用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法

专利名称：用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及诸如白血病和癌症这样的恶性疾病的免疫疗法。更具体地说，本发明涉及用于产生或促进对WT1免疫反应的组合物并涉及这类组合物在预防和/或治疗恶性疾病中的应用。
背景技术：
癌症和白血病是美国和全世界中存在的很大健康难题。尽管在检测和治疗这类疾病方面已经取得了进展，但是目前还没有得到用于预防或治疗癌症和白血病的疫苗或其它普遍成功的方法。对这类疾病的控制目前依赖于早期诊断和攻击疗法的结合，它可以包括一种或多种不同的治疗方法，诸如手术、放疗、化疗和激素疗法。通常基于包括特异性肿瘤标记分析在内的多个预后参数来选择特定癌症的治疗过程。然而，已有标记的应用通常导致难以解释的结果且在许多癌症患者中持续观察到高死亡率。
免疫疗法具有实质性改善癌症和白血病疗法和存活率的潜能。近期的数据证明通过骨髓移植(例如供体淋巴细胞输注)中的免疫疗法可以治愈白血病。这类疗法可包括产生或增强针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答。然而，迄今为止对TAA几乎一无所知且尚未证实针对这类抗原产生的免疫反应具有治疗效果，但罕见的除外。
因此，本领域中存在对白血病和癌症预防和治疗的改进方法的需求。本发明满足了这些需求且进一步提供了其它相关的优点。

发明内容
简单地说，本发明提供了诸如白血病和癌症这类疾病的诊断和治疗用组合物和方法。本发明一个方面提供了含有天然WT1的免疫原性部分的多肽或其变异体，所述变异体在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异而该变异体与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力基本上未被降低。在某些实施方案中，所述多肽含有天然WT1多肽的不超过16个的连续氨基酸残基。在其它实施方案中，所述多肽含有天然WT1多肽的第1-174位氨基酸残基的免疫原性部分或其变异体，其中所述多肽含有存在于天然WT1多肽的第175-449位氨基酸内的不超过16个的连续氨基酸残基。所述免疫原性部分优选地与I类/或II类MHC分子结合。在某些实施方案中，所述多肽含有选自下列一组序列的序列(a)表II-XLVI中的任意一个或多个所示的序列；(b)在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的上述序列的变异体，而该变异体与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力基本上未被降低；和(c)上述多肽类的模拟物，而该模拟物与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力基本上未被降低。
在其它实施方案中，所述的多肽包括选自下列一组序列的序列(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ IDNO147和284)、ALLPAVSSL(SEQ ID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO185和293)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO241)、VLDFAPPGAS(SEQ ID NO411)；(b)在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面有差异的上述序列的变异体，该变异体与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力基本上未被降低；和(c)上述多肽的模拟物，而该模拟物与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力基本上未被降低。模拟物可以含有氨基酸与一种或多种氨基酸模拟物或可以是完整的十肽模拟物。
本发明在其它方面提供了含有WT1蛋白免疫原性部分的变异体的多肽，其中所述的变异体因在所述免疫原性部分中的1-3位氨基酸上发生了取代而不同于所述的免疫原性部分，从而使得该变异体与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力相对于天然WT1蛋白得到了提高。
本发明进一步提供了编码上述WT1多肽的WT1多核苷酸。
本发明在其它方面提供了药物组合物和疫苗。药物组合物可以含有上述多肽或模拟物和/或一种或多种下列成分(i)一种WT1多核苷酸；(ii)一种与WT1多肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段；(iii)与WT1多肽发生特异性反应的T细胞；或(iv)一种表达WT1多肽的抗原呈递细胞，该药物组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。疫苗含有上述多肽和/或一种或多种下列成分(i)一种WT1多核苷酸；(ii)一种表达WT1多肽的抗原呈递细胞；或(iii)一种抗独特型抗体，该疫苗还包含非特异性免疫反应增强剂。在某些实施方案中，天然WT1多肽中的23个以下的连续氨基酸残基、优选17个以下的氨基酸残基存在于这类药物组合物和疫苗中所用的WT1多肽内。所述免疫反应增强剂可以是一种佐剂。优选地，免疫反应增强剂增强T细胞反应。
本发明进一步提供了增强或诱导患者体内免疫应答的方法，该方法包括对患者施用上述药物组合物或疫苗的步骤。在某些实施方案中，所述的患者是人。
本发明进一步提供了用于抑制患者体内恶性疾病发生的方法，该方法包括对患者施用上述药物组合物或疫苗的步骤。恶性疾病包括但不限于白血病(例如急性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病)和癌症(例如乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或胃肠癌或黑素瘤)。所述患者可能但不一定受到所述恶性疾病的侵害且所述药物组合物或疫苗的施用可以抑制这类疾病的发作或可以抑制所患疾病的发展和/或转移。
本发明在其它方面进一步提供了用于从骨髓和/或外周血液或其级分中除去表达WT1的细胞的方法，该方法包括使骨髓、外周血液或骨髓或外周血液的级分与和WT1多肽发生特异性反应的T细胞接触的步骤，其中该接触步骤在足以将WT1阳性细胞除去以至于使WT1阳性细胞数量少于骨髓、外周血液或级分中骨髓或淋巴细胞数量的10％、优选少于5％且更优选少于1％的条件和时间下进行。骨髓、外周血液和级分可以取自患与WT1表达相关的疾病的患者或可以取自未患这类疾病的人或非人类哺乳动物。
本发明在相关的方面提供了用于抑制患者体内恶性疾病发生的方法，该方法包括对患者施用上述制备的骨髓、外周血液或骨髓或外周血液的级分的步骤。这类骨髓、外周血液或级分可以是自体的或可以来源于相关或非相关的人或非人类动物(例如同源的或异源的)。
本发明在其它方面提供了用于刺激(或引发)和/或扩增T细胞的方法，该方法包括在足以刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下使T细胞与WT1多肽接触的步骤。这类T细胞可以是自体的、异源的、同源的或非相关的WT1-特异性T细胞且可以进行体外或体内刺激。在某些实施方案中，被扩增的T细胞可以存在于骨髓、外周血液或骨髓或外周血液的级分中且可以(但不一定)是克隆的。在某些实施方案中，T细胞可以在刺激和/或扩增过程中存在于哺乳动物体内。例如，可以在供体淋巴细胞输注中使用WT1-特异性T细胞。
本发明在相关的方面提供了用于抑制患者体内恶性疾病发生的方法，该方法包括对患者施用上述制备的T细胞的步骤。在某些实施方案中，这类T细胞可以是自体的、同源的或异源的。
本发明在其它方面进一步提供了用于监测患者体内与WT1表达相关的恶性疾病的免疫接种或疗法有效性的方法。这类方法基于监测患者体内的抗体、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞应答。在某些这类方面中，方法可以包括下列步骤(a)将第一种生物样品与一种或多种下列成分一起进行温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中所述的第一份生物样品取自治疗或免疫接种前的患者且其中所述的温育在足以使免疫复合物形成的条件和时间下进行；(b)检测该生物样品中WT1多肽与抗体之间形成的与WT1多肽特异性结合的免疫复合物；(c)使用取自治疗或免疫后同一患者的第二份生物样品重复步骤(a)和(b)；和(d)比较第一份和第二份生物样品中检测到的免疫复合物的数量，且由此监测患者中治疗或免疫接种的有效性。
在上述方法的某些实施方案中，检测步骤包括(a)将所述的免疫复合物与能够结合该免疫复合物的检测试剂一起进行温育，其中所述的检测试剂包括报道基因，(b)除去未结合的检测试剂；和(c)检测是否存在或不存在所述的报道基因。例如，该检测试剂例如可以包含第二种抗体或其抗原结合片段，它们能够结合与WT1多肽或诸如蛋白质A这样的分子特异性结合的抗体。在其它实施方案中，报道基因与WT1多肽结合且检测步骤包括除去未结合的WT1多肽且随后检测存在或不存在所述报道基因。
在其它方面中，提供了与患者体内WT1表达相关的恶性疾病的免疫或疗法有效性的监测方法，该方法可以包括下列步骤(a)将第一种生物样品与一种或多种下列成分一起进行温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中所述的生物样品包含CD4+T细胞和/或CD8+T细胞且取自治疗或免疫接种前的患者且其中所述的温育在足以使T细胞特异性活化、增殖和/或裂解的条件和时间下进行；(b)检测所述T细胞的活化、增殖和/或裂解的量；(c)使用包含CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的第二份生物样品重复步骤(a)和(b)，其中所述的第二份生物样品取自治疗或免疫接种后的同一患者；和(d)比较第一份与第二份生物样品中T细胞的活化、增殖和/或裂解的量，且由此监测患者中治疗或免疫接种的有效性。
本发明进一步提供了抑制与患者体内WT1表达相关的恶性疾病发生的方法，该方法包括下列步骤(a)将分离自患者的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞与一种或多种下列成分一起进行温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，使得T细胞增殖；和(b)对所述患者施用有效量的增殖的T细胞且由此抑制患者体内的恶性疾病发生。在某些实施方案中，可以将温育步骤重复一次或多次。
本发明在其它方面提供了抑制与患者体内WT1表达相关的恶性疾病发生的方法，该方法包括下列步骤(a)将分离自患者的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞与一种或多种下列成分一起进行温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，使得T细胞增殖；(b)克隆一种或多种增殖的细胞；和(c)对所述患者施用有效量的克隆的T细胞。
本发明在其它方面提供了测定患者体内存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病的方法，该方法包括下列步骤(a)将分离自患者的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞与一种或多种下列成分一起进行温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；和(b)检测存在或不存在所述T细胞的特异性活化，由此测定存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病。在某些实施方案中，检测步骤包括检测存在或不存在T细胞增殖。
本发明在其它方面提供了测定患者体内存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病的方法，该方法包括下列步骤(a)将取自患者的生物样品与一种或多种下列成分一起进行温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中该温育步骤在足以使免疫复合物形成的条件和时间下进行；和(b)检测所述生物样品中WT1多肽与抗体之间形成的特异性结合WT1多肽的免疫复合物；且由此测定存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病。
本发明的这些和其它方面通过参照下列详细描述和附图而变得更加清楚。将本文公开的所有参考文献的全部内容引入本文作为参考，就如同将它们各自引入一样。


附图1描绘了小鼠(MO)与人(HU)WT1蛋白质序列(分别为SEQID NO320和319)的比较。
附图2是表示检测患有血癌(AML)患者的WT1特异性抗体的蛋白质印迹。泳道1表示分子量标准品；泳道2表示阳性对照(用WT1特异性抗体免疫沉淀的WT1阳性人白血病细胞系)；泳道3表示阴性对照(用小鼠血清免疫沉淀的WT1阳性细胞系)；且泳道4表示用患有AML的患者的血清免疫沉淀的WT1阳性细胞系。就泳道2-4而言，通过凝胶电泳分离免疫沉淀物并用WT1特异性抗体进行探测。
附图3是表示检测免疫接种了WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的B6小鼠体内的WT1特异性抗体应答的蛋白质印迹。泳道1、3和5表示分子量标准量且泳道2、4和6表示WT1特异性阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，包含WT1蛋白质N-末端区域的180个氨基酸、在蛋白质印迹上迁移到52kD位置上的多肽)。所用的初次抗体是泳道2中的WT180、泳道4中的未免疫接种的B6小鼠血清和泳道6中免疫接种的B6小鼠的血清。
附图4是表示检测免疫接种有代表性的WT1肽的小鼠体内WT1特异性抗体的蛋白质印迹。泳道1、3和5表示分子量标准品且泳道2、4和6表示WT1特异性阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，包括WT1蛋白质N-末端区域的180个氨基酸、在蛋白质印迹上迁移到52kD位置上的多肽)。所用的初次抗体是泳道2中的WT180、泳道4中的未免疫接种的B6小鼠血清和泳道6中免疫接种的B6小鼠的血清。
附图5A-5C是刺激免疫接种有代表性的WT1肽的小鼠体内增殖T细胞应答的示意图。使用所示的一种T细胞系和两种不同克隆进行胸苷结合试验并将结果表示为cpm。在x轴上表示的对照组是无抗原(No Ag)和B6/培养基；所用的抗原是p6-22人(p1)、p117-139(p2)或p244-262人(p3)。
附图6A和6B是表示刺激免疫接种了有代表性的WT1肽的小鼠体内增殖T细胞应答的直方图。第三次免疫接种后3周将接种了疫苗A或疫苗B的小鼠脾细胞与单独的培养基(培养基)或脾细胞和培养基(B6/无抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)、p244-262(p244)(疫苗A；附图6A)或p287-301(p287)、p299-313(p299)、p421-435(p421)(疫苗B；附图6B)刺激的B6脾细胞和用25μg/ml非相关对照肽(非相关肽)刺激的脾细胞一起培养并在96小时后通过(3H)胸苷结合检测增殖情况。棒形图代表刺激指数(SI)，将其计算为实验孔平均值除以对照(不含抗原的B6脾细胞)平均值。
附图7A-7D是表示对p117-139和p6-22具有特异性的增殖T-细胞系和克隆产生的示意图。体内免疫接种后，分别使用疫苗A或B的所有三种肽类进行最初的三种体外刺激(IVS)。随后仅使用两种相关肽p117-139和p6-22以单肽刺激形式进行IVS。克隆来源于如示p6-22和p117-139的特异性T细胞系。将T细胞与单独的培养基(培养基)或脾细胞和培养基(B6/无抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)或25μg/ml非相关对照肽(非相关肽)刺激的B6脾细胞一起培养并在96小时后通过(3H)胸苷结合检测增殖情况。棒形图代表刺激指数(SI)，将其计算为实验孔平均值除以对照(不含抗原的B6脾细胞)平均值。
附图8A和8B代表(SEQ ID NO319)对具有引发Th应答潜力的人WT1肽的TSITES分析结果。由“A”表示的区域是区组的AMPHI中点，“R”表示与Rothbard/′Taylor基元配对的残基，“D”表示与IAd基元配对的残基；且‘d’表示与IEd基元配对的残基。
附图9A和9B是在免疫接种了WT1肽的小鼠体内引起WT1肽-特异性CTL的示意图。附图9A显示了同种异体细胞系裂解靶细胞以及附图9B表示肽包被的细胞系的裂解。在每种情况中，以三种所示的效应物靶细胞表示％裂解度(如标准铬释放试验所测定的)。提供了淋巴瘤细胞(LSTRA和E10)和E10+p235-243(E10+P235)的结果。E10细胞在本文中也称作EL-4细胞。
附图10A-10D是给B6小鼠免疫接种了WT1肽P117后引发杀伤WT1阳性肿瘤细胞系而不杀伤WT1阴性细胞系的WT1特异性CTL的示意图。附图10A表明未被免疫接种的B6小鼠的T-细胞不会杀伤WT1阳性肿瘤细胞系。附图10B表明通过同种异体细胞系裂解靶细胞。附图10C和10D表示与两种不同实验中WT1阴性细胞系相比WT1阳性肿瘤细胞系的裂解。此外，附图10C和10D表示肽包被的细胞系的裂解(包被了相关WT1肽P117的WT1阴性细胞系E10)。在每种情况中，以三种所示的效应物靶细胞表示％裂解度(如标准铬释放试验所测定的)。提供了淋巴瘤细胞(E10)、前列腺癌细胞(TRAMP-C)、被转化的成纤维细胞系(BLK-SV40)和E10+p117的结果。
附图11A和11B是表示有代表性的肽P117-139特异性CTL裂解WT1阳性肿瘤细胞的能力的示意图。第三次免疫接种后3周在体外用相关肽刺激接种了肽p235-243或p117-139的小鼠脾细胞并测试其裂解与WT1肽和WT1阳性和阴性肿瘤细胞一起进行温育的靶物的能力。棒形图代表对E∶T比为25∶1的一式三份样品进行铬释放试验的％特异性裂解度的平均值。附图11A表示所示p235-243特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、用相关(用于免疫接种和用于再刺激)肽p235-243(EL-4+p235EL-4)刺激的EL-4、用非相关肽p117-139(EL-4+p117)、p126-134(EL-4+p126)或p130-138(EL-4+p130)刺激的EL-4和WT1阳性肿瘤细胞BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)和TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)的细胞毒活性。附图11B表示所示p117-139特异性T细胞系对EL-4、用相关肽P117-139(EL-4+p117)刺激的EL-4和用非相关肽p123-131(EL-4+p123)或p128-136(EL-4+p128)刺激的EL-4、BLK-SV40和TRAMP C的细胞毒性活性。
附图12A和12B是表明如冷靶抑制所示的WT1阳性肿瘤细胞裂解特异性的直方图。棒形图代表对E∶T比为25∶1的一式三份样品进行的铬释放试验的％特异性裂解度的平均值。附图12A表示所示p117-139特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)、与10倍过量(与热靶相比)的用相关肽p117-139(TRAMP-C+p117冷靶)进行了刺激而没有进行51Cr标记的EL-4细胞一起温育的TRAMP-C细胞和与用非相关肽刺激而没有进行51Cr标记的EL-4一起温育的TRAMP-C细胞(TRAMP-C+非相关冷靶)的细胞毒性活性。附图12B表示所示p117-139特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、WT1阳性肿瘤细胞系BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)、与相关冷靶(BLK-SV40+p117冷靶)一起温育的BLK-SV40细胞和与非相关冷靶一起温育的BLK-SV40细胞(BLK SV40+非相关冷靶)的细胞毒活性。
附图13A-13C是描述对p117-139内的9聚体CTL表位进行评价的直方图。对含有或不含适宜I型H-2b结合基元的aa117-139内的肽进行p117-139肿瘤特异性CTL系的测试且然后用p126-134或p130-138进行再刺激。棒形图代表对E∶T比为25∶1的一式三份样品进行的铬释放试验的％特异性裂解度的平均值。附图13A表示p117-139特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)和用肽p117-139(EL-4+p117)、p119-127(EL-4+p119)、p120-128(EL-4+p120)、p123-131(EL-4+p123)、p126-134(EL-4+p126)、p128-136(EL-4+p128)和p130-138(EL-4+p130)刺激的EL-4细胞的细胞毒活性。附图13B表示用p126-134再刺激后的CTL系对WT1阴性细胞系EL-4、用p117-139(EL-4+p117)、p126-134(EL-4+p126)刺激的EL-4细胞和WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。附图13C表示用p130-138再刺激后的CTL系对EL-4、用p117-139(EL-4+p117)、p130-138(EL-4+p130)刺激的EL-4细胞和WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。
附图14描绘了63位AML患者体内血清抗体对WT1的反应性。在AML患者中通过ELISA评价血清抗体对WT1/N-末端蛋白的反应性。第一和第二泳道分别代表阳性对照和阴性对照。第一和第二泳道分别代表阳性对照和阴性对照。将商购得到的WT1特异性抗体WT180用作阳性对照。以下63个泳道代表使用来自每位患者的血清所得到的结果。所述OD值得自采用1∶500血清稀释度的ELISA。附图包括得自3次独立实验的累积数据。
附图15描绘了2位AML患者体内血清抗体对WT1蛋白和对照蛋白的反应性。通过对2位AML患者进行的ELISA评价血清抗体对WT1/全长、WT1N-末端、TRX和Ra12蛋白的反应性。所述OD值得自采用1∶500血清稀释度的ELISA。AML1和AML-2表示来自证实抗体对WT1/全长反应性的附图1中个体患者中的2位患者的血清。将WT1全长蛋白以与Ra12的融合蛋白的形式被表达。将WT1/N-末端蛋白以与TRX的融合蛋白的形式被表达。按照类似方式纯化对照Ra12和TRX蛋白。结果证实血清抗体对WT1融合蛋白的反应性定位于该蛋白中的WT1部分。
附图16描绘了81位CML患者体内血清抗体对WT1的反应性。在AML患者中通过ELISA来评价血清抗体对WT1/全长蛋白的反应性。第一和第二泳道分别代表阳性对照和阴性对照。将商购得到的WT1特异性抗体WT180用作阳性对照。以下81个泳道代表使用来自每一个体患者的血清得到的结果。所述OD值来自采用1∶500血清稀释度的ELISA。附图包括来自3次独立实验的累积数据。
附图17描绘了2位CML患者体内血清抗体对WT1蛋白和对照蛋白的反应性。在2位CML患者中通过ELISA来评价血清抗体对WT1/全长、WT1N-末端、TRX和Ra12蛋白的反应性。所述OD值来自采用1∶500血清稀释度的ELISA。CML1和CML-2表示来自证实抗体对WT1/全长反应性的附图3中个体患者中的2位患者的血清。将WT1/N-末端全长蛋白以与Ra12的融合蛋白形式被表达。将WT1/N-末端蛋白以与TRX的融合蛋白形式被表达。按照类似方式纯化对照Ra12和TRX蛋白。结果证实血清抗体对WT1融合蛋白的反应性定位于该蛋白中的WT1部分。
附图18提供了用于血清学分析的重组WT1蛋白的特征。
附图19A-19E是描绘由免疫接种不同剂量WT1蛋白引发的小鼠体内抗体应答的棒形图。
附图20A和20B是描绘免疫接种了WT1蛋白的小鼠体内的增殖T-细胞应答的棒形图。
附图21是利用荧光显微镜检查腺WT1和牛痘WT1感染后表达WT1的人DC的照片。
附图22是表示腺WT1感染后人DC中WT1表达是可再现的并且未被对照腺感染诱导的照片。
附图23是表示WT1完整基因体外接触抗原引发WT1特异性T-细胞应答的IFN-γELISPOT试验的示意图。
发明详述如上所述，本发明一般涉及用于免疫疗法和恶性疾病诊断的组合物和方法。本文所述的组合物可以包括WT1多肽、WT1多核苷酸、表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC，例如树突细胞)、诸如结合WT1多肽和/或对WT1具有特异性的免疫系统细胞(例如T细胞)的抗体这样的活性剂。本发明的WT1多肽一般至少包含Wilms肿瘤基因产物(WT1)的一部分或其变异体。本发明的核酸序列一般包括编码这类多肽的全部或一部分的DNA或RNA序列或与该序列互补的序列。抗体一般是能够结合一部分WT1多肽的免疫系统蛋白质或其抗原结合片段。可以在这类组合物中使用的T细胞一般是对WT1多肽具有特异性的T细胞(例如CD4+和/或CD8+)。本文所述的某些方法进一步使用了表达如本文提供的WT1多肽的抗原呈递细胞。
本发明基于对针对Wilms肿瘤(WT)基因产物(例如WT1)产生的免疫反应可以为患有特征在于WT1基因表达增加的恶性疾病的患者提供预防和/或治疗益处的发现。这类疾病包括但不限于白血病(例如急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和儿童ALL)以及诸如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃肠癌和黑素瘤这样的多种癌症。最初鉴定了WT1基因并基于患Wilms肿瘤的患者体内染色体11p13上的细胞遗传缺失来进行分离(参见Call等，美国专利US 5,350,840)。基因由10个外显子组成且编码锌指转录因子，且在附图1以及SEQ ID NO319和320中提供了小鼠和人WT1蛋白的序列。
WT1多肽类在本发明的上下文中，WT1多肽是至少包含本文所述的天然WT1的免疫原性部分的(即由未被遗传修饰的生物体表达的WT1部分)多肽或其变异体。WT1多肽可以是任意长度，条件是它至少包含天然蛋白质的免疫原性部分或其变异体。换句话说，WT1多肽可以是寡肽(即由肽键连接的相对少量的氨基酸残基、诸如8-10个残基组成)、全长WT1蛋白质(例如存在于人或非人动物、诸如小鼠体内)或中等大小的多肽。在某些实施方案中，优选采用含有天然WT1多肽的少量连续氨基酸残基的WT1多肽。优选这类多肽用于需要产生T细胞应答的某些应用。例如，这类WT1多肽可以含有23个以下、优选不超过18个且更优选不超过15个天然WT1多肽的连续氨基酸残基。包含9个天然WT1多肽的连续氨基酸残基的多肽一般适用于此目的。其它来源于天然蛋白质和/或异源序列的序列可以存在于任何WT1多肽中且这类序列可以(但不一定)具有其它免疫原性或抗原特性。本文提供的多肽可以进一步(以共价键方式或非共价键方式)与其它多肽或非-多肽化合物进行连接。
本文所用的“免疫原性部分”是被B-细胞和/或T-细胞表面抗原受体所识别的(即特异性结合的)多肽部分。某些优选的免疫原性部分与I类或II类MHC分子结合。认为本文所用的免疫原性部分″结合″I类或II类MHC分子，条件是这种结合能够使用本领域中公知的任何测定法来检测。例如，可以通过监测促进125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入MHC I类/p2m/肽异三聚体复合物的能力而间接评价多肽与MHC I类分子的结合能力(参见Parker等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)152163，1994)。另一方面，可以采用本领域中公知的功能肽竞争试验。某些免疫原性部分带有表II-XIV中的一个或多个表内所示的序列。有代表性的免疫原性部分包括但不限于RDLNALLPAVPSLGGGG(人类WT1残基6-22；SEQ ID NO1)、PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(人和小鼠WT1残基117-139；分别为SEQ ID NO2和3)、GATLKGVAAGSSSSVKWTE(人类WT1残基244-262；SEQ ID NO4)、GATLKGVAA(人类WT1残基244-252；SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(人和小鼠WT1残基235-243；分别为SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(小鼠WT1残基136-144；SEQ ID NO296)、SCLESQPAI(人WT1残基136-144；SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(人和小鼠WT1残基225-233；分别为SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(小鼠WT1残基10-18；SEQ ID NO255)、RMFPNAPYL(人和小鼠WT1残基126-134；分别为SEQ ID NO185和293)、VLDFAPPGA(人WT1残基37-45；SEQ ID NO241)或VLDFAPPGAS(人WT1残基37-46；SEQ ID NO411)。其它免疫原性部分在本文中被提供且另一些免疫原性部分一般采用众所周知的技术来进行鉴定，诸如那些概括在Paul，《基础免疫学》(FundamentalImmunology)，第3版，243-247(Raven Press，1993)及其中引用的参考文献中的技术。用于鉴定免疫原性部分的具有代表性的技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆的反应能力。天然WT1多肽的免疫原性部分是与这类抗血清和/或T-细胞以基本上不低于全长WT1反应性的水平发生反应的部分(例如在ELISA和/或T-细胞反应性试验中)。换句话说，在这类试验中免疫原性部分可以以类似于或高于全长多肽反应性的水平反应。一般使用本领域技术人员熟知的方法来进行这类筛选，诸Harlow和Lane在《抗体实验指南》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，1988中所描述的那些技术。
另一方面，可以使用诸如Tsites程序(参见Rothbard和Taylor，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)793-100，1988；Deavin等，《分子免疫学》(Mol.Immunol.)33145-155，1996)这样检索具有引发Th应答能力的肽基元的计算机分析来鉴定免疫原性部分。可以按照BIMAS(Parker等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)152163，1994)和其它HLA肽结合预测分析来鉴定带有适合于结合鼠和人MHC I类或II类的基元的CTL肽类。为了证实免疫原性，可以使用HLA A2转基因小鼠模型和/或利用树突细胞、成纤维细胞或外周血细胞的体外刺激试验来测试肽。
如上所述，组合物可以包含天然WT1蛋白质的变异体。本文所用的多肽″变异体″是在一种或多种取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然多肽的多肽，而保留了该多肽的免疫原性(即该变异体与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆的反应能力与天然多肽相比基本上没有降低)。换句话说，变异体与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆的反应能力与天然多肽相比可能得到增强或未发生改变或与所述天然多肽相比，降低程度可能低于50％且优选低于20％。如本文所述一般通过修饰上述多肽序列之一并评价被修饰多肽与抗血清和/或T-细胞的反应性来鉴定这类变异体。在本发明范围内已经发现在WT1多肽的免疫原性部分中发生相对少量的取代(例如1-3)可以起到增强所述多肽引发免疫应答能力的作用。一般可以通过使用如上所述的计算机程序来鉴定合适的取代且基于如本文所述的被修饰多肽与抗血清和/或T-细胞的反应性来证实这种作用。因此，在某些优选的实施方案中，WT1多肽包括免疫原性部分中的1-3个氨基酸残基被取代的变异体，从而使得与抗原特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力在统计学意义上高于未被修饰的多肽。这类取代优选位于可以进行上述鉴定的多肽MHC结合位点中。优选的取代使得与MHC I类或II类分子的结合增加了。
某些变异体含有保守取代。保守取代”是一种氨基酸被取代为另一种具有相似特性的氨基酸的取代，以致于肽化学领域的普通技术人员可以预测多肽的二级结构和亲水性质基本上未被改变。一般可以基于残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性上的相似性来进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而含有具有相似亲水值的不带电荷的极性端基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；以及丝氨酸、苏氨酸、苯并氨酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其它组氨基酸包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变异体还可以或可选地含有非保守改变。还可以(或可选地)例如通过对所述多肽免疫原性、二级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸缺失或添加来修饰变异体。
在一个优选的实施方案中，构建了WT1 N-末端(第1-249位氨基酸)的变异体多肽，其中该变异体多肽能够与识别全长WT1和/或WT1N-末端多肽的抗体结合。抗体的非限制性实例是抗WT1抗体WT180(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)。
如上所述，WT1多肽类可以与共翻译或翻译后指导蛋白质转移的蛋白质N-末端上的信号(或前导)序列结合。多肽还可以或可选地与易于合成、纯化或鉴定所述多肽(例如聚-His)的接头或其它序列结合或促进所述多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区结合。
可以使用多种众所周知的技术中的任意一种制备WT1多肽。可以由多核苷酸便利地制备由本文所述的WT1多核苷酸编码的重组多肽。一般来说，可以使用本领域技术人员所公知的多种表达载体中的任意一种来表达重组WT1多肽。可以在已经用含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任意适宜宿主细胞中实现表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高级真核细胞。优选所用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或诸如COS或CHO这样的哺乳动物细胞系。可以首先使用商购的滤膜浓缩来自将重组蛋白质或多肽分泌入培养基中的适宜宿主/载体系统的上清液。然后可以将该浓缩液施用在诸如亲和基质或离子交换树脂这样合适的纯化基质上。最后可以将一个或多个反相HPLC步骤用于进一步纯化重组多肽。可以将这类技术用于制备天然多肽或其变异体。例如，一般可以使用诸如寡核苷酸-定点-特异性突变这样的标准突变技术来制备编码天然多肽变异体的多核苷酸且可以除去部分DNA序列以制备截短的多肽。
还可以通过合成方式、使用本领域技术人员所知的技术来生成某些部分和其它变异体。例如，可以合成具有少于约500个氨基酸、优选少于约100个氨基酸且更优选少于约50个氨基酸的多肽。可以使用诸如Merrifield固相合成法这样通过商业途径得到的固相技术来合成多肽，其中向增长的氨基酸链上依次添加氨基酸。参见Merrifield，《美国化学协会杂志》(J Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963。自动合成多肽的设备商购自诸如Applied BioSystems，Inc.(Foster City，CA)这样的供应商且可以按照制造商提供的说明书进行操作。
总之，分离出了本文所述的多肽和多核苷酸。″分离的″多肽或多核苷酸是从其原始环境中取出的一种多肽或多核苷酸。例如，分离天然存在的蛋白质，条件是它分离自天然系统中的某些或全部共存物质。优选地，这类多肽至少具有约90％纯度、更优选至少具有约95％纯度且最优选至少具有约99％纯度。例如，如果将多核苷酸克隆到不属于天然环境的载体，那么认为该多核苷酸能被分离。
本发明在其它方面中提供了WT1多肽的模拟物。这类模拟物可以包括与一种或多种氨基酸模拟物连接的氨基酸(即WT1蛋白质内的一个或多个氨基酸可以被氨基酸模拟物所取代)或可以是完全的非肽模拟物。氨基酸模拟物是在构象上类似于氨基酸的化合物，以致于它可以取代WT1多肽内的氨基酸而基本上不会降低与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆进行反应的能力。非肽模拟物是不含氨基酸且与WT1多肽具有相似的总体构象的化合物，以致于该模拟物与WT1-特异性抗血清和/或T细胞系或克隆的反应能力与WT1多肽的能力相比基本上没有被降低。可以基于评价肽序列三维结构的标准技术(例如核磁共振和计算机技术)设计这类模拟物。可以设计出这样的模拟物，其中WT1多肽中的一个或多个侧链官能团被并不一定具有相同大小或体积但具有产生类似生物反应的相似化学和/或物理特性的基团所取代。应理解在本文所述的实施方案中，模拟物可以取代WT1多肽。
在其它解释性实施方案中，多肽可以是包含如本文所述的多个多肽或至少包括一个如本文所述的多肽和非相关序列的融合多肽，诸如已知的肿瘤蛋白。例如，融合配偶体可以有助于提供T辅助细胞表位(免疫融合配偶体)、优选被人类识别的T辅助细胞表位或可以有助于以高于天然重组蛋白的产率表达所述蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合配偶体是免疫和增强表达的融合配偶体。可以选择其它融合配偶体以便增加所述多肽的溶解度或能够使所述多肽靶向至所需胞内区室。其它融合配偶体包括有利于所述多肽纯化的亲和标记物。
一般可以使用包括化学结合在内的标准技术来制备融合多肽。优选在表达系统中以重组多肽的形式表达融合多肽，从而使其产量高于非融合多肽。简单地说，可以分别装配编码多肽成分的DNA序列并将其连接到适宜的表达载体中。使用或不使用肽接头将编码一种多肽成分的DNA序列的3′端与编码第二种多肽成分的DNA序列的5′端连接起来，以使所述序列的读框同相。这样就翻译成保留两种多肽成分的生物活性的单一融合多肽。
可以将肽接头序列用于将第一种与第二种多肽成分分隔至足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构的距离。使用本领域中已知的标准技术将这种肽接头序列结合到融合多肽中。可以根据下列因素选择合适的肽接头序列(1)其形成柔性延伸构象的能力；(2)它不形成可以与第一种和第二种多肽上的功能表位发生相互作用的二级结构的能力；和(3)缺少可与所述多肽功能表位发生相互作用的疏水或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。还可以在所述接头序列中使用诸如Thr和Ala这样的其它接近中性的氨基酸。可以用作接头的氨基酸序列包括那些在下列文献中公开的氨基酸序列Maratea等，《基因》(Gene)4039-46，1985；Murphy等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838258-8262，1986；美国专利US4,935,233和美国专利US 4,751,180。所述接头序列一般可以具有1-约50个氨基酸的长度。当第一种和第二种多肽带有可以用于分离功能结构域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区域时，并非需要接头序列。
连接的DNA序列与合适的转录或翻译元件可操作地连接。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一种多肽的DNA序列的5′端。类似地，终止翻译所需的终止密码子和转录终止信号仅位于编码第二种多肽的DNA序列的3′端。
所述融合多肽可以包含本文所述的多肽和非相关免疫原性蛋白，诸如能够引发回忆应答的免疫原性蛋白。这类蛋白质的实例包括破伤风、结核和肝炎蛋白(例如，参见Stoute等《新英格兰药物杂志》NewEngl.J.Med.，33686-91，1997)。
在一种优选的实施方案中，所述的免疫原性融合配偶体来源于分枝杆菌属的菌种，诸如结核分枝杆菌衍生的Ra12片段。在美国专利申请60/158,585中描述了Ra12组合物及其用于提高异源多核苷酸/多肽序列表达和/或免疫原性的方法，将该文献的全部公开内容引入本文作为参考。简单地说，Ra12指的是属于结核分枝杆菌MTB32A核酸亚序列的多核苷酸区域。MTB32A是由结核分枝杆菌的毒性菌株和强毒株中的基因编码的32KD分子量的丝氨酸蛋白酶。已经描述了MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(例如，美国专利申请60/158,585；另外参见，Skeiky等，《感染与免疫》(Infection and Immun.)(1999)673998-4007，将这些文献引入本文作为参考)。MTB32A编码序列的C-末端片段以高水平表达且在整个纯化过程中作为可溶性多肽保留下来。此外，Ra12可以增强所融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一种优选的Ra12融合多肽包含对应于MTB32A的第192-323位氨基酸残基的14 KD C-末端片段。其它优选的Ra12多核苷酸一般包含编码Ra12多肽部分的至少约15个连续核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸或至少约300个核苷酸。Ra12多核苷酸可以包含天然序列(即编码Ra12多肽或其部分的内源序列)或可以包含这类序列的变异体。Ra12多核苷酸变异体可以含有一种或多种取代、添加、缺失和/或插入，而所编码的融合多肽的生物活性相对于包含天然Ra12多肽的融合多肽而言基本上不会降低。变异体优选地与编码天然Ra12多肽或其部分序列的多核苷酸序列具有至少约70％的相同性、更优选至少约80％的相同性且最优选至少约90％的相同性。
在其它优选的实施方案中，免疫融合配偶体来源于蛋白质D，它是革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，蛋白质D衍生物包含约三分之一的该蛋白质(例如N-末端的头100-110个氨基酸)且蛋白质D衍生物可以被脂化。在某些优选的实施方案中，N-末端包含脂蛋白D融合配偶体的头109个残基以提供带有其它外源T-细胞表位的多肽并提高了在大肠杆菌中的表达水平(由此起表达增强子的作用)。脂类尾部确保抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。其它融合配偶体包括源自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般使用N-末端的81个氨基酸，不过，还可以使用包括T-辅助细胞表位在内的不同片段。
在另一种实施方案中，免疫融合配偶体是被称作LYTA的蛋白质或其部分序列(优选C-末端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌，它合成一种被称作酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；《基因》(Gene)43265-292，1986)。LYTA是一种特异性裂解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白的C-末端结构域是导致对胆碱或某些诸如DEAE这样的胆碱类似物的亲和作用。已经利用该特性来研发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经记载了氨基末端含有C-LYTA片段的杂蛋白的纯化方法(参见《生物技术》(Biotechnology)10795-798，1992)。在一个优选的实施方案中，可以将LYTA的重复部分组合到融合多肽中。在起始于第178位残基的C-末端区内发现了重复部分。特别优选的重复部分组入了第188-305位残基。
另一个说明性质的实施方案涉及融合多肽类及其编码它们的多核苷酸，其中所述的融合配偶体包含一个能够使多肽定位于内体/溶酶体区室的靶向信号，如美国专利US 5,633,234中所述。当与靶向信号融合时，本发明的免疫原性多肽会更有效地与MHC II类分子结合且由此增强了对所述多肽具有特异性的CD4+T-细胞的体内刺激。
本发明提供了可以在大肠杆菌中以重组方式表达但没有添加融合配偶体的截短形式的WT1多肽类。这些截短形式的实例如SEQ IDNO342-346中所示且由SEQ ID NO337-341中所示的多核苷酸编码。在这些截短的变化形式中，WT1的头76个氨基酸可以与该蛋白质的C-末端融合，从而产生更易于在大肠杆菌中表达的重组蛋白。还可以使用包括大肠杆菌在内的其它宿主，诸如例如巨大芽孢杆菌。可以进一步制备不含组氨酸标记物的蛋白质。
在其它实施方案中，可以制备不同的亚单位并使之按顺序彼此融合在一起，它不同于天然WT1的亚单位。此外，例如，可以制备与Ra12的融合体。范例性的融合蛋白如SEQ ID NO332-336中所示且可以由SEQ ID NO327-331中所示的多核苷酸编码。
WT1多核苷酸编码本文所述的WT1多肽的任意一种多核苷酸是本发明所包括的WT1多核苷酸。这类多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。其它编码或非编码序列可以但不一定存在于本发明的多核苷酸中且多核苷酸可以但不一定与其它分子和/或载体物质连接。
WT1多核苷酸可以编码天然WT1蛋白质或可以编码本文所述的WT1变异体。多核苷酸变异体可以含有一种或多种取代、添加、缺失和/或插入，而所编码多肽的免疫原性相对于天然WT1蛋白质而言不会降低。一般按照本文所述的方法评价对所编码的多肽的免疫原性的作用。优选的变异体在不超过20％、优选不超过10％的编码天然WT1序列的免疫原性部分的核苷酸位置上含有核苷酸取代、缺失、插入和/或添加。某些变异体与天然基因或其部分序列基本上同源。这类多核苷酸变异体能够在中等严格条件下与编码WT1多肽的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。合适的中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃的5×SSC中杂交过夜；随后在65℃下用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2×SSC各洗涤两次，每次20分钟。这类杂交DNA序列也属于本发明的范围。
本领域的技术人员会理解由于遗传密码的简并现象，存在许多编码WT1多肽的核苷酸序列。这些核苷酸中的某些与任何天然基因中的核苷酸序列具有最低程度的同源性。不过，由于密码子应用上的差异而改变的多核苷酸是本发明特别关注的。
一旦如上所述鉴定了WT1的免疫原性部分，就可以使用多种技术中的任意一种制备WT1多核苷酸。例如，可以由表达WT1的细胞制备的cDNA来扩增WT1多核苷酸。可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增这类多核苷酸。就该手段而言，可以在所述的免疫原性部分的序列的基础上设计序列特异性引物而且可以进行商购或合成。例如，用于人WT1基因的PCR扩增的适宜引物包括第一步-P1181434-14145′GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3′(SEQ ID NO5)和P1355′CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3′(SEQ ID NO6)；第二步-P1365′GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3′(SEQID NO7)和P1375′GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A3′(SEQ ID NO8)。用于小鼠WT1基因的PCR扩增的引物包括第一步-P1385′TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3′(SEQ ID NO9)和P1395′GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3′(SEQ ID NO10)；第二步-P1405′GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3′(SEQ ID NO11)和P1415′GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACGTGG AGT TT 3′(SEQ ID NO12)。
然后采用众所周知的技术可以将扩增的部分用于从人类基因组DNA文库中或从合适的cDNA文库中分离全长基因。另一方面，可以由多个PCR片段构建全长基因。还可以通过合成寡核苷酸成分并使成分彼此连接成完整的多核苷酸来制备WT1多核苷酸。
还可以通过包括化学合成(例如固相亚磷酰胺化学合成)在内的本领域中所公知的任意方法来合成WT1多核苷酸。还可以利用诸如寡核苷酸定向位点特异性诱变在多核苷酸序列中引入修饰(参见Adelman等；DNA 2183，1983)。另一方面，可以通过编码WT1多肽的DNA序列的体外或体内转录来生成RNA分子，条件是使用RNA聚合酶启动子将DNA组合到载体(诸如T7或SP6)中。可以将某些部分序列用于制备本文所述的被编码的多肽。此外或另一方面，可以将部分序列施加给患者，从而使得被编码的多肽在体内生成(例如通过用编码WT1多肽的cDNA构建体转染诸如树突细胞这样的抗原呈递细胞并将被转染的细胞施加给患者)。
一般可以将编码WT1多肽的多核苷酸用于在体外或体内产生多肽。还可以将与编码序列(即反义多核苷酸)互补的WT1多核苷酸用作探针或用于抑制WT1的表达。还可以将转录成反义RNA的cDNA构建体组合到组织中以便有利于反义RNA的产生。
可以进一步修饰任何多核苷酸以便增加体内的稳定性。可能的修饰包括但不限于在5′和/或3′端上添加侧翼序列；使用主链中的硫代磷酸酯或2′O-甲基键而非磷酸二酯酶键；和/或包含非传统的碱基，诸如肌苷、queosine和wybutosine以及腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基、甲基、硫代和其它修饰形式。
可以采用已有重组DNA技术使本文所述的核苷酸序列与多种其它核苷酸序列进行连接。例如，可以将多核苷酸克隆到任何不同的克隆载体，包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生体和粘粒中。特别有意义的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。一般来说，载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、适当的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记。其它元件取决于所需的应用且对本领域技术人员而言是显而易见的。
在某些实施方案中，可以配制多核苷酸以使其进入哺乳动物细胞并在其中进行表达。这类配制品特别适用于下文所述的治疗目的。本领域技术人员会理解存在许多在靶细胞中实现多核苷酸表达的方式且可以采用任意合适的方法。例如，可以将多核苷酸导入病毒载体，诸如但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体或痘苗病毒载体或其它痘病毒载体(例如鸟类痘病毒)。用于将DNA组合到这类载体中的技术对本领域技术人员而言是已知的。反录病毒载体也可以转运或插入选择标记基因(有助于鉴定或选择被转导的细胞)和/或诸如编码特定靶细胞上的受体的配体的基因这样的靶向部分以便赋予该载体靶向特异性。还可以采用抗体、通过本领域技术人员所公知的方法来实现靶向作用。例如，可以将这类载体中的cDNA构建体用于转染人或动物细胞系以用于建立WT1阳性肿瘤模型，可以将这些模型用于进行肿瘤预防和过继免疫疗法实验以便证实这类细胞对肿瘤或白血病生长的抑制或裂解作用。
其它多核苷酸用治疗制剂包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子；和基于脂质的系统，包括水包油型乳剂、胶束、混合型胶束和脂质体。优选的用作体外和体内传递载体的胶体系统是脂质体(即人工膜囊泡)。这类系统的制备方法和用途在本领域中是众所周知的。
抗体及其片段本发明进一步提供了诸如抗体及其抗原结合片段这样与WT1多肽特异性结合的结合剂。认为本文所用的活性剂与WT1多肽“特异性结合”，条件是它在可检测的水平下(例如在ELISA中)与WT1多肽反应且在相似条件下检测不到与非相关蛋白质的反应。本文所用的“结合”指的是两种独立分子之间的非共价键结合，从而形成“复合物”。例如，可以通过测定形成所述复合物的结合常数来评价结合能力。结合常数是将所述复合物浓度除以成分产物浓度时所得到的数值。一般来说，在本发明的上下文中，认为当复合物形成的结合常数超过约103L/mol时，两种化合物发生了″结合″。可以使用本领域中众所周知的方法测定结合常数。
满足上述要求的任意活性剂可以是结合剂。在一个优选的实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。例如，某些抗体商购自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。另一方面，可以通过本领域技术人员所公知的多种技术中的任何一种来制备抗体。例如，参见Harlow和Lane，《抗体实验指南》(AntibodiesA LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般来说，通过包括本文所述的生成单克隆抗体在内的细胞培养技术或通过将抗体基因转染到适宜细菌或哺乳动物细胞宿主来生产抗体，从而产生重组抗体。在一种技术中，最初将包含所述多肽的免疫原注射到任意各种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊)体内。在该步骤中，本发明的多肽可以作为未加修饰的免疫原。另一方面，特别对相对短的多肽类而言，如果该多肽与诸如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白这样的载体蛋白连接，那么可以引发高级免疫应答。优选按照结合了一次或多次加强免疫接种的预定方案将免疫原注射到动物宿主体内并定期对动物进行取血。然后例如通过采用与适宜固体载体偶联的多肽而进行的亲和层析从这类抗血清中纯化出对所述多肽具有特异性的多克隆抗体。
例如，可以使用Kohler和Milstein在《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976中所述的技术及其改进技术制备对所关注的抗原多肽具有特异性的单克隆抗体。简单地说，这些方法包括制备能够产生具有所需特异性(即与所关注多肽的反应性)的抗体的无限增殖细胞系的方法。例如，由获自上述免疫接种动物的脾细胞产生这类细胞系。然后例如通过与黑素瘤细胞融合配偶体、优选一种与免疫接种动物同源的融合配偶体进行融合使脾细胞无限增殖。可以使用各种融合技术。例如，可以将脾细胞和黑素瘤细胞与非离子型洗涤剂混合几分钟后以低密度平铺在支持杂交细胞、但非黑素瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的选择技术利用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)选择法。在通常约为1-2周的足够的时间后，观察到杂种集落。选择单一集落并检测其培养物上清液对所述多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长的杂交瘤集落上清液中分离单克隆抗体。此外，可以将各种技术用于增加产量，诸如将杂交瘤细胞系注入诸如小鼠这样的适宜脊椎动物宿主的腹腔。然后从腹水或血液中收集单克隆抗体。可以通过诸如层析法、凝胶过滤、沉淀和提取这样的常规技术从抗体中除去污染物。可以在例如亲和层析步骤这样的纯化过程中使用本发明的多肽。
在某些实施方案中，可以优选采用抗体的抗原结合片段。这类片段包括可以使用标准技术制备的Fab片段。简单地说，可以通过蛋白质A珠柱上的亲和层析从兔血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，《抗体实验指南》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)并用木瓜蛋白酶进行消化未得到Fab和Fc片段。可以通过蛋白质A珠柱上的亲和层析分离Fab和Fc片段。
可以使单克隆抗体及其片段与一种或多种治疗剂偶联。这方面的合适活性剂包括例如可以用于体外净化自身骨髓的放射性示踪物和化疗剂。有代表性的治疗剂包括放射性核素、分化诱导物、药物、毒素及其衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、188Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括甲氨蝶呤和嘧啶和嘌呤类似物。优选的分化诱导物包括佛波酯类和丁酸。优选的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素、志贺菌属毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。为了诊断目的，可以将放射性活性剂的偶联体用于促进转移瘤的示踪或确定WT1-阳性肿瘤的位置。
可以直接或间接(例如通过连接基团)使治疗剂与合适的单克隆抗体偶联(例如共价结合)。活性剂与抗体之间的直接反应是可能的，此时它们各自带有能够彼此反应的取代基。例如，一种活性剂上诸如氨基或硫氢基这样的亲核基能够与另一活性剂上诸如酸酐或酰基卤这样的含羰基的基团反应或与含烷基的优良离去基团(例如卤化物)反应。
另一方面，需要通过连接基团使治疗剂与抗体偶联。连接基团可以起间隔基的作用以使抗体与活性剂之间存在距离，从而避免干扰结合能力。连接基团还可以用于增加活性剂或抗体上的取代基的化学反应性且由此提高偶联效率。化学反应性的增强还有利于活性剂或活性剂上官能团的应用，否则是不可能的。
可以将各种双功能或多功能试剂、即同功能和异功能试剂(诸如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的目录中所述的那些试剂)用作连接基团，这对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，可以通过氨基、羧基、硫氢基或氧化的糖残基进行偶联。存在大量描述这类方法的参考文献，例如Rodwell等的美国专利US 4,671,958。
如果治疗剂在不含本发明免疫结合物的抗体部分时更为有效，那么可能需要使用在摄入细胞过程中或摄入细胞时可裂解的连接基团。已经描述了许多不同的可裂解的连接基团。活性剂从这些连接基团向胞内释放的机制包括通过还原二硫键的裂解(例如授予Spitler的美国专利US 4,489,710)、通过照射光不稳定性键的裂解(例如授予Senter等的美国专利US 4,625,014)、通过水解衍生的氨基酸侧链的裂解(例如授予Kohn等的美国专利US 4,638,045)、通过血清补体介导的水解导致的裂解(例如授予Rodwell等的美国专利US 4,671,958)和通过酸催化的水解而导致的裂解(例如授予Blattler等的美国专利US 4,569,789)。
需要使一种以上的活性剂与抗体偶联。在一种实施方案中，使多个活性剂分子与一种抗体分子偶联。在另一种实施方案中，可以使一种以上的活性剂与一种抗体偶联。可以按照各种方式制备与一种以上活性剂结合的免疫结合物而与特定的实施方案无关。例如，可以使一种以上的活性剂与抗体分子直接偶联或可以使用提供多个结合位点的接头。另一方面，可以使用载体。载体可以以包括直接共价结合或通过连接基团在内的各种方式携带活性剂。合适的载体包括诸如清蛋白这样的蛋白质(例如授予Kato等的美国专利US 4,507,234)、肽和诸如氨基葡聚糖这样的多糖(例如授予Shih等的美国专利US 4,699,784)。载体还可以通过非共价结合或通过包封在诸如脂质体囊泡内来携带活性剂(例如US 4,429,008和US 4,873,088)。对放射性核素活性剂具有特异性的载体包括放射性卤化的小分子和螯合化合物。例如美国专利US4,735,792中公开了有代表性的放射性卤化的小分子及其合成方法。放射性核素螯合物可以由包括那些含作为结合金属或金属氧化物、放射性核素的供电子原子的氮原子和硫原子的螯合化合物在内的氮和硫原子的螯合化合物形成。例如，在授予Davison等的美国专利US4,673,562中公开了有代表性的螯合化合物及其合成方法。
可以采用所述抗体和免疫缀合物的各种给药途径。一般来说，给药途径是静脉内给药、肌内给药、皮下给药或在切除了肿瘤的基底中给药。显然所述抗体/免疫缀合物的精确剂量随所用抗体、肿瘤上的抗原密度和抗体清除率的不同而不同。
本文还提供了模拟WT1免疫原性部分的抗独特型抗体。可以采用众所周知的技术使针对特异性结合WT1免疫原性部分的抗体或其抗原结合片段这类抗体增加。模拟WT1免疫原性部分的抗独特型抗体是那些与特异性结合如本文所述的WT1免疫原性部分的抗体或其抗原结合片段结合的抗体。
T细胞免疫治疗组合物还可以或可选地含有对WT1具有特异性的T细胞。一般可以使用标准方法在体外或体内制备这类细胞。例如，T细胞可以存在于(或分离自)诸如患者这样的哺乳动物骨髓、外周血或使用诸如从Cell Pro Inc.，Bothell WA得到的CEPRATETM系统这样的商购细胞分离系统分离的骨髓或外周血液的级分中(另外参见美国专利US 5,240,856；美国专利US 5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)。或者，T细胞可以来源于相关或非相关人类、非人的动物细胞系或培养物。
可以用WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。这种刺激在足以产生对WT1多肽具有特异性的T细胞的条件和时间下进行。优选WT1多肽或多核苷酸存在于诸如微球这样的转运载体中以便促进抗原特异性T细胞的生成。简单地说，将可以通过常规技术(诸如通过外周血液淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)分离自患者或相关或非相关供体的T细胞与WT1多肽一起温育。例如，可以在37℃下将T细胞在体外与WT1多肽(例如5-25μg/ml)或合成相当量的WT1多肽的细胞一起温育2-9天(一般为4天)。需要在没有WT1多肽存在情况下温育单独的T细胞等分样品以此作为对照。
认为T细胞对WT1多肽具有特异性，条件是T细胞杀伤包被了WT1多肽或表达编码这类多肽的基因的靶细胞。可以使用任意各种标准技术评价T细胞的特异性。例如，在铬释放试验或增殖试验中，裂解和/或增殖中的刺激指数比阴性对照增加了2倍以上，这证实了T细胞的特异性。例如，如Chen等在《癌症研究》(Cancer Res.)541065-1070，1994中所述进行这类试验。另一方面，可以通过各种已知技术来检测T细胞的增殖。例如，可以通过测定DNA合成的增加率(例如通过利用含氚胸苷嘧啶脱氧核苷脉冲标记细胞的培养物并测定掺入DNA的含氚胸苷嘧啶脱氧核苷的量)来检测T细胞增殖。检测T细胞增殖的其它方式包括测定白细胞介素-2(IL-2)产量的增加、Ca2+流量或诸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-四氮唑这样的染料的摄取量。或者，可以测定合成的淋巴因子(诸如γ干扰素)或可以定量分析针对WT1多肽产生应答的T细胞的相对数量。与WT1多肽(200ng/ml-100μg/ml、优选100ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应导致T细胞增殖至少增加2倍和/或如上所述接触2-3小时应导致T细胞活化，正如采用标准细胞因子试验所测定的，其中细胞因子(例如TNF或IFN-γ)释放水平增加2倍表明T细胞被活化(参见Coligan等，《最新免疫学方案》(Current Protocols in Immunology)，第1卷，Wiley Interscience(Greene 1998)。可以使用标准技术使WT1特异性T细胞数量增加。在优选实施方案中，T细胞来源于患者或相关或非相关供体且在刺激和数量增加后被施用于患者。
已经在针对WT1多肽、多核苷酸或表达WT1的APC的应答中被活化的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。可以以各种方式检测CD4+orCD8+T细胞的特异性活化。用于检测特异性T细胞活化的方法包括T细胞的增殖、细胞因子(例如淋巴因子)的产生或溶细胞活性的产生(例如对WT1具有特异性的细胞毒性T细胞的产生)。对CD4+T细胞而言，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测增殖的T细胞。对CD8+T细胞而言，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测溶细胞活性的产生。
为了治疗目的，在针对WT1多肽、多核苷酸或APC的应答过程中增殖的CD4+或CD8+T细胞数量在体外或体内膨胀。可以以各种方式使这类T细胞在体外增殖。例如，可以在添加或不添加诸如白细胞介素-2这样的T细胞生长因子和/或合成WT1多肽的刺激细胞的情况下使T细胞与WT1多肽重新接触。优选当产生CD8+T细胞应时添加的刺激细胞。可以将T细胞体外培养至较大数量而保留对用WT1多肽进行间歇再刺激所产生应答的特异性。简单地说，为了进行初次体外刺激(IVS)，可以将大量淋巴细胞(例如大于4×107个)置于装有含人血清的培养基的烧瓶中。可以直接加入WT1多肽(例如10μg/ml的肽)与破伤风类毒素(例如5μg/ml)。然后可以温育该烧瓶(例如37℃下7天)。随后收集T细胞并将其置于装有2-3×107经照射的外周血液单核细胞的新烧瓶中来进行第二次IVS。直接加入WT1多肽(例如10μg/ml)。在37℃下将该烧瓶温育7天。在二次IVS后的第2天和第4天，可以加入2-5个单位的白细胞介素-2(IL-2)。就第三次IVS而言，将T细胞置于孔中并用包被了所述肽的个体自身EBV转化的B细胞进行刺激。可以在每一周期的第2天和第4天加入IL-2。一旦证实细胞为特异性细胞毒性T细胞，则可以通过在第2、4和6天采用较高量IL-2(20个单位)的10天刺激周期使所述细胞增殖。
另一方面，可以通过克隆使在有WT1多肽存在情况下增殖的一种或多种T细胞数量迅速增加。用于克隆细胞的方法在本领域中是众所周知的且包括限制性稀释。可以通过密度梯度离心从致敏患者的外周血液中纯化效应器T细胞并在有经照射的自体填充细胞存在的情况下通过用标称抗原刺激使其形成绵羊红细胞玫瑰花结且定殖在培养物中。为了产生CD4+T细胞系，将WT1多肽用作抗原刺激物并将通过用EB病毒感染无限增殖化的自体外周血液淋巴细胞(PBL)或类淋巴母细胞细胞系(LCL)用作抗原呈递细胞。为了产生CD8+T细胞系，将用产生WT1多肽的表达载体转染的自体抗原呈递细胞用作刺激细胞。在通过以0.5个细胞/孔的频率将经刺激的T细胞平板固定入含有1×106个经照射的PBL或LCL细胞和重组白细胞介素-2(rIL2)(50U/ml)96孔平底平板中进行抗原刺激后的2-4天克隆建立的T细胞系。可以在最初平板固定后约2-3周时鉴定其中有建立的克隆生长的孔并在有自体抗原呈递细胞存在的情况下用适宜的抗原进行再刺激，然后在抗原刺激后2-3天通过添加低剂量的rIL2(10U/ml)使克隆增殖。可以每隔约2周通过用抗原和rIL2定期再刺激将T细胞克隆维持在24-孔平板中。
在某些实施方案中，可以在体内和/或体外对同种异型T-细胞进行致敏(即对WT1敏感)。可以通过使T细胞接触WT1多肽、编码这类多肽的多核苷酸或在足以使T细胞致敏的条件和时间下产生这类多肽的细胞来实现这种致敏。一般来说，例如，如果与WT1多肽接触导致T细胞增殖和/或活化，那么认为T细胞被致敏，正如本文所述的标准增殖、铬释放和/或细胞因子释放试验所测定的。刺激指数与阴性对照相比在增殖或裂解方面增加了2倍以上且在细胞因子水平上增加了3倍以上，这一结果证实了T-细胞的特异性。例如，在骨髓移植中可使用体外致敏的细胞或将体外致敏的细胞用作供体淋巴细胞输注。
对WT1具有特异性的T细胞可以杀伤表达WT1蛋白质的细胞。将编码WT1的T细胞受体(TCR)链的基因导入用作定量和定性提高对含WT1的白血病和癌细胞的应答的方法。增加可以与WT1阳性细胞反应的T细胞数量的疫苗是一种靶向含WT1细胞的方法。使用对WT1具有特异性的T细胞的T细胞疗法是另一种方法。可选的方法是将对WT1具有特异性的TCR链导入T细胞或具有裂解能力的其它细胞。在一个合适的实施方案中，从WT1特异性T细胞系中克隆出TCR的α和β链并用于诸如WO96/30516中所述的过继T细胞疗法，将该文献引入本文作为参考。
药物组合物和疫苗在某些方面中，可以将多肽类、多核苷酸、抗体和/或T细胞组合到药物组合物或疫苗中。另一方面，药物组合物可以包括用WT1多核苷酸转染的抗原呈递细胞(例如树突细胞)，以使抗原呈递细胞表达WT1多肽。药物组合物含有一种或多种这类化合物或细胞以及生理上可接受的载体或赋形剂。某些疫苗可以包括一种或多种这类化合物或细胞以及诸如佐剂或脂质体这样的非特异性免疫反应增强剂(组合了所述化合物)。药物组合物和疫苗可以另外含有传递系统，诸如例如在美国专利US 4,897,268和US 5,075,109中公开的可生物降解的微球。本发明范围内的药物组合物和疫苗还可以含有其它化合物，它们可以是生物活性的或失活的。
在某些实施方案中，设计药物组合物和疫苗以便在诸如人这样的患者体内引发对WT1多肽具有特异性的T细胞应答。一般来说，通过应用相对短的多肽类(例如包括23个以下天然WT1多肽的连续氨基酸残基、优选4-16个连续氨基酸残基、更优选8-16个连续氨基酸残基且更优选8-10个连续氨基酸残基)可以促进T细胞应答。另一方面或另外，疫苗可以含有优选促进T细胞应答的非特异性免疫反应增强剂。换句话说，该免疫反应增强剂可以提高T细胞对WT1多肽的应答水平，其量成比例地高于促进抗体应答的量。例如，当与诸如CFA这样基于油的佐剂相比时，优选促进T细胞应答的免疫反应增强剂可以使增殖T细胞应答至少比WT1-阴性对照细胞系提高2倍、使裂解反应至少提高10％和/或使T细胞活化至少提高2倍，而没有检测到能够促进抗体反应。一般可以使用本领域中所公知的任意有代表性的技术、诸如本文提供的技术来测定T细胞或抗体对WT1多肽的应答得到提高的量。
药物组合物或疫苗可以含有编码如上所述的一种或多种多肽的DNA，使得多肽原位生成。如上所述，该DNA存在于本领域技术人员所公知的任意各种传递系统中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统和哺乳动物表达系统。适宜的核酸表达系统含有在患者体内表达的必需DNA、cDNA或RNA序列(诸如合适的启动子和终止信号)。细菌传递系统包括给予的在细胞表面表达免疫原性部分的细菌(诸如卡介苗)。在一个优选的实施方案中，可以使用病毒表达系统(例如牛痘或其它痘病毒、反录病毒或腺病毒)导入所述的DNA，所述的表达系统可以包括应用的非致病性(缺陷型)可复制病毒。用于将DNA导入这类表达系统的技术对本领域技术人员而言是众所周知的。该DNA还可以如例如Ulmer等在《科学》(Science)2591745-1749，1993中所述且由Cohen在《科学》(Science)2591691-1692，1993中综述的是“裸露的”。可以通过将所述DNA包被在有效转入细胞的可生物降解的珠上来增强裸DNA的摄入。
如上所述，药物组合物或疫苗可以含有表达WT1多肽的抗原呈递细胞。为了达到如本文所述的治疗目的，所述的抗原呈递细胞有效是自体树突细胞。可以使用标准技术制备并转染这类细胞，所述的标准技术诸如下列文献中所述的技术Reeves等《癌症研究》(CancerRes.)565672-5677，1996；Tuting等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)1601139-1147，1998，和Nair等，《天然生物技术》(Nature Biotechnol.)16364-369，1998)。可以通过如本文所述的体外刺激和标准增殖以及铬释放试验来证实抗原呈递细胞表面进行的WT1多肽的表达。
尽管可以在本发明的药物组合物中使用本领域技术人员所公知的任意适宜载体，但是载体的类型随给药方式而改变。可以将本发明的组合物配制成任意适宜给药的形式，例如包括局部给药、口服给药、经鼻给药、静脉内给药、颅内给药、腹膜内给药、皮下给药或肌内给药。就诸如皮下注射这样的非肠道给药而言，所述的载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。就口服给药而言，可以使用任意上述载体或固体载体，诸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可以将可生物降解的微球(例如聚乳酸聚甘醇酸酯)用作本发明药物组合物的载体。就某些局部应用而言，优选使用众所周知的成分制成的霜剂或洗剂这样的制剂。
这类组合物还可以含有缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)；碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)；甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和/或防腐剂。另一方面，可以将本发明的组合物配制成冻干品。还可以使用众所周知的技术将化合物包囊在脂质体中。在本发明的一种实施方案中，组合物含有浓度一般约为1-25％、一般约为7-13％的缓冲液，该缓冲液含有一种或多种糖，包括但不限于海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖。在另一个实施方案中，浓度约为8-约12％。在另一个实施方案中，浓度约为10％。在本发明的其它方面中，所述组合物通常可以以有效提高所述制剂功效、稳定性和/或溶解性的浓度含有乙醇胺、半胱氨酸或聚山梨醇酯-80。
可以在本发明的疫苗中使用诸如佐剂这样的任意各种非特异性免疫反应增强剂。大部分佐剂含有诸如氢氧化铝或矿物油这样用于防止抗原快速发生分解代谢的物质和诸如脂质A、Bortadella pertussis或结核分枝杆菌衍生蛋白质这样的免疫反应刺激物。合适的非特异性免疫反应增强剂包括基于明矾的佐剂(例如Alhydrogel、Rehydragel、磷酸铝、Algammulin、氢氧化铝)；基于油的佐剂(弗氏佐剂(FA)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Montanide ISA 720(Seppic，法国)；细胞因子(例如GM-CSF或Flat3-配体)；微球；基于非离子型嵌段共聚物的佐剂；基于二甲基双二十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂、AS-1、AS-2(Smith Kline Beecham)；基于Ribi佐剂系统的佐剂；QS21(Aquila)；基于皂苷的佐剂(粗皂苷，皂苷Quil A)；基于胞壁酰二肽(MDP)的佐剂，诸如SAF(显微流态形式的Syntex佐剂(SAF-m))；二甲基双二十八烷基溴化铵(DDA)；基于人类补体的佐剂母牛分枝杆菌和衍生物；基于免疫刺激复合物(iscom)的佐剂；失活的毒素；和减毒的感染物(诸如结核分枝杆菌)。
用于本发明药物组合物的其它解释性佐剂包括SAF(Chiron，加利福尼亚，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，商购自SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Enhanzyn_)(Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGPs)，诸如未审的美国专利申请08/853,826和09/074,720中描述的那些佐剂，将这些文献的全部公开内容引入本文作为参考；和诸如WO99/52549A1中所述的那些聚氧乙烯醚佐剂。
其它优选的佐剂包括下列通式的佐剂分子(I)HO(CH2CH2O)n-A-R
其中n为1-50，A是键或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本发明的一种实施方案由疫苗制剂组成，该疫苗制剂包括通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n为1-50、优选4-24、最优选9；R成分为C1-50烷基、优选C4-C20烷基且最优选C12烷基；且A是键。聚氧乙烯醚类的浓度应在0.1-20％的范围、优选0.1-10％且最优选0.1-1％的范围。优选的聚氧乙烯醚类选自下组聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。诸如聚氧乙烯月桂基醚这样的聚氧乙烯醚描述在Merck索引(第12版7717条)中。这些佐剂分子描述在WO 99/52549中。
如果需要，可以将上述通式(I)的聚氧乙烯醚与另一种佐剂结合。例如，优选地是与未审英国专利申请GB 9820956.2中所述的CpG的佐剂组合。
如上所述，在某些实施方案中，针对其优先引发或促进T细胞对WT1多肽的应答(例如CD4+和/或CD8+)的能力选择免疫反应增强剂。这类免疫反应增强剂在本领域中众所周知的且包括(但不限于)Montanide ISA50、Seppic MONTANIDE ISA 720、细胞因子(例如GM-CSF、Flat3-配体)、微球、基于二甲基双二十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1(Smith Kline Beecham)、AS-2(Smith Kline Beecham)、基于Ribi佐剂系统的佐剂、QS21(Aquila)、基于皂苷的佐剂(粗皂苷，皂苷Quil A)、显微流态形式的Syntex佐剂(SAF-m)、MV、ddMV(Genesis)、基于免疫刺激复合物(iscom)的佐剂和灭活毒素。
在本发明的另一个方面中，组合物可以含有用于引发优势Thl-型应答的佐剂。用于引发优势Thl-型应答的某些优选佐剂例如包括单磷酰基脂质A、优选3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A与铝盐的组合物。诸如MPL-SE这样的MpL_佐剂商购自Corixa Corporation(Seattle，WA；例如参见美国专利US 4,436,727；US 4,877,611；US 4,866,034和US 4,912,094，将这些文献的全部内容引入本文)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未被甲基化)还诱导优势Th1应答。这类寡核苷酸是众所周知的且例如描述在WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利US 6,008,200和US 5,856,462中。例如，免疫刺激DNA序列还描述在Sato等在《科学》(Science)273352，1996中。另一种优选的佐剂包括诸如Quil A这样的皂苷或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)；七叶皂苷；毛地黄皂苷；或丝石竹或Chenopodium quinoa皂苷。其它优选的制剂在本发明佐剂组合中包括一种以上的皂苷，例如至少两种下组成分的组合，包括QS21、QS7、Quil A，β-七叶皂苷或毛地黄皂苷。
本文所述的组合物和疫苗可以作为缓释制剂(即诸如给药后使化合物缓慢释放的胶囊或海绵体这样的制剂)的组成部分进行给药。一般可以使用众所周知的技术制备这类制剂且例如通过口服、直肠或皮下植入或通过植入到所需靶部位上来给药。缓释制剂可以含有分散在载体基质中和/或包含在由速率控制膜围成的储蓄器中的多肽、多核苷酸、抗体或细胞。在这类制剂中使用的载体是生物适合性的且还可以是可生物降解的；优选所述制剂提供相对恒定水平的活性成分释放。缓释制剂中包含的活性化合物的量取决于植入部位、释放速率和预计的释放期限以及待治疗或预防的疾病的性质。
恶性疾病疗法在本发明的其它方面中，可以将本文所述的组合物和疫苗用于抑制恶性疾病的发生(例如进行性或转移性疾病或特征在于小肿瘤负荷的疾病、诸如最小残留性疾病)。一般来说，可以将这类方法用于预防、延缓或治疗与WT1表达相关的疾病。换句话说，可以将本文提供的治疗方法用于治疗已经存在的WT1-相关性疾病或可以用于预防或延缓这类疾病在未患病或患有WT1表达非相关性疾病的患者身上的发作。
本文所说的疾病“与WT1表达相关”，条件是病态细胞(例如肿瘤细胞)在病程的同时产生可检测到的高于同一组织正常细胞水平的WT1多肽。与恶性疾病相关的WT1表达不需要WT1存在于肿瘤上。例如，WT1的超表达可能涉及肿瘤的发生，但蛋白质表达随后可能消失。另一方面，特征在于WT1表达增加的恶性疾病可能稍后发展成特征在于WT1表达增加的疾病。因此，认为其中预先表达的病态细胞目前表达或预计随后表达WT1的水平增高的任何恶性疾病“与WT1表达相关”。
可以使用各种技术进行免疫疗法，其中本文提供的化合物或细胞起着从患者体内除去表达WT1的细胞的作用。这种去除作用可以作为在患者体内促进或诱导特异于WT1或表达WT1的细胞的免疫反应的结果而产生。另一方面，可以在体内除去表达WT1的细胞(例如通过治疗自体骨髓、外周血液或骨髓或外周血液级分)。可以使用本领域中任何标准技术得到骨髓或外周血液级分。
在这类方法中，可以对患者施用药物组合物和疫苗。本文所述的“患者”指的是任何温血动物、优选人。患者可以或不一定患有恶性疾病。因此，可以将上述药物组合物和疫苗用于预防疾病发生(即以预防方式)或治疗患有疾病的患者(例如预防或延缓已存疾病的发展和/或转移)。患病的患者患有最小残留疾病(例如完全或部分消退的白血病患者或手术放疗和/或化疗后肿瘤负荷减少的癌症患者体内的低肿瘤负荷)。可以对这类患者进行免疫接种以便抑制复发(即预防或延缓复发或减少复发的严重程度)。在某些优选的实施方案中，患者患有白血病(例如AML、CML、ALL或儿童ALL)、骨髓异常增生综合征(MDS)或癌症(例如胃肠癌、肺癌、甲状腺癌或乳腺癌或黑素瘤)，其中癌症或白血病是WT1阳性的(即以检测到的方式与本文提供的抗-WT1抗体反应或以通过如本文所述的RT-PCR可检测到的水平表达WT1mRNA)或患有针对表达WT1的细胞的自身免疫病。
与WT1超表达相关的其它疾病包括如Satoh F.等在《国际病理学》(Pathol.Int.)50(6)458-71(2000)和Campbell C.E等在(国际癌症杂志)(Int.J.Cacer)78(2)182-8(1998)中所述的肾癌(诸如肾细胞癌或Wilms肿瘤)和如Amin，K.M.等在《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)146(2)344-56(1995)中所述的间皮瘤。Harada等(《分子泌尿学》(Mol.Urol.)3(4)357-364(1999)描述了WT1基因在人睾丸生殖细胞肿瘤中的表达。Nonomura等(Hinyokika Kiyo 45(8)593-7(1999)利用睾丸癌特异性基因的聚合酶链反应描述了分子阶段睾丸癌。Shimizu等在《国际妇科学与病理学杂志》(Int.J.Gynecol.Pathol.)19(2)158-63(2000)中描述了卵巢上皮肿瘤中Wilms肿瘤基因(WT1)的免疫组织化学检测。
Baroud，R.等在《美国外科学病理学杂志》(Am.J Surg.Pathol.)24(6)830-6(2000)和《病理学研究实践》(Pathol.Res.Pract.)194(10)693-700(1998)中还描述了促结缔组织增生小圆细胞肿瘤中WT1的超表达。Menssen，H.D.等在《癌症研究和临床肿瘤学杂志》(J.Cancer Res.Clin.Oncol.)126(4)226-32(2000)中“与新分离的肿瘤样本相比的肺癌、结肠癌和成胶质细胞瘤细胞系中的Wilms肿瘤基因(WT1)表达”的段落中描述了成胶质细胞瘤和其它癌症中WT1的超表达。表现出WT1超表达的其它疾病包括与EBV相关性疾病，诸如伯基特淋巴瘤和鼻咽癌(Spinsanti P.等，《白血病淋巴瘤》(Leuk.Lymphoma)38(5-6)611-9(2000)-“通过正常和恶性人B淋巴细胞的Wilms肿瘤基因表达。”(“Wilmstumor gene expression bynormal and malignant human B lymphocytes.”)。
在《白血病》(Leukemia)14(9)1634-4(2000)中，Pan等描述了来自患有白血病或骨髓异常增生综合征的患者的外周血液单核细胞的体外IL-12疗法且报导了细胞毒性的增加和WT1基因表达的减少。在《白血病》(Leukemia)13(6)891-900(1999)中，Patmasiriwat等报导了骨髓异常增生综合征和急性白血病中WT1和GATA1的表达。在《白血病》(Leukemia)13(3)393-9(1999)中，Tamaki等报导了Wilms肿瘤基因WT1是诊断骨髓异常增生综合征的疾病发展的良好标记。针对胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌细胞系、生殖细胞肿瘤细胞系、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌细胞系、肝细胞癌讨论了Wilms肿瘤基因WT1在实体瘤中的表达及其涉及的肿瘤细胞生长，Oji等，《日本癌症研究杂志》(Jpn.J.Cancer Res.)90(2)194-204(1999)。
可以单独或以与诸如手术、放射、化疗和/或骨髓移植(自体、同源、同种异体或非相关的)这样的常规治疗方案的组合方式使用本文提供的组合物。作为下文更详细讨论的，可以将本文提供的结合剂和T细胞用于净化自体干细胞。例如，这类净化步骤在骨髓移植或输注血液或其成分前可以是有利的。可以将本文提供的结合剂、T细胞、抗原呈递细胞(APC)和组合物进一步用于在体外和/或体内增殖和刺激(或致敏)自体、同种异体或同源或非相关的WT1-特异性T-细胞。例如，可以在供体淋巴细胞输注过程中使用这类WT1-特异性T细胞。
给药途径和次数以及剂量随个体与个体的不同而改变且易于通过标准技术来确定。一般来说，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、经鼻内(例如通过吸入)或经口服施用所述的药物组合物和疫苗。对于某些肿瘤，可以(例如通过直肠结肠镜检术，胃镜检术、电子内镜检查术、血管造影术或本领域中公知的其它方法)对药物组合物或疫苗进行局部给药。优选在52周期限内给予1-10次剂量。优选在1个月的间隔内给予6次剂量且此后可以定期进行加强接种。可选的方案可以适于个体患者。当如上所述给药时，合适的剂量是能够促进至少高于基础(即未治疗的)水平10-50％的抗肿瘤免疫反应的化合物的用量。可以通过测定患者体内的抗肿瘤抗体或通过能够在体外杀伤患者肿瘤细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖性产生来监测这种免疫反应。与未接种疫苗的患者相比，这类疫苗还应能够在接种疫苗的患者体内产生导致临床效果改善(例如更常见的完全或部分消退或长期未患病和/或全部存活)的免疫反应。一般就含有一种或多种多肽的药物组合物和疫苗而言，每一多肽的用量在约100μg-5mg的剂量范围。合适的剂量大小随患者的个头大小而改变，但一般在约0.1mL-约5mL的范围。
一般来说，适宜的剂量和治疗方案提供了足以产生治疗和/或预防效果用量的活性化合物。可以通过在被治疗患者中建立与未被治疗患者相比得到改善的临床效果(例如更常见的完全或部分消退或长期未患病和/或全部存活)来监测这类反应。预先存在的对WT1的免疫反应的增加一般与改善的临床效果相关。一般可以使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子试验来评价这类免疫反应，其中所述的试验可以使用获自治疗前后患者的样品来进行。
在其它方面中，抑制与WT1表达相关的恶性疾病发生的方法包括施用在对如上所述的WT1多肽或表达WT1的APC的应答反应过程中已被活化的自体T细胞的步骤。这类T细胞可以是CD4+和/或CD8+且可以如上所述被增殖。可以以有效抑制恶性疾病发生的用量对个体施用T细胞。一般来说，经静脉内、腔内或在切除肿瘤的基底中给予约1×109-1×1011个T细胞/M2。对本领域技术人员而言显然施用的细胞数量和频率取决于患者的反应。
在某些实施方案中，在进行自体骨髓移植前可以刺激T细胞。这类刺激可以在体内或体外进行。为了进行体外刺激，可以使取自患者的骨髓和/或外周血液(或骨髓或外周血液级分)与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC在如上所述足以刺激T细胞的条件和时间下接触。然后可以使用标准技术对患者施用骨髓、外周血液干细胞和/或WT1-特异性T细胞。
在相关的实施方案中，可以在同源或同种异体(相关或非相关)骨髓移植前刺激相关或非相关供体的T细胞。这类刺激可以在体内或体外进行。为了进行体外刺激，可以使取自相关或非相关供体的骨髓和/或外周血液(或骨髓或外周血液级分)与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC在如上所述足以刺激T细胞的条件和时间下接触。然后可以使用标准技术对患者施用骨髓、外周血液干细胞和/或WT1-特异性T细胞。
在其它实施方案中，可以将本文所述的WT1-特异性T细胞用于除去表达来自自体骨髓、外周血液或骨髓或外周血液级分(例如在对患者施用前富含CD34+的外周血液(PB))的WT1的细胞。可以通过使骨髓或PB与这类T细胞在足以使表达WT1的细胞减少至骨髓或外周血液中骨髓或淋巴细胞总数的10％以下、优选5％以下且更优选1％以下的条件和时间下接触来实施这类方法。易于通过诸如例如定量和定性PCR分析、形态学、免疫化学和FACS分析这样的标准方法来确定这类细胞被除去的程度。然后可以使用标准技术对患者施用骨髓或PB(或其级分)。
诊断方法本发明进一步提供了用于检测与WT1表达相关的恶性疾病的方法和用于监测这类疾病的免疫或治疗有效性的方法。这类方法基于本发明中的发现，即可以在患有这类疾病的患者体中检测到对WT1蛋白质具有特异性的免疫反应；且促进这类免疫反应的方法可以提供预防或治疗的有益作用。
为了测定存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病，可以对患者测试对WT1具有特异性的T细胞水平。在某些方法中，将含有分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC一起温育并如本文所述检测T细胞特异性活化的存在或不存在。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可以通过常规技术(诸如通过外周血液淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)从患者中分离T细胞。可以在37℃下将T细胞在体外与WT1多肽(例如5-25μg/ml)一起温育2-9天(一般为4天)。需要在没有WT1多肽存在的情况下温育另一等份T细胞样品以此用作对照。就CD4+T细胞而言，优选通过评价T细胞的增殖情况来检测激活。就CD8+T细胞而言，优选通过评价溶细胞活性来检测激活。至少高于未患病患者2倍以上的增殖水平和/或至少高于未患病患者20％的溶细胞活性水平这一结果表明存在与WT1表达相关的恶性疾病。可以使用众所周知的方法建立在增殖水平和/或溶细胞活性与对疗法的预测反应之间的相关性。尤其可以预计表现出较高抗体、增殖和/或裂解反应的患者对疗法显示出较明显的反应。
在其它方法中，检测取自患者的生物样品中对WT1具有特异性的抗体水平。将该生物样品与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC一起在足以使免疫复合物形成的条件和时间下一起温育。然后检测该生物样品中WT1多肽与抗体之间形成的免疫复合物。用于这类方法的生物样品可以是取自预计含有抗体的患者的任何样品。合适的生物样品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸膜渗出液和脑脊液。
将该生物样品与反应混合物中的WT1多肽一起在足以使所述多肽与对WT1具有特异性的抗体之间形成免疫复合物的条件和时间下一起温育。例如，可以在4℃下将生物样品与WT1多肽一起温育24-48小时。
温育后，检测该反应混合物中存在的免疫复合物。可以通过诸如放射性免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)这样已知的各种技术来检测生物样品中WT1多肽与抗体之间形成的免疫复合物。合适的测定法在本领域中是众所周知的且充分描述在科学文献和专利文献中(例如Harlow和Lane，《抗体实验指南》(AntibodiesALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。可以使用的测定法包括但不限于David等的双单克隆抗体夹心式免疫测定技术(美国专利US 4,376,110)；单克隆-多克隆抗体夹心式测定法(Wide等，Kirkham和Hunter编辑，《放射性免疫测定法》(Radioimmunoassay Methods)，E.and S.Livingstone，Edinburgh，1970)；Gordon等的″蛋白质印迹″法(美国专利US 4,452,901)；标记配体的免疫沉淀法(Brown等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)2554980-4983，1980)；例如Raines和Ross所述的酶联免疫吸附测定法(《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)2575154-5160，1982)；免疫细胞化学技术，包括应用荧光染料(Brooks等，《临床免疫学实验》(Clin.Exp.Immunol.)39477，1980)；和活性中和法(Bowen-Pope等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)812396-2400，1984)。其它免疫测定法包括但不限于下列文献中所述的那些方法美国专利US 3,817,827；US 3,850,752；US 3,901,654；US3,935,074；US 3,984,533；US 3,996,345；US 4,034,074；和US4,098,876。
为了检测目的，WT1多肽可以是标记的或未标记的。可以将未标记的WT1多肽用于凝集试验或与结合免疫复合物的标记检测试剂联用(例如能够与特异性结合WT1多肽的抗体结合的抗免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素和二次抗体或其抗原结合片段)。如果标记了WT1多肽，那么报道基因可以是本领域中任何适当的报道基因，包括放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
在某些试验中，将未标记的WT1多肽固定在固体支持物上。该固体支持物可以是本领域技术人员公知的任何可结合所述多肽的材料。例如，该固体支持物可以是微量滴定板中的测试孔或硝化纤维或其它合适的膜。或者，该支持物可以是珠或圆片，诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯这样的塑料材料。该支持物还可以是诸如例如在美国专利US5,359,681中公开的那些磁性颗粒或纤维光学传感器。可以使用本领域技术人员所公知的各种技术将所述多肽固定在所述的固体支持物上，所述的技术充分描述在专利和科学文献中。在本发明的上下文中，术语″免疫接种″指的是诸如吸附这样的非共价结合和共价结合(可以是在支持物上抗原与官能基之间的直接键合或通过交联剂的键合)。优选通过吸附到微量滴定平板上的孔中或吸附在膜上的免疫接种。在这类情况中，可以通过使WT1多肽在适宜缓冲液中与固体支持物接触适当时间来完成吸附。接触时间随温度改变，但一般在约1小时-约1天之间。一般来说，使塑料微量滴定平板(诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与约10ng-约10μg且优选约100ng-约1μg范围量的多肽接触这一步骤足以固定足量的多肽。
固定后，一般封闭支持物上的剩余蛋白质结合位点。本领域技术人员所公知的任意合适的封闭剂诸如有牛血清清蛋白、Tween 20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、加热失活的正常山羊血清(NGS)或BLOTTO(还含有防腐剂、盐和消泡剂的脱脂奶粉的缓冲溶液)。然后将支持物与怀疑含有特异性抗体的生物样品一起温育。该样品可以单纯使用或更通常的情况是可以将其稀释，通常将其稀释入含有少量诸如BSA、NGS或BLOTTO这样的蛋白质(0.1％-5.0％重量)的缓冲溶液中。一般来说，适宜接触时间(即温育时间)是足以检测到含有这类抗体的样品中存在特异性结合WT1的抗体的一段时间。优选接触时间足以达到使结合与未结合抗体之间至少达到约95％的平衡结合水平。本领域技术人员认为可以通过测定一段时间内达到的结合水平方便地确定达到平衡所必需的时间。在室温下，约30分钟的温育时间一般是充分的。
然后通过用诸如含有0.1％Tween 20TM的PBS这样的适宜缓冲液洗涤固体支持物来除去未结合的样品。随后加入结合免疫复合物且含有报道基因的检测试剂。将该检测试剂与所述免疫复合物一起温育足以检测到结合抗体的时间。一般可以通过检测一段时间内达到的结合水平来测定合适的时间。然后除去未结合的检测试剂并使用报道基因检测结合的检测试剂。用于检测报道基因的方法取决于报道基因的性质。对放射性基团而言，闪烁计数或放射自显影法一般是合适的。可以将光谱法用于检测染料、发光基团和荧光基团。可以使用与不同报道基因(通常为放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检测生物素。一般可以通过添加底物来检测内报道基因(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶)(一般需要特定的时间期限)，随后对反应产物进行光谱或其它分析。至少高于背景2倍的检测试剂结合水平(即对取自未患病个体的生物样品观察到的水平)表明存在与WT1表达相关的恶性疾病，而与所用的具体方法无关。
一般来说，用于监测免疫接种或疗法有效性的方法包括监测患者体内对WT1具有特异性的抗体或T细胞水平发生变化的步骤。监测抗体水平的方法可以包括下列步骤(a)将取自治疗或免疫接种前患者的第一份生物样品与WT1多肽一起温育，其中在足以使免疫复合物形成的条件和时间下进行这种温育；(b)检测特异性结合所述WT1多肽的生物样品中WT1多肽与抗体之间形成的免疫复合物；(c)使用取自治疗或免疫接种后患者的第二份生物样品重复步骤(a)和(b)；和(d)比较第一份与第二份生物样品中检测到的免疫复合物的数量。另一方面，可以用编码WT1多肽的多核苷酸或表达WT1多肽的APC替代WT1多肽。在这类方法中，在所述生物样品中检测到了由多核苷酸编码或由APC表达的WT1多肽与抗体之间形成的免疫复合物。
监测T细胞活化和/或WT1特异性前体数量的方法可以包括下列步骤(a)将取自治疗或免疫接种前患者的含有CD4+和/或CD8+细胞的第一份生物样品(例如骨髓、外周血液或其级分)与WT1多肽一起温育，其中在足以使T细胞特异性活化、增殖和/或裂解的条件和时间下进行这种温育；(b)检测T细胞活化、增殖和/或裂解的量；(c)使用含有CD4+和/或CD8+细胞和取自治疗或免疫接种后同一患者的第二份生物样品重复步骤(a)和(b)；和(d)比较第一份与第二份生物样品中T细胞活化、增殖和/或裂解的量。另一方面，可以用编码WT1多肽的多核苷酸或表达WT1多肽的APC替代WT1多肽。
用于这类方法的生物样品可以是获自预计含有抗体、CD4+和/或CD8+细胞的患者的任意样品。合适的生物样品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸膜渗出液和脑脊液。在治疗或免疫接种开始前或实施了部分治疗或免疫接种方案时获得第一份生物样品。应按照相似方式、但在实施了另部分治疗或免疫接种后的某时间时获得第二份生物样品。第二份生物样品可以在治疗或免疫接种完成时或实施了部分治疗或免疫接种时获得，条件是在分离第一份生物样品与第二份生物样品之间至少进行了部分治疗或免疫接种。
用于两样品温育和检测的步骤一般如上所述进行。第二份样品与第一份样品相比，免疫复合物数量具有统计学上的显著性增加，这反映了治疗或免疫接种的成功。
下列实施例作为解释目的提供但不应起限定作用。
具体实施例方式
实施例1对血癌患者体内WT1的免疫反应的鉴定本实施例解释了癌患者体内存在的免疫反应的鉴定。
为了评价患者体内预先存在的WT1特异性抗体的存在，采用蛋白质印迹分析来分析患急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)和重度再生障碍性贫血患者的血清。检测血清测试免疫沉淀来自人白血病细胞系K562(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)的能力。在每种情况中，通过凝胶电泳分离免疫沉淀物、将其转移到膜上并用抗WT1抗体WT180(SantaCruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)探测。这种蛋白质印迹分析鉴定了血癌患者体内潜在的WT1特异性抗体。显示患AML的患者结果的有代表性的蛋白质印迹如附图2中所示。由WT1特异性抗体识别使用患者血清产生的免疫沉淀物中的52kD蛋白质。将以相同大小迁移的52kD蛋白质用作阳性对照。
其它研究分析了患AML和CML患者血清中存在的针对全长和截短WT1蛋白质的抗体。将代表人WT1/全长(aa 1-449)、N-末端(aa1-249)(WT1/N-末端)和C-末端(aa 267-449)(WT1/C-末端)区的CDNA构建体亚克隆入被修饰的pET28载体。将WT1/全长和WT1/N-末端蛋白质表达为Ra12融合蛋白。Ra12是命名为MTB32B的分泌的结核分枝杆菌蛋白质的C-末端片段(Skeiky等，《感染与免疫》(InfectImmun.)67；3998，1999)。将Ra12-WT1/全长融合区克隆至组氨酸标记修饰的pET28载体中的组氨酸-标记的3′端。将WT1/N-末端区亚克隆入修饰的pET28载体，该载体带有5′组氨酸-标记，后面是硫氧还蛋白(TRX)-WT1/N-末端融合区，随后是3′组氨酸-标记。将WT1/C-末端编码区亚克隆入被修饰的pET28载体，该载体不带有融合配偶体，该融合配偶体仅含5′和3′组氨酸-标记，后面是凝血酶和EK位点。
用生长过夜且用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的三种WT1表达构建体转化BL21 pLysS大肠杆菌(Stratagene，La Jolla，CA)。如下纯化WT1蛋白质收集细胞并通过在37℃下的pH 8.0的10mM Tris中与完全蛋白酶抑制剂片(Complete Protease InhibitorTablets)(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)中一起温育、随后反复进行超声处理对细胞进行裂解。用pH 8.0的10mMTris将包函体洗涤2次。然后、使用次氮基三乙酸镍树脂通过金属螯合亲和层析(QIAGEN Inc.，Valencia，CA；Hochuli等，《生物活性分子》(Biologically Active Molecules)217，1989)、随后使用Source Q阴离子交换树脂的层析法(Amersham Pharmacia Biotech，Upsala，瑞典)纯化蛋白质。通过N-末端测序证实WT1蛋白质的相同性。
研究了来自再患AML或CML的成年患者的血清中存在的WT1特异性Ab。使重组蛋白吸附在TC微孔板上(Nunc，Roskilde，Denmark)。将平板用PBS/0.5％Tween 20洗涤并用1％BSA/PBS/0.1％Tween 20封闭。洗涤后，加入血清稀释液并在4℃下温育过夜。洗涤平板并加入Donkey抗-人IgG-HRP二次抗体(Jackson-Immunochem，West Grove，PA)且在室温下温育2小时。洗涤平板、与TMB过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard and Perry Laboratories，MA)一起温育、用1N H2SO4使该体系骤冷并立即读数(Cyto-Fluor 2350；Millipore，Bedford，MA)。
为进行血清学鉴定，通过ELISA、在1∶50-1∶20,000连续稀释范围内检测人血清。将阳性反应定义为按1∶500稀释的血清的OD值，它超过来自正常供体(n＝96)血清OD值除以三个(WT1/全长，WT1 C-末端)标准误差的平均值。由于正常供体中的背景高于WT1/N-末端蛋白，所以将与WT1/N-末端的阳性反应定义为按1∶500稀释的血清的OD值，它超过来自正常供体血清OD值除以四个(WT1/全长，WT1 C-末端)标准误差的平均值。为了验证患者的Ab应答是直接针对WT1而不是针对Ra12或蛋白质TRX融合部分或可能的大肠杆菌污染蛋白质，对照组包括按照相似方式纯化的单独的Ra12和TRX蛋白质。从分析中排除显示出对Ra12和/或TRX蛋白质的反应性的样品。
为了评价存在的对WT1的免疫性，测定正常个体和白血病患者血清中针对重组全长和截短WT1蛋白质的Ab。通过对WT1/全长蛋白质、WT1/N-末端蛋白和WT1/C-末端蛋白的ELISA反应性分析抗体反应性。
96个正常供体中仅有2个带有与WT1/全长蛋白反应的血清抗体(附图18)。这些个体之一带有针对WT1/N-末端蛋白的抗体且一个个体带有针对WT 1/C-末端蛋白的抗体。相反，63位AML患者中的16位(25％)带有与WT1/全长蛋白反应的血清抗体。明显相反的情况是，63位患者中仅有2位(3％)具有对WT1/C-末端蛋白的反应性。患CML的81位患者中的15位(19％)带有与WT1/全长蛋白反应的血清抗体且81位患者中的12位(15％)带有与WT1/N-蛋白反应的血清抗体。81位患者中仅有3位(3％)具有与WT1/C端-蛋白反应的反应性。(附图16和17)。
这些数据证实在患AML和CML的某些患者体内检测到了针对WT1的Ab反应。白血病患者体内抗体的发生率较高强有力地证明由于患有恶性肿瘤的患者表达或有时表达WT1所以发生了针对WT1蛋白质的免疫。由于不受特定理论局限，所以认为观察到的对WT1的抗体反应主要可能是由患者对其自身白血病细胞上的WT1发生免疫而导致的且直接证明了WT1尽管是″自体′蛋白、但它是免疫原性的。
针对WT1的抗体的存在强烈暗示在相同患者体内也同时存在辅助T细胞应答。WT1是内部蛋白。因此，就白血病疗法和免疫的大部分毒性臂而言，CTL应答可能是最有效。因此，这些数据证明了针对WT1的治疗疫苗能够引起针对WT1的免疫应答。
所检测的大部分抗体与N-末端中的表位反应，而仅有小亚组患者表现出对C-末端的弱抗体反应。这一结果与在动物模型中的观察结果一致，其中使用来源于N-末端的肽进行的免疫接种引起抗体、辅助T细胞和CTL应答，而来源于C-末端的肽中没有一种被测试出能引起抗体或T细胞应答(Gaiger等，《血液》(Blood)961334，2000)。
实施例2对免疫接种表达WT1的细胞系的小鼠体内针对WT1的抗体的诱导本实施例解释了表达WT1的细胞在诱导体内WT1特异性抗体反应中的应用。
白血病患者体内针对WT1存在的抗体的检出强烈暗示免疫接种WT1蛋白质可能会引起对WT1的免疫。为了测试对WT1的免疫性是否可以通过免疫接种产生，给小鼠注射来源于B6的WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C。简单地说，给雄性B6小鼠皮下免疫接种5×106个TRAMP-C细胞并以3周间隔加强注射两次5×106个细胞。最终的免疫接种后3周取血清并在含有25μM β-2-巯基乙醇、200单位青霉素/ml、10mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO)中制备脾的单细胞混液。
免疫接种TRAMP-C后，可在免疫接种动物体内检测到WT1特异性抗体反应。有代表性的蛋白质印迹如附图3中所示。这些结果表明免疫接种WT1蛋白质可以引发对WT1蛋白质的免疫反应。
实施例3免疫接种WT1肽的小鼠体内TH和抗体反应的诱导本实施例解释了免疫接种WT1肽引起对WT1特异性的免疫反应的能力。
按照Tsites程序(Rothbard和Taylor，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)793-100，1988；Deavin等，《分子免疫学》(Mol.Immunol.)33145-155，1996)鉴定适合于引发Ab和增殖性T细胞反应的肽类，该程序检索具有引发Th应答能力的肽基元。合成并测序表I中所示的肽类。
表IWT1肽

为进行免疫接种，将肽类分组如下A组p6-22人1ml中10.9mg(10μl＝100μg)p117-139人/小鼠1ml中7.6mg(14μl＝100μg)p244-262人1ml中4.6mg(22μl＝100μg)B组p287-301人/小鼠1ml中7.2mg(14μl＝100μg)小鼠p299-3131ml中6.6.mg(15μl＝100μg)p421-435人/小鼠1ml中3.3mg(30μl＝100μg)对照组(FBL肽100μg)+CFA/IFA对照组(CD45肽100μg)+CFA/IFAA组含有存在于WT1(外显子1)氨基末端部分中的肽且B组含有存在于羧基末端中的肽，在所述的羧基末端上含有4个锌指区，它带有与其它结合了DNA的蛋白质同源的序列。在B组中，p287-301和p299-313来源于外显子7、锌指1且p421-435来源于外显子10、锌指IV。
给B6小鼠免疫接种一组WT1肽类或对照肽。将肽类溶于1ml无菌注射用水并以3周间隔给B6小鼠免疫接种3次。所用的佐剂是CFA/IFA、GM-CSF和Montinide。然后如实施例1和2中所述测定存在的对WT1具有特异性的抗体并使用标准胸苷掺入试验评价增殖的T细胞应答，其中在有抗原存在的情况下培养细胞并通过测定掺入的放射性来评价增殖情况(Chen等，《癌症研究》(Cancer Res.)541065-1070，1994)。特别在96孔平板上以2×105个细胞/孔与4×105经照射的(3000拉德)同源脾细胞和指定肽一起培养淋巴细胞。
给小鼠免疫接种命名为A组的肽从而引起对WT1的抗体反应(附图4)。在免疫接种疫苗B后没有检测到抗体，这一结果与缺乏来自免疫接种疫苗B的辅助T细胞反应一致。P117-139引起增殖性T细胞反应(附图5A-5C)。刺激指数(SI)在8-72之间变化。证实其它肽(P6-22和P299-313)也引起增殖性T细胞反应。免疫接种P6-22使刺激指数(SI)为2.3且免疫接种P299-313使SI为3.3。阳性对照包括ConA刺激的T细胞以及用诸如CD45和FBL这样的已知抗原刺激的T细胞和同种异体T细胞系(DeBruijn等，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)212963-2970，1991)。
附图6A和6B表示对疫苗A(附图6A)和疫苗B(附图6B)中三种肽中的每一种观察到的增殖反应。疫苗A引起对免疫接种肽p6-22和p117-139的增殖性T细胞应答，其中刺激指数(SI)在3-8之间变化(松散的线)。没有检测到针对p244-262的增殖反应(附图6A)。
随后仅使用p6-22和p117-139进行体外刺激作为单肽刺激。用p117-139刺激疫苗A特异性T细胞系导致针对p117-139增殖而对p6-22没有反应(附图7A)。来源于该系的克隆对p117-139具有特异性(附图7B)。相反，用p6-22刺激疫苗A特异性T细胞系导致对p6-22增殖而对p117-139没有反应(附图7C)。来源于该系的克隆对p6-22具有特异性(附图7D)。
这些结果表明免疫接种WT1肽类可以引起对WT1蛋白质的抗体反应和针对免疫接种肽的增殖性T细胞应答。
实施例4免疫接种WT1肽的小鼠体内CTL应答的诱导本实施例解释了WT1肽引发CTL免疫的能力。
使用BIMAS HLA肽结合预测分析鉴定带有适合于结合I类MHC的基元的肽(9-聚体)(Parker等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)152163，1994)。在这类分析中鉴定的肽如表II-XLIV中所示。在各表中，评分反映了所述肽对指定MHC分子的理论结合亲和性(一半解离时间)。
使用检索具有引起Th应答能力的肽基元的Tsites程序(Rothbard和Taylor，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)793-100，1988；Deavin等，《分子免疫学》(Mol.Immunol.)33145-155，1996)鉴定的肽进一步如附图8A和8B以及表XLV中所示。
表II对人WT1肽与人HLA A1结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表III对人WT1肽与人HLA A 0201结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表IV对人WT1肽与人HLA A0205结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表V对人WT1肽与人HLA A24结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表VI对人WT1肽与人HLA A3结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表VII对人WT1肽与人HLA A68.1结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表VIII对人WT1肽与人HLA A1101结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表IX对人WT1肽与人HLA A3101结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表X对人WT1肽与人HLA A3302结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XI对人WT1肽与人HLA B14结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XII对人WT1肽与人HLA B40结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XIII对人WT1肽与人HLA B60结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XIV对WT1肽与人HLA B61结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XV对人WT1肽与人HLA B62结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XVI对人WT1肽与人HLA B7结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XVII对人WT1肽与人HLA B8结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XVIII对人WT1肽与人HLA B2702结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XIX对人WT1肽与人HLA B2705结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XX对人WT1肽与人HLA B3501结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXI对人WT1肽与人HLA B3701结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXII对人WT1肽与人HLA B3801结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXIII对人WT1肽与人HLA B3901结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXIV对人WT1肽与人HLA B3902结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXV对人WT1肽与人HLA B4403结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXVI对人WT1肽与人HLA B5101结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXVII对人WT1肽与人HLA B5102结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXVIII对人WT1肽与人HLA B5201结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXIX对人WT1肽与人HLA B5801结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXX对人WT1肽与人HLA CW0301结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXXI对人WT1肽与人HLA CW0401结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXXII对人WT1肽与人HLA CW0602结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXXIII对人WT1肽与人HLA CW0702结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXXIV对人WT1肽与小鼠I类MHC Db结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXXV对人WT1肽与小鼠I类MHC Dd结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXXVI对人WT1肽与小鼠I类MHC Kb结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XXXVII对人WT1肽与小鼠I类MHC Kd结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXXVIII对人WT1肽与小鼠I类MHC Kk结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XXXIX对人WT1肽与小鼠I类MHC Ld结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XL对人WT1肽与牛HLA A20结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XLI对人WT1肽与小鼠I类MHC A 0201结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XLII对人WT1肽与小鼠I类MHC Db结合进行的RIMAS HLA肽结合预测分析结果


表XLIII对人WT1肽与小鼠I类MHC Kb结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XLIV对人WT1肽与小鼠I类MHC Kd结合进行的BIMAS HLA肽结合预测分析结果

表XLV对能够引起辅助T细胞应答的人WT1肽进行的TSites肽结合预测分析结果


选择某些CTL肽(表XLVI中所示)用于进一步研究。对表XLVI中的各肽而言，提供了使用BIMAS HLA肽结合预测分析获得的得分。
表XLVIWT1肽序列与HLA肽的结合预测

使用如Ljunggren等在《自然》(Nature)346476-480，1990中所述的白血病细胞系RMA-S证实与C57B1/6鼠MHC结合的肽。简单地说，在26℃下和补充了1％FCS的完全培养基中将RMA-S细胞培养7小时。将总计106个RMA-S细胞加入到24孔平板的各孔中并单独或与指定的肽(25μg/ml)一起在26℃下的完全培养基中温育16小时且在37℃下再温育3小时。然后将细胞洗涤3次并用异硫氰酸荧光素缀合的抗Db或抗-Kb抗体(PharMingen，San Diego，CA)染色。将标记的细胞洗涤两次、重新悬浮并固定在含有1％低聚甲醛的500μl PBS中并在流式细胞仪(Becton-Dickinson FACSCalibur_)中分析荧光强度。通过肽一起温育的细胞的增加的平均荧光强度与在单独培养基中温育的细胞的增加平均荧光强度之比确定RMA-S细胞表面上Db或Kb分子增加的百分比。
给小鼠免疫接种能够结合鼠I类MHC的肽。在免疫接种后，在体外刺激脾细胞并测试裂解与WT1肽一起温育的靶物的能力。使用标准铬释放试验评价CTL(Chen等，《癌症研究》(Cancer Res.)541065-1070，1994)。在37℃和有或没有特异性肽存在的情况下将106个靶细胞与150μCi的钠51Cr一起温育90分钟。将细胞洗涤3次并重新悬浮于含有5％胎牛血清的RPMI中。为了进行该试验，将104个51Cr-标记的靶细胞与不同浓度、终体积为200μl的效应细胞一起在U形底的96孔板中温育。4-7小时后在37℃下弃去上清液并通过下列公式确定特异性裂解百分比特异性裂解％＝100×(实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)。
表XLVII中所列的结果表明某些WT1肽可以结合I类MHC分子，这是产生CTL必不可少的。此外，所述肽类中的几种能够引起肽特异性CTL(附图9A和9B)，正如利用铬释放试验所测定的。在免疫接种CTL肽p10-18人、p136-144人、p136-144小鼠和p235-243后，产生肽特异性CTL系并建立了克隆。这些结果表明肽特异性CTL可以杀伤表达WT1的恶性细胞。
表XLVIIWTCTL肽与小鼠B6I类抗原的结合

实施例5WT1多肽在小鼠体内引起WT1特异性CTL中的应用本实施例解释了有代表性的WT1多肽引起能够杀伤WT1阳性肿瘤细胞系的能力。
使用TSITES和BIMAS HLA肽结合预测分析如上所述鉴定带有适合于结合I类和II类MHC的基元的肽P117-139。如实施例3中所述对小鼠进行免疫接种。在免疫接种后，在体外刺激脾细胞并测试裂解与WT1肽类引起温育的靶物以及WT1阳性和阴性肿瘤细胞的能力。使用标准铬释放试验评价CTL。附图10A-10D中所列的结果表明P117可以引起能够杀伤WT1阳性肿瘤细胞的WT1特异性CTL，而没有观察到对WT1阴性细胞的杀伤。这些结果证实肽特异性CTL实际上杀伤表达WT1的恶性细胞且该疫苗和T细胞疗法对表达WT1的恶性肿瘤有效。
使用9-聚体I类MHC结合肽类p136-144、p225-233、p235-243以及23-聚体肽p117-139进行类似的免疫接种。在免疫接种后，在体外用4种肽中的每一种刺激脾细胞并测试裂解与WT1肽类一起温育的靶物的能力。产生对p136-144、p235-243和p117-139具有特异性、但对p225-233没有特异性的CTL。针对p235-243和p117-139的CTL数据列在附图11A和11B中。未列出针对肽p136-144和p225-233的数据。
CTL裂解需要以内源性方式处理靶WT1肽类并使其以与肿瘤细胞I类MHC分子结合的形式存在。测试上述WT1肽特异性CTL裂解WT1阳性与阴性肿瘤细胞系的能力。对p235-243具有特异性的CTL裂解与p235-243肽类一起温育的靶物，但它不能裂解表达WT1蛋白质的细胞系(附图11A)。明显相反的情况是，对p117-139具有特异性的CTL裂解与p117-139肽类一起温育的靶物且也裂解表达WT1的恶性细胞(附图11B)。作为阴性对照，对p117-139具有特异性的CTL不会裂解WT1阴性EL-4(本文也称作E10)。
通过冷靶抑制(附图12A-12B)证实WT1特异裂解特异性。以不同的效应细胞靶细胞之比将效应细胞平板固定在96孔U形底平板中。加入10倍过量的(与热靶相比)所示肽包被的未进行51Cr标记的靶物。最终加入104个51Cr-标记的靶细胞/孔并在37℃下将该平板温育4小时。总体积/孔为200μl。
用与相关肽p117-139一起温育的EL-4而不是采用与非相关肽一起温育的EL-4将p117-139特异性CTL对TRAMP-C的裂解阻断58％-36％(附图12A)。类似地，通过与相关肽p117-139一起温育的EL-4将BLK-SV40的裂解阻断18％-0％(附图12B)。结果验证了WT1肽特异性CTL通过识别被加工的WT1特异性杀伤恶性细胞。
在p117-139中包含带有推定CTL基元的几种片段。为了测定CTL表位的准确序列，合成p117-139中的所有可能的9-聚体肽类(表XLVIII)。经证实这些肽中的两种(p126-134和p130-138)与H-2bI类分子结合(表XLVIII)。通过免疫接种p117-139产生的CTL裂解与p126-134和p130-138一起温育的靶物，但不裂解p117-139中的其它9-聚体肽类(附图13A)。
用p126-134或p130-138再次刺激p117-139特异性CTL系。用p126-134或p130-138再次刺激后，两种T细胞系显示出肽特异性裂解，但仅p130-138特异性CTL显示裂解WT1阳性肿瘤细胞系(附图13B和13C)。因此，p130-138似乎是天然加工的表位。
表XLVIIIp117-139内的WT1 CTL 9聚体肽与小鼠B6 I类抗原的结合

实施例6小鼠肿瘤细胞系中WT1特异性mRNA的鉴定本实施例解释了RT-PCR在检测细胞和细胞系中WT1特异性mRNA中的应用。
通过密度梯度离心分离单核细胞并立即将其一直冷冻且保存在-80℃下至通过RT-PCR分析存在的WT1特异性mRNA为止。一般如Fraizer等在《血液》(Blood)864704-4706，1995中所述进行RT-PCR。按照标准步骤从107个细胞中提取总RNA。将RNA沉淀重新悬浮于25μL二乙基焦碳酸酯处理的水中并直接用于逆转录。通过PCR扩增锌指区(外显子7-10)作为330bp小鼠cDNA。通过在热循环仪中进行的一个或如果必要两个连续循环的PCR进行扩增。使用总反应体积为50μl中的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、2.5mM MgCl2和20pmol各种引物。将20μL PCR产物的等分样品在用溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上进行电泳。用Polaroid胶片(Polaroid 667，Polaroid Ltd.，Hertfordshire，英国)给凝胶拍照。按照Kwok和Higuchi在《自然》(Nature)339237-238，1989中的建议预防交叉污染。每次实验中的阴性对照包括与代替cDNA的水的cDNA-和PCR-试剂混合物。为了避免假阴性，通过使用β-肌动蛋白引物的对照PCR评价每个样品中存在的完整RNA和足量cDNA的产生。从分析中排除未采用这些引物扩增的样品。
用于扩增小鼠细胞系中WT1的引物是P1151458-14785′CCCAGG CTG CAA TAA GAG ATA 3′(正向引物；SEQ ID NO21)；和P1161767-17875′ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3′(反向引物；SEQ ID NO22)(参见Inoue等，《血液》(Blood)882267-2278，1996；Fraizer等，《血液》(Blood)864704-4706，1995)。
用于对照反应的β肌动蛋白引物是5′GTG GGG CGC CCC AGGCAC CA 3′(有义引物；SEQ ID NO23)；和5′GTC CTT AAT GTCACG CAC GAT TTC 3′(反义引物；SEQ ID NO24)。
用于扩增人WT1的引物包括P117954-9745′GGC ATC TGAGAC CAG TGA GAA 3′(SEQ ID NO25)；和P1181434-14145′GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3′(SEQ ID NO5)。就嵌套式RT-PCR而言，引物可以是P1191023-10435′GCT GTC CCACTT ACA GAT GCA 3′(SEQ ID NO26)；和P1201345-13655′TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3′(SEQ ID NO27)。
表XLVIII表示小鼠肿瘤细胞系的WT1 PCR分析结果。在表IV中，(+++)表示在第一步RT PCR中的强WT1 PCR扩增产物；(++)表示通过第一步WT1 RT PCR可检测到的WT1扩增产物；(+)表示仅在WT1 RT PCR的第二步中可检测到的产物；而(-)表示WT1 PCR阴性。
表XLIX小鼠肿瘤细胞系中WT1 mRNA的检测

实施例7WT1 TRX融合构建体在大肠杆菌中的表达使用下列引物对WT1(WT1B)的截短的可读框进行PCR扩增起始于第2位氨基酸的正向引物P-37(SEQ ID NO.342)5′ggctccgacgtgcgggacctg 3′Tm 64℃终止密码子后产生EcoRI位点的反向引物P-23(SEQ ID NO.343)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm63℃在下列条件下进行PCR
10μl 10xPfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10m各种寡聚苷酶83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒72℃3分钟×40个循环72℃4分钟用EcoRI限制酶消化PCR产物、进行凝胶纯化且然后克隆入pTrx2H载体(含有N-末端上的Trx融合体和Trx融合体周围的两种His标记物的修饰pET28载体。在Trx融合体后存在凝血酶和肠激酶的蛋白酶切割位点)。用StuI和EcoRI限制酶消化pTrx2H构建体。通过DNA序列分析证实正确的构建体且然后将其转入BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CodonPlus表达宿主细胞。
实施例8WT1 A HIS标记物融合构建体在大肠杆菌中的表达使用下列引物对WT1(WT1A)的N-末端可读框进行PCR扩增起始于第2位氨基酸的正向引物P-37(SEQ ID NO.344)5′ggctccgacgtgcgggacctg 3′Tm 64℃置于第249位氨基酸后的人工终止密码子后产生EcoRI位点的反向引物P-335(SEQ ID NO.345)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm64℃在下列条件下进行PCR10μl 10xPfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10m各种寡核苷酸
83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒72℃1分20秒×40个循环72℃4分钟用EcoRI限制酶消化PCR产物、进行凝胶纯化且然后克隆入pPDM，它是含有读框中His标记物的已经用Eco721和EcoRI限制酶消化的修饰pET28载体。也将PCR产物转入pTrx 2H载体。用StuI和EcoRI限制酶消化pTrx2H构建体。通过DNA序列分析证实正确的构建体且然后将其转入BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CodonPlus表达宿主细胞。
实施例9WT1 B HIS标记物融合构建体在大肠杆菌中的表达使用下列引物对WT1(WT1A)的截短的可读框进行PCR扩增起始于第250位氨基酸的正向引物PDM-346(SEQ ID NO.346)5′cacagcacagggtacgagagc 3′Tm 58℃终止密码子后产生EcoRI位点的反向引物P-23(SEQ ID NO.347)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm63℃在下列条件下进行PCR10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10m各种寡核苷酸83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟
96℃20秒63℃15秒72℃1分30秒×40个循环72℃4分钟用EcoRI限制酶消化PCR产物、进行凝胶纯化且然后克隆入pPDM，它是含有读框中His标记物的已经用Eco72I和EcoRI限制酶消化的修饰pET28载体。也将PCR产物转入pTrx 2H载体。用StuI和EcoRI限制酶消化pTrx2H构建体。通过DNA序列分析证实正确的构建体且然后将其转入BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CodonPlus表达宿主细胞。
就实施例7-9而言，公开了下列SEQ ID NO.SEQ ID NO.327是测定的Trx_WT1_B的cDNA序列SEQ ID NO.328是测定的Trx_WT1_A的cDNA序列SEQ ID NO.329是测定的Trx_WT1的cDNA序列SEQ ID NO.330是测定的WT1_A的cDNA序列SEQ ID NO.331是测定的WT1_B的cDNA序列SEQ ID NO.332是预测的由SEQ ID No.327编码的氨基酸序列SEQ ID NO.333是预测的由SEQ ID No.328编码的氨基酸序列SEQ ID NO.334是预测的由SEQ ID No.329编码的氨基酸序列SEQ ID NO.335是预测的由SEQ ID No.330编码的氨基酸序列SEQ ID NO.336是预测的由SEQ ID No.331编码的氨基酸序列实施例10在大肠杆菌中表达的截短形式的WT1通过使用下列引物的PCR扩增WT1的三种读框就WT1 Tr2而言PDM-441(SEQ ID NO.348)5′cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac3′Tm 63℃PDM-442(SEQ ID NO.349)5′ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc3′Tm 62℃就WT1 Tr3
PDM-443(SEQ ID NO.350)5′caggctttgctgctgaggacgccc 3′Tm 64℃PDM-444(SEQ ID NO.351)5′cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc3′Tm 64℃就WT1 Tr4而言PDM-445(SEQ ID NO.352)5′cacagcaggaagcacactggtgagaaac3′Tm 63℃PDM-446(SEQ ID NO.353)5′ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc3′Tm 63℃在下列条件下进行PCR10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10m各种寡核苷酸83μL无菌水1.5μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒72℃30秒×40个循环72℃4分钟用EcoRI限制酶消化PCR产物并克隆入已经用Eco72I和EcoRI消化的pPDM His(在5’端上含有读框中His标记物的修饰pET28载体)。通过序列分析证实正确的构建体并将其转入BL21 pLys S和BL21CodonPlus细胞或BLR pLys S和BLR CodonPlus细胞。
实施例11WT1 C(氨基酸76-437)和WT1 D(第91-437位氨基酸)在大肠杆菌中的表达通过使用下列引物的PCR扩增WT1 C读框PDM-504(SEQ ID NO.354)5′cactccttcatcaaacaggaac 3′Tm 61℃
PDM-446(SEQ ID NO.355)5′ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3′Tm 63℃在下列条件下进行PCR10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10m各种寡核苷酸83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒72℃2分钟×40个循环72℃4分钟用EcoRI限制酶消化PCR产物并克隆入已经用Eco72I和EcoRI消化的pPDM His。通过序列分析证实序列并将其转入与CodonPlusRP共转染的BLR pLys S和BLR。
实施例12通过使重叠寡核苷酸退火合成产生WT1 TR-1实施该实施例以测定改变脯氨酸密码子的用法对表达的作用。
使下列几对寡核苷酸退火1.PDM-505(SEQ ID NO.356)5′ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3′PDM-506(SEQ ID NO.357)5′ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3′2.PDM-507(SEQ ID NO.358)5′ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3′PDM-508(SEQ ID NO.359)5′cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3′3.PDM-509(SEQ ID NO.360)5′cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3′PDM-510(SEQ ID NO.361)5′cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3′4.PDM-511(SEQ ID NO.362)5′cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3′PDM-512(SEQ ID NO.363)5′cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3′5.PDM-513(SEQ ID NO.364)5′ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3′PDM-514(SEQ ID NO.365)5′ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3′6.PDM-515(SEQ ID NO.366)5′cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaaacag 3′PDM-516(SEQ ID NO.367)5′ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3′7.PDM-517(SEQ ID NO.368)5′gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3′PDM-518(SEQ ID NO.369)5′ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag 3′8.PDM-519(SEQ ID NO.370)5′gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3′PDM-520(SEQ ID NO.371)5′gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatg cg 3′分别合并寡核苷酸对，然后使其退火。随后使这些寡核苷酸对彼此连接并将1μl连接混合物用于下列PCR条件10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10m各种寡核苷酸83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒72℃30秒×40个循环72℃4分钟用EcoRI限制酶消化PCR产物并克隆入已经用Eco72I和EcoRI消化的pPDM His。证实序列且然后将其转入与CodonPlus RP共转染的BLR pLys S和BLR。
就实施例10-12而言，公开了下列SEQ ID NO.SEQ ID NO.337是测定的WT1_Tr1的cDNA序列SEQ ID NO.338是测定的WT1_Tr2的cDNA序列SEQ ID NO.339是测定的WT1_Tr3的cDNA序列SEQ ID NO.340是测定的WT1_Tr4的cDNA序列SEQ ID NO.341是测定的WT1_C的cDNA序列SEQ ID NO.342是预测的由SEQ ID No.337编码的氨基酸序列SEQ ID NO.343是预测的由SEQ ID No.338编码的氨基酸序列SEQ ID NO.344是预测的由SEQ ID No.339编码的氨基酸序列SEQ ID NO.345是预测的由SEQ ID No.340编码的氨基酸序列SEQ ID NO.346是预测的由SEQ ID No.341编码的氨基酸序列WT1 C序列代表具有TR2、TR3和TR4编码区的多核苷酸。
WT1 TR-1合成序列代表以可选脯氨酸密码子取代天然密码子的多核苷酸，从而产生能够在大肠杆菌中表达WT1 TR-1的多核苷酸。
实施例13评价对小鼠进行WT1免疫接种的系统性组织病理学和毒理学作用本实施例目的在于分析在小鼠体内以多剂量滴定方式进行WT1蛋白免疫接种的免疫原性和潜在的组织病理学和毒理学作用。
将对给小鼠免疫接种WT1蛋白进行的实验设计概括在表L中。
表L在小鼠体内进行WT1免疫接种的实验设计

在雌性C57/B6小鼠体内进行的多剂量滴定研究(剂量范围25μg、100μg-1000μgWT1蛋白)中使用MPL-SE作为佐剂的WT1蛋白免疫接种引起了强WT1-特异性抗体应答(附图19)和细胞T-细胞应答(附图20)。
没有观察到免疫接种WT1蛋白的系统性组织病理学或毒理学作用。在下列组织中没有观察到毒性的组织学证据肾上腺、脑、盲肠、结肠、十二指肠、眼、股骨和髓、胆囊、心脏、回肠、空肠、肾、喉、泪腺、肝、肺、淋巴结、肌肉、食管、卵巢、胰腺、甲状旁腺、唾液腺、胸骨和髓、脾、胃、胸腺、气管、甲状腺、膀胱和子宫。
特别强调的是对潜在的造血毒性的评价。胸骨和股骨髓中的骨髓/细胞胞类比是正常的。所有可评价的血细胞计数和血液化学(BUN、肌酸酐、胆红素、清蛋白、球蛋白)均在正常范围内(表LI)。
已知某些白血病患者体内现存的针对WT1的免疫性和免疫接种WT1蛋白可以在小鼠体内引起WT1特异性Ab和细胞T-细胞应答而对正常组织没有毒性，这些实验验证了WT1可作为肿瘤/白血病疫苗。
表L1WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表L1WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表L1WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表L1(接续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析


表L1(接续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表L1(接续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表L1(接续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

缩写WBC白细胞；RBC红细胞；Hg.血红蛋白；HCT血细胞比容；MCV平均微粒体积；MCH平均微粒血红蛋白；MCHC平均微粒血红蛋白浓度；Plt.血小板；Abs.绝对值；Baso嗜碱性细胞；Eos嗜酸性细胞；Abs.Bands未成熟嗜中性白细胞；Polys多形核细胞；Lymph淋巴细胞；Mono单核细胞；BUN血尿氮实施例14通过体外接触抗原由完整基因引起人WT1-特异性T-细胞应答本实施例证实可以由正常个体产生WT1特异性T-细胞应答。
树突细胞(DC)由来源于经在含有10％人血清、50ng/ml GMCSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天的正常供体的PBMC的单核细胞培养物分化而得到。在培养后，用表达重组WT1的牛痘病毒在M.O.I.为5的情况下使DC感染16小时或用表达重组WT1的腺病毒在M.O.I.为10的情况下使DC感染3天(附图21和22)。通过UV照射使牛痘病毒失活。通过使用磁性珠的正选择分离CD8+T-细胞并在96孔平板中开始对培养物进行致敏。每隔7-10天使用由腺病毒或牛痘感染以表达WT1的自体树突细胞对培养物进行再刺激。进行3-6个刺激循环后，可以鉴定出用表达WT1自体的树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ的CD8+系。可以在进一步的刺激循环后维持这些系的WT1-特异性活性。通过Elispot试验证实这些系可特异性识别腺或牛痘WT1感染的自体树突细胞，但不能识别腺或牛痘EGFP感染的自体树突细胞(附图23)。
实施例15注射用RA12-WT1制剂赋形剂在稳定冻干产品中的应用本实施例描述了使冻干的Ra12-WT1完全溶解的制剂。
下列制剂使重组蛋白Ra12WT1在冻干后溶于含水介质重组Ra12-WT1浓度0.5-1.0mg/ml；缓冲液10-20mM乙醇胺，pH 10.0；1.0-5.0mM半胱氨酸；0.05％Tween-80(聚山梨醇酯-80)；糖10％海藻糖(T5251，Sigma，MO)10％麦芽糖(M9171，Sigma，MO)10％蔗糖(S7903，Sigma，MO)10％果糖(F2543，Sigma，MO)10％葡萄糖(G7528，Sigma，MO)。
发现含有糖赋形剂的冻干蛋白的溶解性显著高于不含糖赋形剂的冻干蛋白。经考马斯染色的SDS-PAGE进行的分析表明在溶解的物质中没有剩余固体存在的迹象。
实施例16WT1蛋白疫苗制品本实施例描述了免疫接种WT1蛋白和两种不同佐剂制品后诱导的WT1特异性免疫反应。
按照本实施例，WT1蛋白与MPL-SE共同诱导了针对WT1的强Ab和干扰素-γ(IFN-γ)的应答。下面详述了用于以MPL-SE或Enhanzyn作为佐剂对C57/B6小鼠进行WT1蛋白免疫接种来诱导WT1特异性免疫反应的方法。
给C57BL/6小鼠免疫接种20μg rRa12-WT1与MPL-SE或Enhanzyn佐剂。给一组对照小鼠免疫接种不含佐剂的rRa12-WT1并给一组小鼠免疫接种单独的盐水。间隔3周给予3次肌内(IM)免疫接种。最终免疫接种后2周收集脾和血清。通过在包被了Ra12-WT1融合体、Ra12或WT1 TRX的平板上进行的ELISA对血清进行抗体反应的分析。在免疫接种了Ra12-WT1+MPL-SE和Ra12-WT1+Enhanzyn的小鼠体内观察到了相似水平的IgG2a和IgG1抗体滴度。免疫接种了不含佐剂的rRa12-WT1的小鼠显示出较低水平的IgG2a抗体。
在体外用rRa12-WT1、rRa12或WT1肽p6、p117和p287刺激脾细胞后通过测定干扰素-γ的产生量来评价CD4反应。两种佐剂对CD4反应的改善超过了单独免疫接种rRA12-WT1的小鼠。另外，结果表明rRA12-WT1+MPL-SE诱导的CD4反应强于rRA12-WT2+Enhanzyn诱导的CD4反应。与免疫接种rRA12-WT1+Enhanzyn的小鼠体内的IFN-γOD读数1-1.2相比，免疫接种rRA12-WT1+MPL-SE的小鼠体内的IFN-γOD读数在1.4-1.6的范围内。仅观察到了对p117的肽反应且然后仅在免疫接种rRa12-WTl+MPL-SE的小鼠体内观察到了肽反应。在所有小鼠体内均观察到了针对阳性对照ConA的强IFN-γ反应。仅在免疫接种盐水的阴性对照小鼠体内观察到了针对ConA的反应，这表明该反应对rRA12-WT1具有特异性。
实施例17随机突变的WT1文库的构建在有8-氧代dGTP和dPTP存在的情况下使用聚合酶链反应方法使人WT1的核酸序列发生随机突变(《分子生物学杂志》(Journal ofMolecular Biology)1996；255589-603)。SEQ ID NO380中公开了完全未剪接的人WT1基因且相应的蛋白质序列如SEQ ID NO404中所示。WT1的剪接变异体被用作PCR反应的模板且公开在SEQ IDNOs381(DNA)和408(蛋白质)中。选择条件以使核酸发生变化的频率能够导致氨基酸序列中的靶向改变，通常为PCR产物的5-30％。然后在没有核苷酸类似物存在的情况下使用4种正常的dNTP扩增突变的PCR产物。将这种PCR产物亚克隆入用于免疫接种的哺乳动物表达载体和病毒载体。因此，该文库含有随机突变的WT1克隆的混合群体。选择几种克隆并测序。突变的WT1变异体DNA序列公开在SEQID NO377-379中且该变异体的预测氨基酸序列如SEQ ID NO405-407中所示。可以将这些变化的序列和来自文库的其它序列用作诱导针对癌细胞中的WT1蛋白产生较强T细胞应答的免疫原。
实施例18WT1-LAMP融合体的构建利用聚合酶链反应和含有人溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)与人WT1序列剪接变异体的所需连接物的合成寡核苷酸构建三联融合体。用于这些融合体的WT1剪接变异体和LAMP-1序列公开在SEQ IDNO381和383中。具体地是，使LAMP-1的信号肽(LAMP的第1-87位碱基对)与人WT1可读框的5-起始端(1,290个碱基对的长度)融合，然后使LAMP-1的跨膜和胞质结构域(LAMP的第1161-1281位碱基对)与WT1序列的3-起始端融合。所得WT1-LAMP构建体的序列如SEQ ID NO382(DNA)和SEQ ID NO409(蛋白质)所示。将该构建体设计成当其在真核细胞中进行表达时，信号肽指导蛋白到达内质网(ER)，其中LAMP-1的跨膜和胞质结构域中的定位信号指导所述融合蛋白转运至肽被加载在II类MHC分子上的溶酶体位置。
实施例19用于增强I类MHC呈递的WT1-遍在蛋白质融合体的构建使人遍在蛋白质可读框(SEQ ID NO384)发生突变，使得编码最后氨基酸的核苷酸编码丙氨酸而非甘氨酸。恰在人WT1(SEQ ID NO381和408，分别为DNA和蛋白质)剪接变异体的第一个密码子上游的读框中克隆这种突变的可读框。G→A突变防止了通过翻译过程中正常加工聚遍在蛋白质的蛋白酶对新生蛋白质的共翻译切割。所得构建体的DNA和预测氨基酸序列分别如SEQ ID NO385和410所示。所得蛋白质在人体细胞中表达时显示出低细胞毒性。然而，不能产生表达天然WT1的稳定系，易于获得表达所述融合蛋白的细胞系。预计通过加入的遍在蛋白质分子而使所得蛋白质靶向至蛋白体。这一结果将使WT1特异性CD8+T细胞更有效地识别所述蛋白质。
实施例20表达人WT1的腺表达载体的构建将人WT1(SEQ ID NO381)的剪接变异体克隆入E1和E3缺失的腺病毒血清5型载体。WT1基因的表达由介导高水平的WT1蛋白表达的CMV启动子控制。使用这种试剂感染人细胞产生高水平的WT1蛋白表达。在感染过程中导入宿主细胞且随后以低水平产生的腺病毒蛋白的抗原性质可以增加对作为免疫靶向物的WT1的免疫监测和免疫识别。还可以将该载体免疫接种入人受试者体中来产生对WT1蛋白的免疫反应。如果这些受试者对表达WT1的肿瘤细胞呈阳性反应，那么该免疫反应可以对疾病过程具有治疗或治愈作用。
实施例21表达人WT1的疫苗病毒载体的构建使用pSC11穿梭载体将全长人WT1基因(SEQ ID NO381)的剪接变异体克隆入牛痘病毒的Western Reserve株的胸苷激酶基因座。该WT1基因在牛痘病毒感染过程中介导基因表达的杂种牛痘病毒启动子的控制下。可以将这种试剂用于在体内或体外表达人细胞中的WT1蛋白。WT1是在某些人肿瘤细胞上超表达的自身蛋白。因此，针对作为蛋白质转运的WT1的免疫反应不可能产生I类主要组织相容性(I类MHC)-介导的WT1识别。然而，由牛痘病毒在胞内区室中表达的该蛋白质导致高水平I类MHC呈递和CD8+T细胞对WT1蛋白的识别。由牛痘病毒载体表达的WT1蛋白还在II类MHC中导致WT1肽的呈递而由此被CD4+T细胞识别。
本发明的应用包括将其用作癌症疫苗。对带有WT1阳性肿瘤的人受试者进行免疫接种可以产生治疗或治愈效果。在细胞中表达WT1将导致由CD4和CD8阳性T细胞对所述蛋白质的识别。
实施例22使用完整基因进行致敏产生WT1特异性CD8+T-细胞克隆树突细胞(DC)由来源于经在含有10％人血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-6天的正常供体的PBMC的单核细胞培养物分化而来。培养后，用表达重组WT1的牛痘病毒(如实施例21中所述)以5的感染复数(MOI)将DC感染16小时或用表达重组WT1的腺病毒以MOI为10将DC感染3天。通过UV照射使牛痘病毒失活。通过使用磁性珠的阴性排除分离CD8+T-细胞并使之在96孔平板中开始致敏培养物。每隔7-10天使被设计用来表达WT1的腺病毒或牛痘病毒感染的自体树突细胞对培养物进行再刺激。4-5个刺激循环后，可以鉴定出用表达WT1的自体树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ的CD8+T-细胞系。将这些细胞系进行克隆并通过Elispot试验证实这些系可特异性识别WT1转导的自体成纤维细胞，但不会识别EGFP转导的自体成纤维细胞。
Wilms肿瘤(WT1)基因参与白血病形成且在大部分白血病人和几种实体瘤中超表达。在人体内进行的预研究已经表明在所研究的16/63(25％)的AML患者和15/81(19％)的CML患者体内存在WT1特异性抗体(Ab)反应。在小鼠体内进行的预研究已经证实基于WT1肽的疫苗引发WT1特异性Ab、Th和CTL反应。将肽用作人体疫苗受到其HLA限制性和引发肽特异性反应的倾向和仅限于少数患者体内的肿瘤特异性CTL的限制。完整基因免疫接种的优点在于在单一疫苗中可以包含几种辅助细胞和CTL表位，由此不会将该疫苗限定到特定HLA类型。本文公开的数据证实了使用完整基因的体外致敏来诱导WT1特异性免疫反应而且可以产生WT1特异性CD8+T-细胞克隆。已知在某些白血病患者体内现存针对WT1的免疫性且鼠和人WT1在氨基酸水平上具有与96％的相同性且免疫接种WT1蛋白、DNA或肽可以在小鼠体内引发WT1特异性Ab，和细胞的T细胞应答而对小鼠体内的正常组织没有毒性，这些人体外致敏实验进一步提供了WT1能够作为肿瘤/白血病疫苗的证据。此外，产生WT1特异性CD8+T-细胞克隆的能力可以导致使用遗传工程构建的T细胞治疗与WT1超表达相关的恶性肿瘤。
实施例23用于临床上生产WT1的重组构建体如下详述为生产临床级WT1而制备的5种构建体。
不含His标记物的Ra12/WT-E(SEQ ID NO388(cDNA)和391(蛋白质))和WT-1 E(SEQ ID NO386(cDNA)和395(蛋白质))的设计使用下列非-His的非融合构建体用引物对WT-1 E读框进行PCR扩增PDM-780(SEQ ID NO396)5′gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3′Tm 60℃PDM-779(SEQ ID NO397)5′cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag3′Tm 63℃采用下列PCR循环条件10μl 10X Pfu缓冲液；1μl 10mM dNTPs；2μl 10μM各种寡核苷酸；83μL无菌水；1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)；50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。最初使该反应体系在96℃下变性2分钟，随后进行总计40个由96℃20秒、62℃15秒和72℃1分40秒组成的循环。在该步骤后是72℃4分钟的最终延伸。将PCR产物用NdeI和EcoRI消化且克隆入已经用Ndel和EcoRI消化的pPDM His(修饰的pET28载体)。通过序列分析确定该构建体且然后将其转入BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞。随后将该构建体-pPDM WT-1 E用NcoI和Xbal消化且用作来自pPDM Ral2 WT-1 F(参见下文)的NcoI和XbaI插入物的载体主链。通过序列分析来确定该构建体然后将其转入BLR(DE3)pLysS和HMS 174(DE3)pLys S细胞。通过考马斯染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白序列分析来证实蛋白质表达。
不含His标记物的Ra12-WT-1-F(a.a.1-281)的设计(SEQ ID NO389(cDNA)和393(蛋白质))使用下列引物对Ra12 WT-1读框进行PCR扩增PDM-777(SEQ ID NO398)5′cgataagcatatgacggccgcgtccgataac3′Tm 66℃PDM-779(SEQ ID NO399)5′cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag3′Tm 63℃使用下列PCR循环条件10μl 10X Pfu缓冲液；1μl 10mM dNTPs；2μl 10μM各种寡核苷酸；83μL无菌水；1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)；50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。最初使该反应体系在96℃下变性2分钟，随后进行总计40个由96℃20秒、58℃15秒、72℃3分钟组成的循环。在该步骤后是72℃下4分钟的最终延伸。将PCR产物用NdeI消化且克隆入已经用Ndel和Eco72I消化的pPDM His。通过序列分析证实该构建体且然后将其转入BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞。通过考马斯染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白序列分析来证实蛋白质表达。
不含His标记物的Ra12-WT-1-F的设计(SEQ ID NO390(cDNA)和392(蛋白质))使用下列引物对Ra12 WT-1读框进行PCR扩增
PDM-777(SEQ ID NO400)5′cgataagcatatgacggccgcgtccgataac3′Tm 66℃PDM-778(SEQ ID NO401)5′gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3′Tm 70℃使用下列PCR循环条件10μl 10X Pfu缓冲液；1μl 10mM dNTPs；2μl 10μM各种寡核苷酸；83μL无菌水；1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)；50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。最初使该反应体系在96℃下变性2分钟，随后进行总计40个由96℃20秒、68℃15秒、72℃2分30秒组成的循环。在该步骤后是72℃下4分钟的最终延伸。将PCR产物用NotI和NdeI消化且克隆入已经用Ndel和NotI消化的pPDM His。通过序列分析证实该构建体且然后将其转入BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞。通过考马斯染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白序列分析来证实蛋白质表达。
大肠杆菌中不含His标记物的WT-1 C(a.a.69-430)的设计(SEQID NO387(cDNA)和394(蛋白质))使用下列引物对WT-1 C读框进行PCR扩增PDM-780(SEQ ID NO402)5′gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac3′Tm 60℃PDM-778(SEQ ID NO403)5′gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc3′Tm 70℃使用下列PCR循环条件10μl 10X Pfu缓冲液；1μl 10mM dNTPs；2μl 10μM各种寡核苷酸；83μL无菌水；1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)；50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。最初使该反应体系在96℃下变性2分钟，随后进行总计40个由96℃20秒、62℃15秒、72℃2分钟组成的循环。在该步骤后是72℃下4分钟的最终延伸。将PCR产物用NdeI消化且克隆入已经用Ndel和Eco72I消化的pPDM His。通过序列分析证实该构建体且然后将其转入BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞。通过考马斯染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白序列分析来证实蛋白质表达。
实施例24使用完整基因致敏来产生WT1特异性CD8 T细胞克隆和HLA-A2-限制性WT1表位的鉴定在本实施例中，将腺病毒和牛痘病毒转运载体用于产生WT1特异性T细胞系。证实来自该品系的T细胞克隆对WT1具有特异性且进一步鉴定了由该克隆识别的表位。
树突细胞(DC)由来源于经在含有10％人血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天的正常供体的PBMC的单核细胞培养物分化得到。在培养后，用表达重组WT1的牛痘病毒以5的感染复数(MOI)将DC感染16小时或用表达重组WT1的腺病毒以3-10的MOI将DC感染2-3天。通过UV照射使牛痘病毒失活。通过利用针对CD4、CD14、CD16、CD19和CD56+细胞的抗体阴性排除法、随后通过使用对这些Ab的Fc部分具有特异性的磁性珠来分离CD8+T细胞。
在96孔平板中开始致敏培养物。每隔7-14天使用被改造成表达WT1的腺病毒或牛痘病毒的自体树突细胞将培养物再刺激一次。4-5个刺激循环后，可以鉴定出用表达WT1的自体树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ(IFN-γ)的CD8+T细胞系。克隆这些系并通过Elispot试验证实了这些系可特异性识别WT1转导的自体树突细胞，但不会识别作为对照的转导的成纤维细胞。
为了进一步分析这些WT1特异性CD8+T-细胞克隆的HLA限制，用WT1转导来源于其它供体(D475)的成纤维细胞，它们与由其建立T细胞克隆的供体(D349)仅共有HLA-A2等位基因。ELISPOT分析证实由T细胞克隆识别这些D475靶细胞。为了进一步证实HLA A2限制和证实该表位由“天然”超表达WT1(作为其恶性转化的部分)的肿瘤细胞表达，而对白血病细胞系K562进行测试。用HLA A2分子转导K562并将HLA-A2阴性K562细胞用作非特异性IFN-γ释放的对照。ELISPOT分析证实T细胞识别A2阳性K562细胞系，但不识别A2阴性K562细胞。通过HLA-A2抗体阻断实验进一步证实了这种识别的特异性和HLA-A2限制性。
为了进一步定义WT1表位，生产4种截短的WT1反录病毒构建体。然后用这些构建体转导供体475成纤维细胞。ELISPOT试验证实了用WT1 Trl构建体(aa2-aa92)转导的D475成纤维细胞的识别，由此证实WT1表位位于WT1蛋白的前91个N-末端氨基酸中。为了精确绘制该表位的图谱，合成了重叠11个氨基酸的WT1蛋白的15聚体肽。WT1特异性T-细胞克隆识别两种重叠的15聚体肽，即肽9(QWAPVLDFAPPGASA)(SEQ ID NO412)和肽10(VLDFAPPGASAYGSL)(SEQ ID NO413)。为了进一步对识别的最小表位进行特征描述，将15聚体中共有的9聚体和10聚体肽(总计5个)用于分析克隆的特异性。该克隆特异性识别9聚体，VLDFAPPGA(SEQ ID NO241)和10聚体，VLDFAPPGAS(SEQ ID NO411)。
实施例25来源于对WT1具有特异性的CD8 T细胞的TCRα和β链的克隆和测序克隆来源于对WT1具有特异性的CD8+T细胞克隆的T细胞受体(TCR)α和β链。进行序列分析以证明TCR的α和β链的家族来源。另外，鉴定了独特的多样性和连接片段(产生该反应的特异性)。
使用Trizol试剂从来自WT1特异性CD8+T细胞克隆的2×106个细胞中分离总mRNA并使用备用试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。为了测定克隆中的Vα和Vβ序列，合成了一组α和β亚型特异性引物(基于Clontech，Palo Alto，CA生产的引物序列)并将其用于与来自各克隆的cDNA的RT-PCR反应中。RT-PCR反应证实Vα和Vβ序列由各克隆表达。
为了克隆来自克隆的全长TCRα和β链，设计跨越编码起始密码子和编码终止密码子的TCR核苷酸的引物。使用由CTL克隆合成的cDNA和使用校正的热稳定聚合酶PWO(Roche，Basel，Switzerland)的上述引物建立标准的35个循环的RT-PCR反应。将所得的特异性带(就α链而言～850bp且就β链而言～950)连入PCR平端载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)并转入大肠杆菌。鉴定了用含有全长α和β链的质粒转化的大肠杆菌并产生了相应质粒的大规模制备物。然后使用标准方法对含有全长TCRα和β链的质粒进行测序。由此测定了提供TCR特异性的多样-连接(DJ)区。
尽管本文已经为解释目的描述了本发明的具体实施方案，但是应该认识到可以对上文进行各种修改而不会脱离本发明的实质和范围。因此，本发明并不限于此而由待批权利要求来限定。
序列表<110>Corixa CorporationGaiger，AlexanderMcNeill.Patricia D.
Smithgall，MollyMoulton，GusVedvick，Thomas S.
Sleath，Paul R.
Mossman，SallyEvans，LawrenceSpies，A.GregoryBoydston，Jeremy<120>用于WTl特异性免疫疗法的组合物和方法<130>210121.46501PC<140>PCT<141>2001-10-03<160>413<170>FastSEQ for Windows版本3.0<210>1<211>17<212>PRT<213>人类<400>1Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210>2<211>23<212>PRT<213>人类<400>2Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15
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aatttatacc aaatgacatc ccagcttgaa tgcatgacct ggaatcagat gaacttagga 120gccaccttaa agggccacag cacagggtac gagagcgata accacacaac gcccatcctc 180tgcggagccc aatacagaat acacacgcac ggtgtcttca gaggcattca ggatgtgcga 240cgtgtgcctg gagtagcccc gactcttgta cggtcggcat ctgagaccag tgagaaacgc 300cccttcatgt gtgcttaccc aggctgcaat aagagatatt ttaagctgtc ccacttacag 360atgcacagca ggaagcacac tggtgagaaa ccataccagt gatga 405<210>340<211>339<212>DNA<213>人类<400>340atgcagcatc accaccatca ccaccacagc aggaagcaca ctggtgagaa accataccag 60tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa 120aggagacata caggtgtgaa accattccag tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg 180tccgaccacc tgaagaccca caccaggact catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg 240tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg 300catcagagaa acatgaccaa actccagctg gcgctttga339<210>341<211>1110<212>DNA<213>人类<400>341atgcagcatc accaccatca ccaccactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 60gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 120actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 180tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 240cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 300ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 360cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 420ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 480tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 540atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 600acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 660caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc 720agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg 780tcccacttac agatgcacag caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc 840aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat 900acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac 960ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt 1020
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<213>人类<400>380gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt ccgctccccc 60acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga gccgggacgg 120cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc ctcttgctgc 180aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc cgctccgggc 240ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc atctgggcca 300agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc cgcggggcgt 360ccgggtctga gcctcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg ctgctgcccg 420ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc gcggcgcagt 480gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc ttacgggtcg ttgggcggcc 540ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc gcctcactcc ttcatcaaac 600aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc gccttcactg 660tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc 720ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc 780tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct 840tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc 900actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact 960cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg 1020ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg 1080aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt aaagggagtt gctgctggga 1140gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca cagcacaggg tacgagagcg 1200ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg cacggtgtct 1260tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc cccgactctt gtacggtcgg 1320catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta cccaggctgc aataagagat 1380attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca cactggtgag aaaccatacc 1440agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttctcgttc agaccagctc aaaagacacc 1500aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac ttgtcagcga aagttctccc 1560ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg taaaacaagt gaaaagccct 1620tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc 1680atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct ggcgctttga ggggtctccc 1740tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa ctgctttcaa gtctgactct 1800ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc ttcatccaac ttccaagaca 1860agataccggt gcttctggaa actaccaggt gtgcctggaa gagttggtct ctgccctgcc 1920tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac aatgtctggt tagttaaaag 1980cccattgcca tttggtctgg attttctact gtaagaagag ccatagctga tcatgtcccc 2040ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg gatggaatta ttgtaccatt 2100ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt gtctgctaat gtaaactttg 2160tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa tcagagagca aggcatcggg 2220ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc taacctggaa agcaggatgt 2280agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc agctgaagaa agaatcagaa 2340ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac cattcagtta attcaatgtg 2400aacactggca cactgctctt aagaaactat gaagatctga gatttttttg tgtatgtttt 2460tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg tacatacctc cttgcacaaa 2520
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<223>PCR引物<400>403gtctgcagcg gccgctcaaa gcgccagc28<210>404<211>449<212>PRT<213>人类<400>404Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu<210>405<211>428<212>PRT<213>人类<400>405Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Thr20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Cys35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro50 55 60
Pro Pro Pro Ser His Ser Phe Thr Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Thr Glu Pro His Ala Gly Gln Gly Arg Ser Ala Leu Val Ala His Ser85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Ser165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Ala Pro Pro Pro Val Cys Gly Cys Arg Thr Pro Thr Gly Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Ala Pro Tyr Ser Gly Gly210 215 220Asp Leu His Gln Thr Thr Ser Gln Leu Gly His Met Ala Trp Asn Gln225 230 235 240Thr Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Gly Thr Gly Tyr Glu Ser245 250 255Asp Asp His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Thr Gln Tyr Arg Ile Arg260 265 270Ala Arg Gly Val Leu Arg Gly Thr Gln Asp Val Arg Cys Val Pro Gly275 280 285Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg290 295 300Pro Leu Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg His Phe Lys Pro305 310 315 320Ser Arg Leu Arg Val Arg Gly Arg Glu Arg Thr Gly Glu Lys Pro Tyr325 330 335Gln Arg Asp Phe Lys Asp Arg Gly Arg Gly Leu Leu Arg Pro Asp Gln340 345 350Leu Lys Arg His Gln Arg Gly His Thr Gly Val Lys Pro Leu Gln Cys355 360 365Glu Ala Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Gly His Leu Lys Val His Thr370 375 380Arg Thr His Thr Gly Gly Glu Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys385 390 395 400Gln Glu Lys Ser Ala Arg Pro Asp Glu Ser Ala Arg Arg His Asn Met405 410 415His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
420 425<210>406<211>414<212>PRT<213>人类<220>
<221>变体<222>85，86，172，173，242，245，246，247<223>Xaa＝任何氨基酸<400>406Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Ser Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Asp Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala His35 40 45Gly Pro Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Ser Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Gly Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Leu His Xaa Xaa Gln Tyr Leu Ser Ala Phe Thr Val His Ser85 90 95Ser Gly Gln Val His Trp His Gly Arg Gly Leu Ser Leu Arg Ala Pro100 105 110Arg Pro Pro Ser Ala Gln Pro Gly Val Ile Arg Pro Gly Gln Asp Val115 120 125Ser Arg Ala Leu Pro Ala Gln Pro Pro Arg Glu Pro Ala Arg Tyr Pro130 135 140Gln Ser Gly Leu Gln His Gly His Leu Arg Arg Gly Val Arg Leu Arg145 150 155 160Ser His Ala Leu Ala Pro Cys Gly Ala Val Leu Xaa Xaa Thr Arg Ala165 170 175Gly Ser His Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Leu Gly Ala180 185 190Ala Pro Gly Leu Trp Pro Pro His Pro Arg Arg Gln Leu Arg Arg Gln195 200 205Pro Gly Phe Ala Ala Glu Gly Ala Leu Gln Arg Arg Phe Ile Pro Ser210 215 220Asp Val Pro Ala Val His Gly Leu Glu Ser Asp Glu Pro Arg Gly Arg225 230 235 240Leu Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Val Arg Glu Arg Ser His Asn Ala Arg
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Pro Ser Ala Pro Tyr Leu Ser Ser Cys Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile130 135 140Arg Ser Gln Gly Arg Ser Thr Ala Pro Ser Ala Gly Arg Pro Ala Met145 150 155 160Ala Pro Thr Leu Ala Pro Pro Ala Gln Ser His Tyr Ser Gln His Gly165 170 175Val Leu His Gly Pro Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Val Leu Gly Ala180 185 190Ala Pro Gly Leu Trp Leu Pro His Pro His Arg Gln Leu His Arg Gln195 200 205Pro Gly Phe Ala Ala Glu Asp Ala Leu Gln Gln Gln Phe Ile Pro Asn210 215 220Asp Ile Pro Ala Met His Asp Leu Glu Ser Asp Glu Leu Arg Ser His225 230 235 240Leu Lys Gly Pro Gln His Arg Val Arg Glu Arg Pro His Asn Ala His245 250 255Pro Leu Arg Ser Pro Ile Gln Asn Thr His Ala Arg Cys Leu Gln Arg260 265 270His Ser Gly Cys Ala Thr Cys Ala Trp Ser Ser Pro Asp Ser Cys Thr275 280 285Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Asn Ala Pro Trp Cys Val Leu Pro Gly290 295 300Leu Gln Gly Val Phe Ala Val Pro Leu Thr Gly Ala Gln Gln Glu Ala305 310 315 320His Trp Asp Ala Thr Pro Val Arg Leu Gln Gly Pro Trp Thr Arg Ala325 330 335Ser Pro Phe Gly Thr Ser Pro Arg Asp Thr Lys Gly Asp Ile Gln Val340 345 350Arg Asn His Ser Ser Val Arg Leu Val Ser Glu Gly Ser Pro Gly Pro355 360 365Thr Thr Gly Pro Thr Pro Gly Pro Thr Arg Val Gly Ser Pro Ser Ala370 375 380Ala Gly Gly Gln Ala Ala Arg Glu Gly Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser385 390 395 400Val Ile Thr Thr Cys Ile Ser Glu Thr Leu Asn Ser Ser Trp Arg Phe405 410 415Glu<210>408<211>429<212>PRT<213>人类
<400>408Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser245 250 255Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His260 265 270Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly275 280 285Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg290 295 300Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu305 310 315 320Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr325 330 335Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln340 345 350
Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys355 360 365Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His370 375 380Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser385 390 395 400Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn405 410 415Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu420 425<210>409<211>495<212>PRT<213>人类<400>409Met Ala Ala Pro Gly Ala Arg Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Gly Leu Ala His Gly Ala Ser Ala Leu Phe Glu Asp Leu Met Gly Ser20 25 30Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly35 40 45Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala50 55 60Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu65 70 75 80Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His85 90 95Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu100 105 110Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr115 120 125Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro130 135 140Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr145 150 155 160Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr165 170 175Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser180 185 190His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro195 200 205Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
210 215 220Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln225 230 235 240Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met245 250 255Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala260 265 270Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr275 280 285Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe290 295 300Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu305 310 315 320Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala325 330 335Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met340 345 350His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys355 360 365Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln370 375 380Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg385 390 395 400Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr405 410 415Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe420 425 430Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn435 440 445Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu Leu Asn Asn Met Leu Ile Pro Ile450 455 460Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala465 470 475 480Tyr Leu Ile Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile485 490 495<210>410<211>504<212>PRT<213>人类<400>410Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp20 25 30Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys35 40 45Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu50 55 60Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Met Gly Ser Asp65 70 75 80Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly85 90 95Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro100 105 110Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly115 120 125Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His130 135 140Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu145 150 155 160Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr165 170 175Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro180 185 190Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr195 200 205Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr210 215 220Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser225 230 235 240His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro245 250 255Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro260 265 270Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln275 280 285Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Ash Leu Tyr Gln Met290 295 300Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala305 310 315 320Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr325 330 335Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe340 345 350Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu355 360 365Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
370 375 380Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met385 390 395 400His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys405 410 415Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln420 425 430Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg435 440 445Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr450 455 460Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe465 470 475 480Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn485 490 495Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu500<210>411<211>10<212>PRT<213>人类<400>411Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser1 5 10<210>412<211>15<212>PRT<213>人类<400>412Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala1 5 10 15<210>413<211>15<212>PRT<213>人类<400>413Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leul 5 10 15
权利要求书(按照条约第19条的修改)1.含有选自下列一组序列的序列的被分离多核苷酸(a)SEQ ID NO327-331、337-341、和377-390中提供的序列；(b)SEQ ID NO327-331、337-341和377-390中提供的序列的互被序列；(c)由SEQ ID NO327-331、337-341和377-390中提供的序列的至少20个邻接残基组成的序列；(d)在中等严格条件下与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390中提供的序列进行杂交的序列；(e)与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390的序列具有至少75％相同性的序列；(f)与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390的序列具有至少90％相同性的序列；和(g)SEQ ID NO327-331、337-341、和377-390提供的序列的简并变异体。
2.含有选自下列组氨基酸序列的氨基酸序列的分离多肽(a)由权利要求1的多核苷酸编码的序列；和(b)与权利要求1的多核苷酸编码的序列具有至少70％相同性的序列；和(c)与权利要求1的多核苷酸编码的序列具有至少90％相同性的序列；(d)SEQ ID NO241、332-336、342-346、391-395和404-413中所示的序列；(e)与SEQ ID NO241、332-336、342-346、391-395和404-413所示的序列具有至少70％相同性的序列；和(f)与SEQ ID NO241、332-336、342-346、391-395和404-413所示的序列具有至少90％相同性的序列。
3.含有与表达控制序列可操作连接的权利要求1的多核苷酸的表达载体。
4.用权利要求3的表达载体转化或转染的宿主细胞。
5.与权利要求2的多肽特异性结合的分离抗体或其抗原结合片段。
6.检测患者患有癌症的方法，该方法包括下列步骤(a)从患者体内取得生物样品；(b)使该生物样品与结合了权利要求2的多肽的结合剂接触；(c)检测该样品中与所述结合剂结合的多肽的量；和(d)将多肽的量与预定截断值进行比较且由此测定患者患有癌症。
7.包含至少一种权利要求2所述多肽的融合蛋白。
8.在中等严格条件下与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390所示的序列杂交的寡核苷酸。
9.对肿瘤蛋白特异性T细胞进行刺激和/或扩增的方法，该方法包括使T细胞与至少一种成分在足以刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下进行接触的步骤，所述的至少一种成分选自下列一组成分(a)权利要求2的多肽；(b)权利要求1的多核苷酸；和(c)表达权利要求1的多核苷酸的抗原呈递细胞。
10.分离的T细胞群体，包括按照权利要求9的方法制备的T细胞。
11.含有选自生理上可接受载体和免疫刺激剂的第一种成分和选自下列成分的第二种成分的组合物(a)权利要求2的多肽类；(b)权利要求1的多核苷酸；(c)权利要求5的抗体；(d)权利要求7的融合蛋白；(e)权利要求10的T细胞群体；和(f)表达权利要求2所述多肽的抗原呈递细胞。
12.刺激患者体内免疫应答的方法，该方法包括对该患者施用权利要求11所述组合物的步骤。
13.患者体内癌症的治疗方法，该方法包括对所述患者施用权利要求11的组合物的步骤。
14.测定患者体内存在的癌症的方法，该方法包括下列步骤(a)从患者体内取得生物样品；(b)使该生物样品与权利要求8的寡核苷酸接触；(c)检测该样品中与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；和(d)将与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量与预定的截断值进行比较由此测定患者体内存在的癌症。
15.包含至少一种权利要求8的寡核苷酸的诊断用试剂盒。
16.诊断用试剂盒，包含至少一种权利要求5的抗体和检测试剂，其中所述的检测试剂含有报道基因。
17.抑制患者体内癌症发生的方法，该方法包括下列步骤
(a)将分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与至少一种成分一起进行温育，所述的至少一种成分选自下列成分(i)权利要求2的多肽；(ii)权利要求1的多核苷酸；和(iii)表达权利要求2的多肽的抗原呈递细胞，从而使T细胞增殖；(b)对患者施用有效量的增殖T细胞且由此抑制患者体内癌症的发生。
18.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液含有至少一种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％。
19.权利要求18所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
20.权利要求18所述的组合物，其中所述的浓度约为10％。
21.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液包括至少两种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的糖，其浓度为约7-约13％。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
23.权利要求21所述的组合物，其中所述的浓度约为10％。
24.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液包括至少三种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
26.权利要求24所述的组合物，其中所述的浓度约为10％。
27.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液包括(a)至少一种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％；(b)乙醇胺；(c)半胱氨酸；和(d)聚山梨醇酯-80。
28.权利要求27所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
29.权利要求27所述的组合物，其中所述的浓度约为10％。
30.权利要求18-29中任意一项权利要求的组合物，其中所述的WT1多肽包括Ra12-WT1融合多肽。
31.包括WT1多肽和MPL-SE的组合物。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述的WT1多肽含有Ra12-WT1融合多肽。
33.含有WT1多肽和Enhanzyn的组合物。
34.权利要求33所述的组合物，其中所述的WT1多肽含有Ra12-WT1融合多肽。
35.含有权利要求2的多肽的疫苗，它与非特异性免疫反应增强剂联用。
36.权利要求35的疫苗，其中所述的免疫反应增强剂是佐剂。
37.权利要求35的疫苗，其中所述的免疫反应增强剂选自下列物质基于明矾的佐剂；基于油的佐剂，Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Montanide ISA 720；GM-CSF；基于非离子型嵌段共聚物的佐剂；基于二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1、AS-2；基于Ribi佐剂系统的佐剂；QS21；Quil A；SAF(显微流态形式的Syntex佐剂(SAF-m))；二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)；基于人类补体的佐剂母牛分枝杆菌；ISCOMS；MF-59；SBAS-2；SBAS-4；Enhanzyn_；RC-529；AGPs；MPL-SE；QS7；七叶皂苷；毛地黄皂苷；和丝石竹(Gypsophila)、Chenopodium quinoa皂苷。
38.疫苗，含有下列成分a.权利要求2的WT1多肽，其中所述多肽含有WT1的免疫原性部分；和b.优选增强患者体内T细胞应答的非特异性免疫反应增强剂。
39.权利要求38的疫苗，其中所述免疫反应增强剂选自下列物质基于明矾的佐剂；基于油的佐剂，Specol、RIBI、TiterMax、MontanideISA50或Montanide ISA 720；GM-CSF；基于非离子型嵌段共聚物的佐剂；基于二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1、AS-2；基于Ribi佐剂系统的佐剂；QS21；Quil A；SAF(显微流态形式的Syntex佐剂(SAF-m))；二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)；基于人类补体的佐剂母牛分枝杆菌；ISCOMS；MF-59；SBAS-2；SBAS-4；Enhanzyn_；RC-529；AGPs；MPL-SE；QS7；七叶皂苷；毛地黄皂苷；和丝石竹(Gypsophila)、Chenopodium quinoa皂苷。
40.含有权利要求1的多核苷酸的疫苗，它与非特异性免疫反应增强剂联用。
41.权利要求40所述的疫苗，其中所述的免疫反应增强剂是佐剂。
42.权利要求40的疫苗，其中所述的免疫反应增强剂选自下列物质基于明矾的佐剂；基于油的佐剂，Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Montanide ISA 720；GM-CSF；基于非离子型嵌段共聚物的佐剂；基于二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1、AS-2；基于Ribi佐剂系统的佐剂；QS21；Quil A；SAF(显微流态形式的Syntex佐剂(SAF-m))；二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)；基于人类补体的佐剂母牛分枝杆菌；ISCOMS；MF-59；SBAS-2；SBAS-4；Enhanzyn_；RC-529；AGPs；MPL-SE；QS7；七叶皂苷；毛地黄皂苷；和丝石竹(Gypsophila)、Chenopodium quinoa皂苷。
43.疫苗，含有下列成分a.权利要求1的WT1多核苷酸，其中所述多核苷酸包含WT1的免疫原性部分；和b.优选增强患者体内T细胞应答的非特异性免疫应答增强增强剂。
44.权利要求43的疫苗，其中所述的免疫反应增强剂选自下列物质基于明矾的佐剂；基于油的佐剂，Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Montanide ISA 720；GM-CSF；基于非离子型嵌段共聚物的佐剂；基于二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1、AS-2；基于Ribi佐剂系统的佐剂；QS21；Quil A；SAF(显微流态形式的Syntex佐剂(SAF-m))；二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)；基于人类补体的佐剂母牛分枝杆菌；ISCOMS；MF-59；SBAS-2；SBAS-4；Enhanzyn_；RC-529；AGPs；MPL-SE；QS7；七叶皂苷；毛地黄皂苷；和丝石竹(Gypsophila)、Chenopodium quinoa皂苷。
权利要求
1.含有选自下列一组序列的被分离多核苷酸(a)SEQ ID NO327-331、337-341、和377-390中提供的序列；(b)SEQ ID NO327-331、337-341和377-390中提供的序列的互补序列；(c)由SEQ ID NO327-331、337-341和377-390中提供的序列的至少20个邻接残基组成的序列；(d)在中等严格条件下与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390中提供的序列进行杂交的序列；(e)与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390的序列具有至少75％相同性的序列；(f)与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390的序列具有至少90％相同性的序列；和(g)SEQ ID NO327-331、337-341、和377-390提供的序列的简并变异体。
2.含有选自下列一组氨基酸序列的氨基酸序列的分离多肽(a)由权利要求1的多核苷酸编码的序列；和(b)与权利要求1的多核苷酸编码的序列具有至少70％相同性的序列；和(c)与权利要求1的多核苷酸编码的序列具有至少90％相同性的序列；(d)SEQ ID NO241、332-336、342-346、391-395和404-413中所示的序列；(e)与SEQ ID NO241、332-336、342-346、391-395和404-413所示的序列具有至少70％相同性的序列；和(f)与SEQ ID NO241、332-336、342-346、391-395和404-413所示的序列具有至少90％相同性的序列。
3.含有与表达控制序列可操作连接的权利要求1的多核苷酸的表达载体。
4.用权利要求3的表达载体转化或转染的宿主细胞。
5.与权利要求2的多肽特异性结合的分离抗体或其抗原结合片段。
6.检测患者患有癌症的方法，该方法包括下列步骤(a)从患者体内取得生物样品；(b)使该生物样品与结合了权利要求2的多肽的结合剂接触；(c)检测该样品中与所述结合剂结合的多肽的量；和(d)将多肽的量与预定截断值进行比较且由此测定患者患有癌症。
7.包含至少一种权利要求2所述多肽的融合蛋白。
8.在中等严格条件下与SEQ ID NO327-331、337-341和377-390所示的序列杂交的寡核苷酸。
9.对肿瘤蛋白特异性T细胞进行刺激和/或扩增的方法，该方法包括使T细胞与至少一种成分在足以刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下进行接触的步骤，所述的至少一种成分选自下列一组成分(a)权利要求2的多肽；(b)权利要求1的多核苷酸；和(c)表达权利要求1的多核苷酸的抗原呈递细胞。
10.分离的T细胞群体，包括按照权利要求9的方法制备的T细胞。
11.含有选自生理上可接受载体和免疫刺激剂的第一种成分和选自下列成分的第二种成分的组合物(a)权利要求2的多肽；(b)权利要求1的多核苷酸；(c)权利要求5的抗体；(d)权利要求7的融合蛋白；(e)权利要求10的T细胞群体；和(f)表达权利要求2所述多肽的抗原呈递细胞。
12.刺激患者体内免疫应答的方法，该方法包括对该患者施用权利要求11所述组合物的步骤。
13.患者体内癌症的治疗方法，该方法包括对所述患者施用权利要求11的组合物的步骤。
14.测定患者体内存在的癌症的方法，该方法包括下列步骤(a)从患者体内取得生物样品；(b)使该生物样品与权利要求8的寡核苷酸接触；(c)检测该样品中与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；和(d)将与所述寡核苷酸杂交的多核苷酸的量与预定的截断值进行比较由此测定患者体内存在的癌症。
15.包含至少一种权利要求8的寡核苷酸的诊断用试剂盒。
16.诊断用试剂盒，包含至少一种权利要求5的抗体和检测试剂，其中所述的检测试剂含有报道基因。
17.抑制患者体内癌症发生的方法，该方法包括下列步骤(a)将分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与至少一种成分一起进行温育，所述的至少一种成分选自下列成分(i)权利要求2的多肽；(ii)权利要求1的多核苷酸；和(iii)表达权利要求2的多肽的抗原呈递细胞，从而使T细胞增殖；(b)对患者施用有效量的增殖T细胞且由此抑制患者体内癌症的发生。
18.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液含有至少一种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％。
19.权利要求18所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
20.权利要求18所述的组合物，其中所述的浓度为约10％。
21.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液包括至少两种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
23.权利要求21所述的组合物，其中所述的浓度为约10％。
24.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液包括至少三种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
26.权利要求24所述的组合物，其中所述的浓度约为10％。
27.包含悬浮于一种缓冲液中的WT1多肽的组合物，所述的缓冲液包括(a)至少一种选自海藻糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的糖，其浓度为约7-约13％；(b)乙醇胺；(c)半胱氨酸；和(d)聚山梨醇酯-80。
28.权利要求27所述的组合物，其中所述的浓度为约8-约12％。
29.权利要求27所述的组合物，其中所述的浓度为约10％。
30.权利要求18-29中任意一项权利要求的组合物，其中所述的WT1多肽包括Ra12-WTl融合多肽。
31.包括WT1多肽和MPL-SE的组合物。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述的WT1多肽含有Ra12-WT1融合多肽。
33.含有WT1多肽和Enhanzyn的组合物。
34.权利要求33所述的组合物，其中所述的WT1多肽含有Ra12-WT1融合多肽。
全文摘要
本发明公开了用于治疗诸如白血病和癌症这样的恶性疾病的组合物和方法。该组合物包括一种或多种WT1多核苷酸、WT1多肽、提呈WT1多肽的抗原呈递细胞、特异性结合WT1多肽的抗体或与WT1多肽发生特异性反应的T细胞。例如，可以将这类组合物用于预防和这类转移性疾病。
文档编号A61K48/00GK1505526SQ01819114
公开日2004年6月16日 申请日期2001年10月3日 优先权日2000年10月6日
发明者亚历山大·盖杰, P·D·迈克内尔, M·史密斯戈尔, G·莫尔顿, T·S·韦德维克, P·R·斯莱斯, S·莫斯曼, L·埃文斯, A·G·斯皮斯, J·伯伊斯顿, 乃, 了苟, 亚历山大 盖杰, 孤, 斯皮斯, 斯莱斯, 芩垢甓, 迈克内尔, 韦德维克 申请人:科里克萨有限公司, 亚历山大·盖杰