly Yyr Glu Thr Lys51 56GAG GAA CTG ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC 210Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly61 66
TCT TGC AGT GCA GCT GAG ACA ACG TAC GAC 240Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp71 76AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA 270Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg81 86AGG CTG GTG AGT GAC AAA GTA GGG CAG GCA 300Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Glu Ala91 96TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC 330Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp101 106CTG TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC 360Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr111 116CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT AAA AGG 390His I1e Leu Arg Lys His Ser Aal Lys Arg121 126TGT GGA TGT ATC TGA 412Cys Gly Cys Ile131 134<210>2<211>412<212>DNA<213>人<400>2TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT 30AGA AGA GAG CGG AAT CGG CAG GCT GCA GCT 60GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT 90CGG AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT120TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT TTA AAT GTC150ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG180
GAG GAA CTG ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC 210TCT TGC AGT GCA GCT GAG ACA ACG TAC GAC 240AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA 270AGG CTG GTG AGT GAC AAA GTA GGG CAG GCA 300TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC 330CTG TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC 360CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT AAA AGG 390TGT GGA TGT ATC TGA 412<210>3<211>324<212>DNA<213>人<400>3AAA GGT CGG AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC 30Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn1 6CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT TTA 60Arg Gly Cys Val Leu Thr Aal Ile His Leu16AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA 90Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu21 26ACC AAG GAG GAA CTG ATT TTT AGG TAC TGC 120Thr Lys Glu Glu Leu I1e Phe Arg Tyr Cys31 36AGC GGC TCT TGC AGT GCA GCT GAG ACA ACG 150Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr41 46TAC GAC AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA 180Tyr Asp Lys I1e Leu Lys Asn Leu Ser Arg51 56AAT AGA AGG CTG GTG AGT GAC AAA GTA GGG 210Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly61 66
CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT 240Glu Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp71 76GAT GAC CTG TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG 270Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu81 86GTT TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT 300Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Aa191 96AAA AGG TGT GGA TGT ATC TGA 324Lys Arg Cys Gly Cys Ile101 10权利要求
1.一种多肽，其含有选自下组的任何氨基酸序列(a)与胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)成熟多肽亲本的氨基酸序列相比大体上相同，只是其中至少有一或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入的氨基酸序列；和(b)与(a)中氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；并且所述多肽具有与GDNF受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
2. 根据权利要求1的多肽，其中所述GDNF亲本是哺乳动物多肽。
3.根据权利要求2的多肽，其中所述GDNF亲本来源于人。
4.根据权利要求2的多肽，其中所述GDNF亲本具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任何一项的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于其GDNF亲本，至少在N-端有一或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。
6.根据权利要求5的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于其GDNF亲本，至少在N-端缺失了一或多个氨基酸残基。
7.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于该GDNF亲本，至少在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中第1位氨基酸Ser(1)至第32位氨基酸Arg(32)的区段内的至少约11个氨基酸残基。
8.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于该GDNF亲本，在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中Ser(1)至Arg(32)的区段内的至少约15个氨基酸残基。
9.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于该GDNF亲本，在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中Ser(1)至Arg(32)的区段内的至少约20个氨基酸残基。
10.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于该GDNF亲本，在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中Ser(1)至Arg(32)的区段内的至少约25个氨基酸残基。
11.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于该GDNF亲本，在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中Ser(1)至Arg(32)的区段内的至少约28个氨基酸残基。
12.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有的氨基酸序列相比于该GDNF亲本，在N-端缺失了相当于SEQ ID NO1中Ser(1)至Gly(28)的区段内的氨基酸残基。
13.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，只是缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约10个氨基酸残基。
14.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，只是缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约15个氨基酸残基。
15.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，只是缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约20个氨基酸残基。
16.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，只是缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约25个氨基酸残基。
17.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，只是缺失了N端Ser(1)至Arg(32)的区段内至少大约28个氨基酸残基。
18.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1中第11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32位氨基酸残基至第133或134位氨基酸残基所示的氨基酸序列
19.根据权利要求6的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO1中Lys(29)至Ile(134)所示的氨基酸序列。
20.具有与权利要求13-19中任何一项所述多肽之氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有与GDNF的受体结合的活性，但基本上无GDNF的生物学活性。
21.包含编码权利要求1-20中任何一项之多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
22.根据权利要求21的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有SEQID NO2所示核苷酸序列的亚序列或者其简并性序列。
23.根据权利要求22的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有SEQID NO3所示核苷酸序列或者其简并性序列。
24.包含权利要求21的多核苷酸，以及与之可操作连接、可指导多肽在适当表达宿主中生产的一或多个控制序列的核酸构建体。
25.根据权利要求24的核酸构建体，其中所述控制序列包括选自λPL、λPR、T7启动子的启动子。
26.根据权利要求24的核酸构建体，其中所述多核苷酸含有SEQID NO2所示核苷酸序列的亚序列或者其简并性序列。
27.根据权利要求24的核酸构建体，其中所述多核苷酸含有SEQID NO3所示核苷酸序列或者其简并性序列。
28.包含权利要求24-27中任何一项的核酸构建体的重组表达载体。
29.根据权利要求28的重组表达载体，它是pBV-GDNF-28。
30.转化了权利要求24-27的核酸构建体或者权利要求28-29的重组表达载体的细胞。
31.根据权利要求30的细胞，它是大肠杆菌细胞。
32.根据权利要求31的细胞，它是CGMCC No0480.2。
33.一种生产权利要求1-20中任何一项所述多肽的方法，包括在适于生产所述多肽的条件下培养权利要求30-32中任何一项的细胞，以及从该细胞或者其培养基中回收该多肽。
34.由权利要求33的方法生产的多肽。
35.权利要求1-20或34中任何一项的多肽在制备可用于治疗和/或预防GDNF过表达相关疾病或者需要降低GDNF活性的状况的药物中的用途。
36.权利要求1-20或34中任何一项的多肽在制备可用于治疗和/或预防神经胶质瘤的药物中的用途。
37.权利要求1-20或34中任何一项的多肽作为GDNF的拮抗剂的用途。
38.一种抑制神经胶质细胞生长的方法，包括使所述细胞与有效量的权利要求1-20或34中任何一项的多肽接触。
39.包含权利要求1-20或34中任何一项的多肽以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。
40.根据权利要求39的药物组合物，其用于治疗和/或预防GDNF过表达相关疾病或者需要降低GDNF活性的状况。
41.根据权利要求39的药物组合物，其用于治疗和/或预防神经胶质瘤。
全文摘要
本发明涉及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的突变体,该突变体具有与GDNF受体结合的活性,但基本上无GDNF的生物学活性。本发明还涉及含有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子、核酸构建体、载体、转化了上述核酸构建体或者载体的细胞,以及重组生产本发明多肽的方法。本发明最后涉及本发明多肽的用途,以及包含本发明多肽的药物组合物。
文档编号A61P25/00GK1343724SQ00128679
公开日2002年4月10日 申请日期2000年9月20日 优先权日2000年9月20日
发明者王嘉玺, 王金惠 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所