专利名称：降血压、抗肿瘤化合物的制药用途的制作方法
本专利申请为分案申请，原案申请号为99116290.0，申请日为1999.07.16。
本发明涉及两种具有降血压、抗肿瘤活性的化合物及其制备方法，以及它们在制备药物中的应用。
自从1929年弗莱明从真菌中发现青霉素以来，真菌的代谢产物成为了药物的丰富来源，绝大多数临床应用的抗生素都来源于真菌和细菌，真菌的代谢产物还有其他的药用价值，如抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂，酶抑制剂等。由于海洋环境的特殊性，海洋真菌能提供陆生真菌无法提供的代谢产物。国际上已从海洋真菌中发现了一些结构独特的化合物，分别具有抗菌，抗病毒，抗肿瘤和神经心血管方面的活性。例如从Acremonium ehrysogenum产生的头孢菌素，已发展为一大类半合成抗生素的先导，广泛应用于临床，还有其他的一些例子见Kerstin Liberra的文章《Marine fungi a profile resource of biologically activenatural products？》[Pharmazie 50(1995)H.9583-588]，国际上这方面的研究从八十年代以来呈加速发展的趋势。
本发明的目的在于提供一类新的具有潜在药用价值的化合物及其提取分离方法，以及它们在制备降血压、抗肿瘤药物中的用途。
真菌Halorosellinia oceanicum系从亚热带海洋生态环境中分离得到，其子囊果单个或成组排列，缺乏良好发育的子囊，在以燕麦琼脂为批培养基的培养皿中，接种4个星期后，菌落可长满培养基表面，生长初期，菌落呈白色，被散毛，紧贴于培养基，并呈不规则的环纹，有致密，完整的边缘，而后环纹有颜色逐渐加深，培养物的底面没有颜色。子囊果单个或数个并生，线状或环状，在新鲜培养物上呈革质，子囊中有8个孢子，子囊孢子单列，或在子囊顶部呈部分双列，为灰绿色或不透明的褐色，子囊孢子壁光滑，稍厚，无附着物或附生孢子，子囊孢子芽裂通常可在背侧清晰见到，直而明显。该属真菌的代谢产物研究还未见有报道。
发明人由南海海洋真菌Halorosellinia oceanicum 323的发酵培养物中提取分离到二种结构新颖的化合物，其结构是由苯乙胺与不规则取代二萜构成，这一结构是没有先例的。
本发明化合物如下列式(A)和式(B)所示(以下分别简称为化合物A和B)
本发明化合物A和B可以从真菌Halorosellinia oceanicum 323的发酵液中提取分离而得到。
本发明所用的的真菌Halorosellinia oceanicum 323已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC No99008，保藏日为1999年5月31日。
制备本发明化合物A和B的方法包括以下步骤；a.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的种子培养培养基成分按重量比为葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、琼脂1-1.5、氯化钠3-5、水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；b.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的发酵培养发酵培养基成分按重量比为葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、氯化钠3-5、水100、将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2月；c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯∶石油醚＝1％-100％为洗脱剂梯度洗脱；e.收集70％-90％的乙酸乙酯∶石油醚洗脱液，浓缩得白色针状结晶，得到A、B混合物，在甲醇中多次重结晶，分离A与B。
动物实验表明，化合物A、B和异丙肾上腺素均能抑制回肠段的自动节律收缩，化合物A、B在终浓度为5×10-6-5×10-3mg/ml的剂量范围内，缓慢松弛平滑肌，至15min时完全松弛，并且平滑肌的松弛可持续2.5小时(每间隔20分钟冲洗一次)，而异丙肾上腺素松弛作用快，冲洗后约20分钟可恢复，异丙肾上腺素的终浓度为5×10-5mg/ml。
本发明化合物对兔血管平滑肌的作用，在终浓度为5×10-6-5×10-3mg/ml，能抑制肾上腺素引起的兔主动脉血管平滑肌的收缩，浓度大于5×10-3mg/ml时直接松弛兔主动脉血管平滑肌。
本发明化合物剂量为0.2mg/kg在麻醉大鼠试验中具有明显的降压效果，维持时间2小时仍未恢复。
本发明化合物A与B均能抑制肿瘤细胞株的生长，在以口底癌细胞株为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤活性试验中，化合物A的半数致死量IC50为124μg/ml，化合物B的IC50为129μg/ml。
上述结果表明，化合物A、B具良好的松弛平滑肌的作用，且持续时间长于现有药物异丙肾上腺素，化合物有A、B具有明显的降压效果，维持时间2小时仍未恢复。同时化合物A与B均能有效抑制肿瘤细胞株的生长。所以，本发明化合物A或/和B可用于制备降血压和抗肿瘤药物。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1化合物A、B的分离制备方法a.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的种子培养培养基成分按重量比为葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、琼脂1-1.5、氯化钠3-5、水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；b.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的发酵培养发酵培养基成分按重量比为葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、氯化钠3-5、水100、将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2月；c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯∶石油醚＝1％-100％为洗脱剂梯度洗脱；e.收集70％-90％的乙酸乙酯∶石油醚洗脱液，浓缩得白色针状结晶，得到A、B混合物，在甲醇中多次重结晶，分离A与B。
A和B均为白色针状结晶，A熔点280℃(分解)，B熔点274℃(分解)。
化合物A的试验数据元素分析C30H37NO6(A与B相同)％ 碳 氢 氮A实测值 70.86 7.532.25B实测值 71.03 7.582.37计算值 71.01 7.302.76MS(FAB)m/z509，490，479，448，430，412，402，388，357，348，289，265，254，172，165，91，77。IR(KBr)cm-13416，3233，3128，2973，2974，2860，1743，1693，1454，1370，1271，1229，1046，1011，962，906，779，744，702。UV(CHCl3)λmax nm238(ε12845)，260(ε11379)，281(ε7706)1HNMR(CDCl3，TMS)ppm7.32(t，8，8Hz，2H)，7.26(t，8，8Hz，1H)，7.14(d，8Hz，2H))，6.11(dd，2，15.5Hz，1H)，5.72(bs，1H)，5.69(dd，10，15.5Hz，1H)，3.24(bs，1H)，2.85(t，10，10Hz，1H)，2.81(dd，5，13.5Hz，1H)，2.74(dq，7，12.5Hz，1H)，2.70(d，3.5，7Hz，1H)，2.68(dd，9.5.13.5Hz，1H)，2.51(ddd，10.5，12.5，13Hz，1H)，2.15(dd，3.5，5Hz，1H)，2.27(s，3H)，1.51(s，3H)，1.21(d，6.5Hz，3H)，0.94(d，6.5Hz，3H)，1.92(br，2H)13C-NMR(CDCl3)C 210.24，173.73，169.66，147.5，137.16，77.67，53.28CH 134.04，132.25，130.56，127.52，127.02，69.77，77.10，53.56，49.85，46.91，42.27，32.60，129.07×2，128.88×2CH2114.41，45.18，37.68CH324.12，20.79，19.35，13.6化合物B的试验数据MS(FAB)m/z508，490，479，60，448，43，412，48，20，89，79，19，165，136，120，107，9177，65，51IR(KBr)cm-13416，3198，3121，2973，2924，2853，1743，1700，1461，1377，1236，1046，1011，962UV(CHCl3)λmax nm238(ε6457)，281(ε2660)，301(ε1875)，328(ε1640)1HNMR(CDCl3，TMS)ppm7.32(t，7，7Hz，2H)，7.25(t，7，7Hz，1H)，7.17(d，7Hz，2H)，6.01(dd，2，15.5，1H)，5.90(t，2，2Hz，1H)，5.89(dd，15.5，10.5Hz，1H)，5.34(ddd，15.5，10.5，5.5H2，1H)，5.16(dd，2，15.5Hz，1H)，3.78(d，10Hz，1H)，3.34(dd，7.5，6.5Hz，1H)，2.96(dd，7.5，14Hz，2H)，2.74(dq，7，12.5Hz，1H)，2.471(bs，1H)，2.26(s)，1.70(s，3H)，1.51(s，3H)，1.46(s，3H)，1.20(d，7Hz，3H).13C-NMR(CDCl3)ppmC 210.00，174.40，169.60，137.60，131.40，126.30，77.86，52.64，CH 134.11，131.99，131.0，128.35，127.02，75.02，68.10，60.28，50.46，49.84，42.44，129.10×2，128.92×2.CH244.79，37.64CH324.32，2.79，19.36，17.17，13.84实施例2化合物A、B对豚鼠回肠平滑肌的作用a.分别精确称取化合物A、B各15mg，先用8滴二甲亚砜溶解，然后缓慢加入双蒸水配制的生理盐水定容10ml，配制成1.5mg/ml的浓度。
b.豚鼠击昏剖取回肠，用预冷的台氏营养液(1000mlH2O，NaCl 8g，KCl 0.2g，MgCl20.1g，NaH2PO4.2H2O 0.05g，NaHCO31g，CaCl20.2g，葡萄糖1g，pH7.4)冲洗肠管中的食物残渣，然后剪成3厘米的长度，两端用蛙心夹夹住，置于灌流浴槽中，下端蛙心夹固定于浴槽底部，上端蛙心夹用线连接二道生理记录仪(成都仪器厂，LMS-2B)的拉力换能器，回肠段的自动节律收缩被记录下来，浴槽中台氏营养液恒温35℃，通入纯氧，回肠段挂上去时施加1g的拉力，平衡40min开始(每20min换台氏营养液一次)。先记录一段回肠正常收缩的曲线，然后分别加入和阳性对照药异丙肾上腺素。
试验结果如下化合物A、B和异丙肾上腺素均能抑制回肠段的自动节律收缩，化合物A、B在终浓度为5×10-6-5×10-3mg/ml的剂量范围内，缓慢松弛平滑肌，至15min时完全松弛，并且平滑肌的松弛可持续2.5小时(每间隔20分钟冲洗一次)，而异丙肾上腺素松弛作用快，冲洗后约20分钟可恢复，异丙肾上腺素的终浓度为5×10-5mg/ml。
结果表明化合物A、B具有良好的松弛平滑肌的作用，且持续时间长于现有药物异丙肾上腺素。
实施例3化合物A、B对兔主动脉条的作用新西兰大白兔一只，去头致昏，开胸，迅速取出其胸主动脉，放入预冷通氧气的Lock氏液(1000ml H2O，NaCl 9g，KCl 0.35g，MgSO4.7H2O 0.35g，KH2PO40.16g，NaHCO31g)中，快速洗尽血污，然后小心剪去血管外的结蹄组织，与管纵径成45度角剪成宽2-3mm动脉条供试验用。
取2cm左右长度的动脉条，两端用蛙心夹夹住，置于恒温38℃的灌流浴槽中，浴液中通入氧气，下端蛙心夹固定于浴槽底部，上端蛙心夹用线连接拉力换能器，用二道生理记录仪(成都仪器厂，LMS-2B)记录血管条的收缩力。动脉条在灌流浴槽中，平衡80min开始试验，此间每隔20分钟换一次Lock氏液，加入浓度5×10-3mg/ml的化合物A，可松弛血管，加入终浓度1.6×10-6mg/ml的肾上腺素，记录血管条的收缩曲线，待收缩高度不再增加时，冲去，共冲洗3次，40分钟后待血管条基线恢复时，先加入5×10-4mg/ml的化合物A作用10分钟，可见在此浓度下，化合物A无直接松弛血管平滑肌的作用，然后再加入终浓度1.6×10-6mg/ml的肾上腺素，可见此次加入的肾上腺素只能使血管条的收缩增加到原来的1/3，化合物B的结果与A类似。
试验结果表明化合物A在浓度大于5×10-3mg/ml时，直接松弛血管，低于此浓度时，不直接松弛血管平滑肌，但可使肾上腺素对血管收缩力降低。化合物B的结果与A类似。
实施例4化合物A、B的降血压作用SD系大鼠用40mg/ml的戊巴比妥钠麻醉，背位固定于试验台上，剪去颈部毛，切开皮肤，分离左颈总动脉，近心端用动脉夹夹住，远心端用绒线扎，用眼科剪在近绒线处剪V形小口，插入充满肝素生理盐水的动脉插管，动脉插管与血压换能器相连，血压换能器相连接入计算机控制的三通道生理药理记录系统，分离大鼠的右股静脉并插管，供注射药物用。待血压稳定后(即血压收缩曲线平稳后)开始试验。分别注射剂量为0.2mg/kg的化合物A，可见有显著的降压作用。
试验结果为时间(分钟) 051560平均动脉压(Kpa)13.8 8.7 9.0 9.5化合物B的结果与A类似。
结果表明化合物A、B具有明显而持久的降血压效果。
实施例5MTT还原法检测化合物A、B抗肿瘤活性试验1.材料1.1四脞盐(MTT)用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenytetrazolium bromide，SIGMA〕终浓度5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
1.2MTT裂解液的配制80g的十二烷基磺酸钠(SDS，华美生物工程公司)溶解在200ml的N-N-二甲基甲酰胺(北京化工厂)中，水浴加热助溶，加入200ml蒸馏水，用80％乙酸与1N盐酸(1∶1)混合调pH至4.7。
1.3靶细胞的制备KBS细胞的复苏与培养a.从液氮罐中取出KBS细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；b.加全培养液至10ml，1000rpm离心5s，弃上清；c.重复以上操作一次；d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO237℃培养；e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。
1.4 KBS细胞计数、96孔板准备a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，全培养终止，移入离心管中，加全培至10ml；b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4、乘104，即为每毫升培养液所含细胞数；c.调整细胞数至1×105ml；d.96孔板置超镜台内在紫外线下照射4hr，距离30cm以内。
1.5化合物A与B的配制取一定量的化合物A、B加入到全培中，调整浓度为500μg/ml，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。
1.6试验方法a.96孔板各孔加入KBS细胞180μl(1×105/ml)，5％CO2、37℃培养4hr。
b.加入不同浓度受试对象各20μl，对照加全培2μl，继续培养48hr。
c.每孔去除培养液100μl，加入MTT(5mg/ml各10μl，继续培养4hr。
d.每孔加入MTT裂解液100μl，轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解，过夜。
e.酶联免疫仪570nm下测定各孔OD值。
f.计算抑制率肿瘤细胞杀伤率％＝(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值×100％。
g.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC50值。
以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC50值。
1.7结果试验发现化合物A、B均能抑制KBS细胞株生长，其中A的IC50值为124μg/ml；B的IC50值为124μg/ml。
权利要求
1.下述结构式A和/或B的化合物用于制备降血压药物
全文摘要
本发明涉及A和式B的化合物及其制备方法,以及它们在制备降血压、抗肿瘤药物中的应用。
文档编号A61P9/12GK1364461SQ01122589
公开日2002年8月21日 申请日期1999年7月16日 优先权日1999年7月16日
发明者林永成, 姜广策, 周世宁, 许东晖, 王正濂, 关利平, E·B·G钟斯 申请人:中山大学