新型壳聚糖衍生物的制作方法

专利名称：新型壳聚糖衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的壳聚糖衍生物，以及这种衍生物的制备方法。本发明还涉及这些衍生物作为药物组合物，用于治疗于治疗哺乳动物的肥胖症、也可用于治疗哺乳动物高甘油三酯症。
现代社会肥胖病频发，这是由多种原因造成的一方面是遗传因素，如不同的种族肥胖发病率有差异，不同的家庭肥胖者数量明显不同。另一方面是环境因素，如医疗条件的改善、生活水平的提高，尤其是我国改革开放后，生活饮食方式改变过快。
肥胖是温和杀手，慢慢使人出现糖代谢紊乱、脂质代谢紊乱、心血管紊乱、脂肪肝紊乱等功能障碍，直至生命死亡。肥胖在基础研究和临床医疗中发现的高度危险性应该让大众意识觉醒。
肥胖的危险表现在如下几个方面1)危及呼吸当人的体重增加时，肺部就必须输送更多的氧气供给所需，然而肺并没有因为体重的增加而相应变大，另外下腹部肥厚的脂肪也会限制肺的呼吸活动。若进行麻醉性手术，危险性将会相对提高许多。至于气喘的病人如果肥胖，问题就更加严重了，常常出现呼吸困难、意识障碍、嗜眠、痉挛、青紫症等。2)危及血压血压高多发生在肥胖者身上，血压高可能会导致脑部中风、肾脏退化与心脏等器官有不同程度的损伤，所以体重过重且血压高病人必需进行适当的减重计划。3)危及心脏当一个人的体重增加，心脏就必须更辛勤工作，以供应营养到身体内的所有器官，体重愈重，心脏的负荷就愈大，所以肥胖者患心脏病的频率会比一般人高。当脂肪沉淀于心肌中或心膜下时，会形成脂肪心而使心功能混乱。4)危及血管由于过多的血胆固醇、血脂肪堆积于动脉管壁上，会使血管变小甚至造成血管破裂，进而导致中风或心脏病突发。研究显示，肥胖者发生动脉粥状硬化机率非常地高。中年肥胖者冠状动脉硬化常导致心肌梗塞心肌死亡。5)危及肝功肝脏是身体中最重要器官之一，长期酗洒及患有糖尿病、肥胖者等都会造成脂肪肝的形成，如果持续不改善，长期下来引起肝细胞坏死，会导致肝硬化。6)危及胰岛糖尿病几乎是所有肥胖者的专利，在研究指出的糖尿病病历中，因高糖类、高热量的饮食加大胰岛负担引起的糖尿病者，有70~85％的人体重一减轻，其病况都有改进，所以唯有维持理想体重，再配合医师及营养师的协助，才能杜绝死亡的危机。7)危及活动体重过重者，身体骨骼无法承受重量，常引起关节肿胀而发炎。肥胖者体积庞大，往往需要付出更大的体力来完成一定量的工作，再加上反应迟缓，动作不灵活敏捷，频频发生意外。8)危及后代。肥胖的孕妇，容易造成生产困难或延长生产时间，而影响胎儿的健康。再者严重过胖者，除怀孕困难外，孕妇及胎儿死亡率也较高；而且因为过多肥厚肌肉组织，手术进行起来更加困难。
目前，治疗肥胖症的药物和保健食品众多。影响中枢儿茶酚胺(CA)类的药物苯丙胺、甲苯丙胺、苄甲苯丙胺、安非拉酮、右苯丙胺；影响中枢5-羟色胺类的药物芬氟拉明、右芬氟拉明抑制饱食中枢，(最新Quipazine、MCPP，5-羟色胺受体激动剂)；同时影响儿茶酚胺和5-羟色胺类药物吲哚衍生物吗吲哚及环咪唑吲哚(Sibutramine西布曲明，1997年FDA)；增加能量消耗的药物-中枢兴奋药麻黄碱(Ephedrine)、茶碱、咖啡因等。
以上常用的药物中芬氟拉明和右芬氟拉明，因其毒性大，副作用较多，全球范围内已经停用。西布曲明虽然有效，但为饮食抑制剂，并可引起患者的血压升高、心率加快，且不能应用于具有冠心病、心律失常、高血压控制不佳和卒中等病史的患者，有其不足之处。
脂肪酶抑制剂是一种新型的减肥药物。如esterastin(见US 4,189438)、tetrahydroesterastin(四氢化脂肪酶抑制剂)、tetrahydrostatin(见US5,643874，orlistat，奥利司他)是众所周知的脂肪酶抑制剂。
其中最早在美国上市的脂肪酶抑制剂是奥利司他(orlistat)，(2S，3S，5S)-5-[(S)-2-甲酰胺基-4-甲基-戊酰氧基]-2-己基-3-羟基-十六烷酸1，3内酯。奥利司他抑制消化道的脂肪酶，从而防止食物中脂肪的吸收。在吃含脂肪的食物前后，服用120mg剂量的奥利司他，则摄入体内的三分之一不被吸收，这些未被吸收的脂肪以脂肪油的性质排出体外，从而引起令人不快的脂肪油性便。
壳聚糖也称为脱乙酰甲壳素或甲壳胺，它是将甲壳素的乙酰基脱去而形成的。研究表明壳聚糖在体内的安全性极高，可以作为食物和保健食品以及食品添加剂使用(石玲，壳聚糖的安全性研究，中国海洋药物，2000，19(1)，25～28)。壳聚糖在体内能够吸收甘油三酯、脂肪和胆固醇，对脂肪肝的形成具有明显的预防作用，其机理除了减少脂肪自肠道的吸收外，还可能有保护肝脏，提高肝抗氧化能力，促进其对脂质的氧化与转运功能的作用(蒋莉等，壳聚糖对大鼠实验性脂肪肝的防治作用，中国海洋药物，2001，20(1)，28～31)。Jennings等对燕麦胶、壳聚糖、考来烯胺的降脂作用及对大鼠肠道的形态学的影响作了比较。结果纤维素组肝脂增加3倍，肝胆固醇浓度增加10倍，考来烯胺组、壳聚糖组、燕麦胶组都明显降低肝胆固醇，与纤维素组相比，考来烯胺组、壳聚糖组降低血浆胆固醇作用较强，燕麦胶组作用较弱。除燕麦胶降低血清铁以外，考来烯胺、壳聚糖对血红蛋白、血清铁几乎无影响。小肠及大肠的病理学形态检查，发现考来烯胺组小肠和大肠的远端粘膜增厚，而燕麦胶组和壳聚糖组无此变化。结果表明，壳聚糖具有与考来烯胺同样的降脂活性，而不会引起小肠粘膜的增厚(A comparison of thelipid-lowering and intestinal morphological effects of cholestyramine，chitosan，and oat gum in rats.Jennings CD，Boleyn K，Bridges SR，WoodPJ，Anderson JW，Proc Soc Exp Biol Med 1988 Oct 18913-20)。因此，壳聚糖也作为减肥的保健食品在全世界销售。
壳聚糖是一种弱的阴离子交换剂，有一定的降血脂作用，但口服用量太大，如果要把它制成药物，必须提高它的药理作用，减小口服用量。为了提高减肥的疗效，将壳聚糖改性。比如，Lee等人做了很多的工作，他们在壳聚糖基本结构上衍生了新的化合物，并通过反相HPLC检测了这几种化合物在NaCl溶液体外结合胆酸能力，壳聚糖(Chitosan)、DEAE-Chitosan、季铵化DEAE-Chitosan和考来烯胺对甘氨胆酸钠结合能力分别为1.42、3.12、4.06、2.78mmol/g；H2-Chitosan、季铵化NH2-Chitosan和考来烯胺对甘氨胆酸钠结合能力分别为1.92、2.56、2.78mmol/g；Chitosan、NH2-Chitosan、DMAE-Chitosan、DMAIP-Chitosan、DEAE-Chitosan对甘氨胆酸钠结合能力分别为1.42、1.92、2.35、2.68、3.12mmol/g，从中看出季铵化DEAE-Chitosan对胆酸的结合能力比考来烯胺增加50％，季铵化NH2-Chitosan比Chitosan增加近80％，壳聚糖衍生物对胆酸的结合能力随着6-O-所联的烷基碳链增长而增大。表明壳聚糖骨架上正电荷及壳聚糖6-O-烷基的疏水性在与胆酸的结合能力方面起着重要的作用(Modification of chitosan to improve itshypocholesterolemic capacity.Lee JK，Kim SU，Kim JH，Biosci BiotechnolBiochem，1999 May 63833-9)。
Kotze等把N-三甲基壳聚糖氯化季铵盐(TMC)(季铵化度为12.88％)与不同的壳聚糖盐对小肠上皮细胞通透性的影响作了比较，盐酸壳聚糖、谷氨酸壳聚糖、TMC在pH6.2，浓度为0.25％时，能迅速明显的降低小肠跨膜电阻(TEER)，降低值分别为84％、60％、24％；随着TMC浓度的增高，降低TEER的作用更强。在使用亲水性的放射标记物14C甘露糖和11CPEG-4000所作的跨膜转运研究中，观察到了同样的结果。盐酸壳聚糖、谷氨酸壳聚糖、TMC分别使14C甘露糖跨膜转运增加了34倍、25倍和11倍。TMC的浓度增加，两种标记物的通透性增加。由于TMC的季铵化结构，TMC的溶解性比其他壳聚糖盐好，它的高溶解性可弥补了在相同浓度情况下其作用弱的不足。在pH＝7.4时，TMC仍溶解，而其他壳聚糖盐是不溶的。结果表明，这些多聚物能增加大分子亲水性物质的跨膜转运，电荷、电荷密度以及壳聚糖的结构特点是影响亲水性物质吸收的重要因素。作者认为，TMC降低TEER，增加了亲水性物质的跨膜吸收，TMC也许以同样的机理，使甘油三酯、胆固醇等脂溶性物质的吸收减少，随之增加了排泄而达到调血脂作用(J.Controled Release，1998，51(1)35)。
影响壳聚糖调脂作用的因素也比较多，据报道3～5个葡萄糖单体的小分子壳聚糖无降低血浆胆固醇的作用；相对分子质量＞75KD壳聚糖随相对分子质量的升高，降胆固醇的作用减弱，当相当分子质量大于750KD时几乎无降胆固醇的作用；Ikuo等以相对分子质量50KD的壳聚糖作为原料，用酶解法降解为5～20KD的低相对分子质量的壳聚糖，同时对这些低相对分子质量的壳聚糖与50KD壳聚糖的调脂活性作了比较，结果5～20KD低分子壳聚糖干扰小鼠胆固醇的小肠吸收，增加中性固醇的粪便排泄，同时能降低甘油三酯与相对分子质量50KD壳聚糖有同样的调脂活性，表明低相对分子质量的壳聚糖也可作为降胆固醇的药物。另外粘度和脱乙酰度对脂类代谢也有影响，粘度越大脱乙酰程度越高，脂肪消化吸收越差，从粪便排除越多(J.Agric.FoodChem.，1993，41431)。
将壳聚糖与脂肪酸形成复合物，也可以有效的减少脂肪的细化和吸收(见WO00/50090)。
关于壳聚糖降脂作用的原理，目前尚无定论。有人认为，壳聚糖是一种弱的阴离子交换树脂，在肠内能与胆酸、胆固醇结合，随着粪便一起排出体外而起到降脂作用。壳聚糖也是一种粘性的多糖类纤维素，也可能有与燕麦胶、果冻等粘性纤维类似的通过胃的排空延迟而起到降脂作用的特性。为了阐明壳聚糖是否因增加胰脂肪酶的活性而起到降脂作用，在给予小鼠含卵磷脂、阿拉伯胶或Trix-100作为乳化剂的甘油三酯饮食，同时服用壳聚糖9周，用卵磷脂作乳化剂时，壳聚糖抑制甘油三酯的水解，但用阿拉伯胶或Trix-100作乳化剂时对甘油三酯无水解作用，说明壳聚糖的抑制作用位点不在胰脂肪酶而是在其底物。
为了解决服用脂肪酶抑制剂(如，奥利司他)出现油性大便的副作用。专利WO00/09123将脂酶抑制剂和壳聚糖形成药物组合物，可以有效地减少油性大便的出现。但是，由于普通的壳聚糖与脂肪的结合能力差，单次的口服剂量6g以上，服用不方便。
专利WO00/29641描述了(氧杂环丁酮衍生物)脂肪抑制剂与酰化的壳聚糖或纤维素接枝的方法，用于治疗肥胖。但专利中仅与壳聚糖或酰化的壳聚糖相连，其衍生化的壳聚糖与脂肪的结合能力提高不大。
本发明的新型壳聚糖衍生物，是以天然壳聚糖作为母体聚合物，按本发明的要求接枝上脂肪酶抑制剂、季铵盐、羧酸等化合物，使壳聚糖具有脂肪酶抑制剂的作用，同时又有增加了壳聚糖的脂肪结合能力的作用。
本发明的新型壳聚糖衍生物，由于脂肪酶抑制剂接枝在大分子的壳聚糖上，使之变成完全不能吸收，只在肠道中起作用，减少了脂肪酶抑制剂可能被吸收而引起的副作用。
本发明进一步涉及使用本文所描述的方法中的壳聚糖衍生物，以及制备壳聚糖衍生物的新型中间体和方法。
本发明进一步涉及新型壳聚糖衍生物的药学上可接受的异构体、水合物、溶剂化物、盐以及前药衍生物。
本发明中所述的与壳聚糖连接的脂肪酶抑制剂基团是指抑制脂肪酶活性的化合物。
本发明中所述的壳聚糖是指甲壳素经脱乙酰化后得到的物质，也称为壳多糖、脱乙酰甲壳素、甲壳胺。其化学名称为(1，4)聚-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖。
本发明的特点和其他细节在下面以及在权利要求书中作更具体的描述和说明。可以理解认为，对本发明的特别具体实施不是对本发明的限制，本发明的重要特点可以在不背离本发明的精神的情况下使用在不同的具体实施例中。
本发明描述了一种含一个或多个能抑制脂肪酶的基团的衍生化壳聚糖，用于治疗肥胖和高甘油脂症。本发明的新型壳聚糖衍生物还含有季铵盐或羧酸，以进一步增加与脂肪的结合能力。本发明的壳聚糖衍生物不仅能够抑制脂肪酶，还能够减少吸收甘油酯，防止出现脂肪便的副作用，同时，本发明中的季铵盐能够与消化系统中的胆酸结合，进一步组织脂肪的消化和吸收，具有一定的协同作用。本发明的壳聚糖衍生物引入了羧酸，进一步增加了壳聚糖的水溶性，不仅有利于简化制剂工艺，而且还能有利于本发明的药物在消化系统中发挥更好的作用。本发明的壳聚糖衍生物引入了季铵盐，它克服了壳聚糖自身在肠道的弱碱环境中，壳聚糖上氨基上产生正电荷的能力减少，降低了与带负电荷脂肪的结合能力的缺点。总之，本发明的壳聚糖衍生物在结合包覆肠道内脂肪的基础上，抑制了脂肪酶水解脂肪的能力，并与消化系统中的胆酸结合，进一步阻止了脂肪的消化与吸收，同时它又防止出现服用脂肪酶抑制剂出现油性便的不良反应。
本发明是由以下结构组成的壳聚糖衍生物 其中R1是脂肪酶抑制剂；R2是季铵盐或与胺连接的季铵盐基团；R3是羧酸或磷酸或磺酸；(R1)、(R2)(R3)分别是R1、R2、R3连接到壳聚糖-CH2OH上的结构；n1为壳聚糖分子链中的基本单元数；n2为壳聚糖分子中未脱乙酰的部分的单元数；n3为壳聚糖接枝脂肪酶抑制剂的单元数；
n4为壳聚糖接枝季铵盐化合物的单元数；n5为壳聚糖接枝羧酸或磷酸或磺酸的单元数；脂肪酶抑制剂R1的结构如下 其中R是H、-(CH2)n-NR21R31、-(CH2)n-CO2H、-(CH2)n-OCOR21、-(CH2)n-NHCOR21、取代的或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳族基团；X是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；Y是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；R21和31各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；n、m、p各自分别是0到35之间的整数；脂肪酶抑制剂R1的结构也可以如下 其中R是H、-(CH2)n-NR21R31、-(CH2)n-CO2H、-(CH2)n-OCOR21、
-(CH2)n-NHCOR21、取代的或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳族基团；X是硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-、氨基酸或它们的衍生物；R211和R31各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；m、p各自分别是0到35之间的整数。脂肪酶抑制剂R1的结构还可以如下 其中X是硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-、氨基酸或它们的衍生物；Y是是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；R21各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；m、p、r各自分别是0到35之间的整数。
本发明的壳聚糖衍生物，接枝季铵盐R2的结构如下 其中R11、R21、R31各自分别表示氢或烷基基团，其中每个R都可单独分别是正常的或支链的，取代的或未取代的，正常的，支链的或环状的，含1个到35个碳原子长度的烷基基团；R41是间隔基团，包括饱和的烷烃、不饱和的烷烃、芳环、杂环、氧、硫、酰基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、亚磺酸基、亚磷酸基、亚硫酸基、胺基、以及它们的组合；当连接壳聚糖-CH2OH上时，n是1到35之间的整数；当连接壳聚糖NH2上时，n是0到35之间的整数；当n＝0时，壳聚糖的NH2基团直接季铵盐化；Y-是负电平衡离子。
本发明的壳聚糖衍生物，其中壳聚糖上R2胺的结构如下 其中R11、R21、各自分别表示氢或烷基基团，其中每个R都可单独分别是正常的或支链的，取代的或未取代的，正常的，支链的或环状的，含1个到35个碳原子长度的烷基基团；R31是间隔基团，包括饱和的烷烃、不饱和的烷烃、芳环、杂环、氧、硫、酰基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、亚磺酸基、亚磷酸基、
亚硫酸基、胺基、以及它们的组合；n是1到35之间的整数。
本发明的壳聚糖衍生物，其中壳聚糖上R2胺或季铵盐的结构也可以是氮杂环组成的胺或铵盐，结构如下-R21-R22其中R21是连接基团；R22是氮杂环胺或铵盐，包括吡咯、吲哚、咔唑、吡啶、喹啉、哌啶、咪唑、吡唑、嘧啶、吡嗪、吩嗪、吖啶，以及它们的衍生物，以及它们的铵盐。
本发明壳聚糖衍生物，接枝羧酸或磷酸或磺酸基团R3的结构如下 其中R是羧酸、磺酸或磷酸、或它们的盐；R11是是间隔基团，包括饱和的烷烃、不饱和的烷烃、芳环、杂环、氧、硫、酰基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、亚磺酸基、亚磷酸基、亚硫酸基、胺基、以及它们的组合；n是是1到35之间的整数。
本发明的壳聚糖衍生物，其游离的氨基也可使用二醛类化合物形成部分交联，交联度控制在0至5％的取代度。
本发明的壳聚糖衍生物，其中壳聚糖的脱乙酰度[(n1+n3+n4+n5)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在70％到100％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其中接枝脂肪酶抑制剂(n3)单元的取代度[(n3)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0.1％到20％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其中接枝季铵盐或胺类基团(n3)单元的取代度[(n4)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0到25％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其中接枝接枝羧酸或磷酸或磺酸的基团(n3)单元的取代度[(n5)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0到20％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其壳聚糖的分子量范围在1万到500万之间。
本发明的壳聚糖衍生物，n3、n4、n5的单元内R1、R2、R3即可以同时连接到壳聚糖的-CH2OH和-NH2上，也可以分别连接到-CH2OH或-NH2上。
本发明的壳聚糖衍生物，还包括其异构体、盐、水合物、溶剂化物和前药衍生物。
本发明的壳聚糖衍生物，至少连接一个脂肪酶抑制剂。
本发明的壳聚糖衍生物，是脂肪结合衍生物。
本发明的壳聚糖衍生物，可用于治疗哺乳动物的肥胖症。
本发明的壳聚糖衍生物，可用于治疗哺乳动物高甘油三酯症。
本发明的壳聚糖衍生物，可用于治疗哺乳动物中至少一种因摄入脂肪的不必要吸收所导致的疾病或者用于有效降低摄入脂肪的哺乳动物的吸收热量的方法。
本发明的壳聚糖衍生物，在用于治疗肥胖症的同时，还可以避免出现脂肪便或油性便。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含至少一种药学可接受的载体和赋形剂，以及对于限制或防止某些摄入脂肪吸收为治疗有效量的至少一种本发明的壳聚糖衍生物。
本发明的新型壳聚糖衍生物可以通过适当的途径服用，包括但并不限制于胶囊、片、分散片、咀嚼片或溶液口服。与食物混合口服或饭后即服是较好的服用方法。
本发明壳聚糖的脱乙酰度[(n1+n3+n4+n5)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在70％到100％之间，优化为大于90％。
本发明的壳聚糖衍生物，其中接枝脂肪酶抑制剂(n3)单元的取代度[(n3)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0.1％到20％之间，优化为3％到15％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其中接枝季铵盐或胺类基团(n3)单元的取代度[(n4)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0到40％之间，优化为0％到25％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其中接枝接枝羧酸或磷酸或磺酸的基团(n3)单元的取代度[(n5)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0到20％之间，优化为0到15％之间。
本发明的壳聚糖衍生物，其壳聚糖的分子量范围在1万到500万之间，优化为20万到150万之间。
本发明的壳聚糖衍生物，n3、n4、n5的单元内R1、R2、R3即可以同时连接到壳聚糖的-CH2OH和-NH2上，也可以分别连接到-CH2OH或-NH2上。为了药学上的方便，尽可能控制连接在-NH2或-CH2OH基团上。
本发明的壳聚糖衍生物，至少连接一个脂肪酶抑制剂。
在另一个优选的方面中，本发明的壳聚糖衍生物所有的衍生基团全部采用共价键连接，使得脂肪酶抑制剂不被消化系统吸收。
本发明的脂肪酶抑制剂基团的结构 其中X是硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO1H-、氨基酸或它们的衍生物；Y是是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；R21各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；m、p、r各自分别是0到35之间的整数。
优选为r、p、r在5到20之间的整数。
本发明的另一个脂肪酶抑制剂的结构 其中R是H、-(CH2)n-NR21R31、-(CH2)n-CO2H、-(CH2)n-OCOR21、-(CH2)n-NHCO21、取代的或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳族基团；
X是硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-、氨基酸或它们的衍生物；R21和R31各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；m、p各自分别是0到35之间的整数。
优化为m、p为1到25之间的整数；R优化为烷烃-(CH2)n-CH3，n在5到25之间的整数。
本发明的另一个脂肪酶抑制剂，结构为 其中R是H、-(CH2)n-NR21R31、-(CH2)n-CO2H、-(CH2)n-OCOR21、-(CH2)n-NHCOR21、取代的或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳族基团；X是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR2、-CONR2-、-PO4H-或间隔基团；Y是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；R21和R31各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；n、m、p各自分别是0到35之间的整数；优化为m、p优化为1到20之间的整数。
本发明也可以是交联的壳聚糖衍生物，适当的交联度可以更加牢固地结合脂肪。交联度控制在0-5％的取代度，优化为0-2.5％的取代度之间。
本发明为了提高壳聚糖与脂肪的结合能力，使用酰化的酸或季铵盐衍生壳聚糖，无论单独衍生还是混合衍生，都能够增加壳聚糖与脂肪的结合能力。
本发明为了提高壳聚糖与脂肪的结合能力，除了增加了离子区(酰化的酸或季铵盐)以外，长链的脂肪酶抑制剂、长链的酸或长链的季铵盐都分别可以作为疏水区以增加与脂肪的结合能力。
本发明中与季铵盐平衡的负电离子，是药学上可以接受的酸根。包括并不限制于Cl-、Br-、磷酸根、醋酸根、硫酸根、亚硫酸根、乳酸根、丙酸根、马来酸根、枸橼酸根、琥珀酸根、氨基酸根、核苷酸根、抗坏血酸根、肉桂酸根、柠檬酸根、水扬酸根、酒石酸根、富马酸根和叶酸根等。
本发明中与酸结合盐，是药学上可以接受的盐，包括并不限制于无机盐或有机盐，例如钠、钾、铵、锂、镁、铁、锰、铝、钙、有机铵、哌啶、嘌呤等。
化合物的制备本发明所描述的壳聚糖衍生物的合成方法，可以通过本领域中通常已知的方法制备。一般性的方法可以参阅March J.Advanced OrganicChemistry.3rded.New YorkWiley，1985。
本发明中脂肪酶抑制剂的合成方法参考了并不限制于如下文献1)A.Pommier，J.Pons，Synthesis，1997(July)729-744；2)I.Fleming.N.J.Lawrence，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，19982679-2686；3)P.J.Parsons，J.K.Cowell，Synlett，2000，No1，107-109；4)USP4,189,438。
针对本发明的化合物的制备，以下的合成路线不起界定作用，仅仅描述了相对优选的方案。以下的合成路线图中壳聚糖的取代位置是示意图，衍生物的取代位置可以在同一个壳聚糖单元中的氨基和羟基上，也可以在不同壳聚糖单元中的氨基和羟基上。壳聚糖衍生物单元之间相互连接是随机的。
实施例1化合物I的制备化合物I的制备路线 (合成路线图中省略了未脱乙酰部分的结构)化合物I制备方法(1)对羧甲基苯甲醛与(-)-THE的酯化对羧甲基苯甲醛75g溶于1.5L的四氢呋喃中(THF)，搅拌下加入1摩尔的HBTU，搅拌15分钟后，慢慢加入177g(-)-THE(全称为(2S，3S，5S)-3，5-二羟基-2-己基-十六烷酸1，3-内酯)，用DIEA调节pH8.5，然后在室温下搅拌反应过夜。反应完毕后过滤，滤饼用正己烷洗涤，再用乙醇/水(3∶1)洗涤，真空干燥得到化合物(1)219g。
(2)脱乙酰甲壳素(壳聚糖)与化合物(1)偶联100g脱乙酰甲壳素(脱乙酰化率95％)溶于4L1％的醋酸溶液中，加入上述的化合物(1)21g，室温搅拌1小时。用0.1M NaOH调pH4.5，继续反应1.5小时。慢慢滴加NaBH1溶液(由2g NaBH1与5ml水配成)，加毕后，搅拌反应2小时。然后用稀NaOH调pH为中性，产物被沉淀，过滤，分别用乙醇和水洗涤数次，干燥到产物(2)120g。测定产物的取代度为6.8％。
(3)化合物(2)的季铵盐化100g化合物(3)溶于4L1.5％的醋酸溶液中，室温搅拌4小时，然后加入20ml 1.5M NaOH溶液，加入42g碘甲烷，22g碘化钠(配成水溶液后加入)，在室温条件在缓慢搅拌12小时。用五倍的无水乙醇沉淀出粗产物，得到化合物(3)。
将化合物(2)溶于水后，通过离子交换树脂(Amberlite IR Cl-)交换转化为化合物(I)，经无水乙醇洗涤干燥后得到化合物(I)122.6g。经测定N，N，N-三甲基胺的取代度9.2％。
实施例2化合物II的制备化合物II的制备路线 (合成路线图中省略了未脱乙酰部分的结构)化合物II的制备方法(1)对羧甲.基苯甲醛与THLO的酯化对羧甲基苯甲醛75g溶于1.5L的THF中，搅拌下加入1摩尔的HBTU，搅拌15分钟后，慢慢加入256g THLO(全称为(2S，3S，5S)-5-[(S)-2-甲酰胺基-4-甲基-戊酰氧基]-2-己酸-3-羟基-十六烷酸1，3内酯)，用DIEA调节pH8.5，然后在室温下搅拌过夜。反应完毕后过滤，滤饼用正己烷洗涤，再用乙醇/水(3∶1)洗涤，真空干燥得到化合物(4)314g。
(2)壳聚糖与化合物(4)的偶联100g壳聚糖(脱乙酰度95％)溶于4L1％的醋酸溶液中，加入上述化合物(4)17g，室温搅拌1小时。用0.1M NaOH调pH4.5，继续反应1.5小时。慢慢滴加NaBH4溶液(由2g NaBH4与5ml水配成)，加毕后，搅拌反应2小时。然后用稀NaOH调pH为中性，产物被沉淀，过滤，分别用乙醇和水洗涤数次，干燥到产物(2)169g。测定产物的取代度为3.9％。
(3)化合物(5)的羧酸化100g化合物(5)溶于4L1％的醋酸溶液中，加入对羧甲基苯甲醛2.8g，室温搅拌1小时。用0.1M NaOH调pH4.5，继续反应1.5小时。慢慢滴加NaBH4溶液(由0.85g NaBH1与2ml水配成)，加毕后，搅拌反应2小时。然后用稀NaOH调pH为中性，产物被沉淀，过滤，分别用乙醇和水洗涤数次，干燥到化合物(II)102g。测定产物的羧基取代度为3.1％。
实施例3化合物III的制备化合物III的制备路线 (合成路线图中省略了未脱乙酰部分的结构)化合物III的制备方法100g化合物(2)溶于4L的四氢呋喃中(THF)，搅拌下加入0.1摩尔的HBTU，搅拌15分钟后，慢慢加入(5-羧基戊基)三甲基氯化铵13g，用DIEA调节pH8.5，然后在室温下搅拌反应过夜。反应完毕后过滤，滤饼用正己烷洗涤，再用乙醇/水(3∶1)洗涤，真空干燥得到化合物(III)111g。测定产物的铵盐取代度为9.5％.
实施例4化合物IV的制备化合物IV的制备路线 (合成路线图中省略了未脱乙酰部分的结构)化合物IV的制备方法对羧甲基苯甲醛75g溶于2L的THF中，搅拌下加入1摩尔的HBTU，搅拌15分钟后，慢慢加入(5-羟基戊基)三甲基氯化铵100g，用DIEA调节pH8.5，然后在室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，减压蒸干溶剂，固体物质用正己烷洗涤，真空干燥得到化合物(6)159g。
100g化合物(2)溶于4L1.5％的醋酸溶液中，室温搅拌4小时，加入上述化合物(6)12g，室温搅拌2小时。用0.1M NaOH调pH4.5，继续反应2小时。其后，慢慢滴加NaBH4溶液(由2g NaBH1与5ml水配成)，加毕后，搅拌反应2小时。然后用稀NaOH调pH为中性，产物被沉淀，过滤，分别用乙醇和水洗涤数次，干燥到产物(IV)110g。测定产物的取代度为5.3％。
实施例5化合物V的制备化合物V的制备路线 (合成路线图中省略了未脱乙酰部分的结构)化合物V的制备方法壳聚糖(95％脱乙酰度，粘均分子量55万)100g，加入2L的含10g缩水甘油三甲基氯化铵的异丙醇溶液中，快速搅拌，恒温70℃反应6小时。完毕后用85％的丙酮洗涤数次，抽滤，真空干燥后得到化合物(7)109g。经测试其缩水甘油三甲基氯化铵的取代度为9％。
取化合物(7)100g溶于4L0.5％的醋酸溶液中，加入化合物(1)20g，室温搅拌1小时。用0.1M NaOH调pH4.5，继续反应1.5小时。慢慢滴加NaBH4溶液(由2g NaBH4与5ml水配成)，加毕后，搅拌反应2小时。然后用稀NaOH调pH为中性，产物被沉淀，过滤，分别用乙醇和水洗涤数次，干燥到产物(V)121g。测定产物的取代度为7.1％。
实施例6化合物VI的制备化合物VI的制备路线 (合成路线图中省略了未脱乙酰和壳聚糖原始单元部分的结构)化合物VI的制备方法
100g化合物I溶于3L0.1％醋酸THF溶液中，搅拌下加入0.1摩尔的HBTU，搅拌15分钟，慢慢加入慢慢加入(5-羧基戊基)三甲基氯化铵7.5g，用DIEA调节pH8.5，然后在室温下搅拌反应过夜。反应完毕后过滤，滤饼用正己烷洗涤，再用乙醇/水(3∶1)洗涤，真空干燥得到化合物(VI)108g。测定产物的(5-羧基戊基)三甲基氯化铵的取代度为6.2％。
实施例7化合物VII的制备化合物VII的衍生结构同化合物V，增加了缩水甘油三甲基氯化铵投料，将缩水甘油三甲基氯化铵的取代度变成12.2％。
实施例8化合物VIII的制备化合物VIII的衍生结构同化合物V，增加了缩水甘油三甲基氯化铵投料，将缩水甘油三甲基氯化铵的取代度变成6.3％。
实施例9化合物IX的制备化合物IX的衍生结构同化合物IV，增加了(5-羟基戊基)三甲基氯化铵的投料，将(5-羟基戊基)三甲基氯化铵的取代度变成12％。
实施例10化合物X的制备化合物X的衍生结构同化合物IV，增加了(5-羟基戊基)三甲基氯化铵的投料，将(5-羟基戊基)三甲基氯化铵的取代度变成3.4％。
本发明化合物的生物功能的测试方法与结果实施例11体外胰脂肪酶抑制活性的测试胰脂肪酶活性的测试方法参见中国药典2000版二部737页。
胰脂肪酶标准溶液的制备取胰脂肪酶标准品(SIGMA货号800)， 加冷至5℃以下的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中(取三羟甲基氨基甲烷606mg，加0.1mol/L盐酸溶液45.7ml，加水至100ml，摇匀，调节pH值至7.1)少量，研磨均匀，置50ml量瓶中，加上述缓冲溶液至刻度，摇匀。每1ml含胰脂肪酶16活力单位左右。
标定胰脂肪酶标准溶液的活性量取橄榄油(购自中国药品生物制品检定所)乳液(取橄榄油4ml与阿拉伯胶7.5g，研磨均匀，缓缓加水使成100ml，用高速组织捣碎机以每分钟8000转搅拌两次，每次3分钟，取乳液在显微镜下检查，90％乳粒的直径应在3μm以下，并不得有超过10μm的乳粒)25ml、8％牛胆盐溶液2ml与水10ml，置100ml烧杯中，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)调解pH值至9.0，在37℃±0.1℃水浴中保温10分钟，再调节pH值至9.0，精密量取胰脂肪酶标准溶液1ml，在37℃±0.1℃水浴中准确反应10分钟，同时用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定使反应液的pH值恒定在9.0，记录消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的量(ml)。另取在水浴中煮沸15-30分钟的上述标准溶液1ml，照上述方法测定作空白溶液对照，按下式计算。 式中 A为供试品消耗氢氧化钠滴定液的容积，ml；B为空白消耗氢氧化钠滴定液的容积，ml；M为氢氧化钠滴定液的浓度，mol/L；n为供试品稀释倍数(50)。
在上述条件下，每分钟水解脂肪(橄榄油)生成1μmol脂肪酸的酶量，为1活力单位。
本发明化合物的胰脂肪酶半抑制浓度的测定(IC50)本发明化合物的测定浓度以脂肪酶抑制剂取代度折算为为摩尔浓度(μmol)，将本发明化合物按上述方法制成胰脂肪酶混合溶液，测定其半抑制浓度。
测定的结果如下化合物 胰脂肪酶半抑制浓度(μmol)I 121II 168III 110IV 122V 98VI 87VII 90VIII102IX 101X 129实施例12体外脂肪结合能力的测试将定量的本发明化合物溶解在0.5％的醋酸溶液中，预冷到4-8℃加入橄榄油，用超声波充分混合后，4-8℃放置12小时，倾倒出未被化合物结合的水与橄揽油。然后在4-8℃，500G的条件下离心30分钟，倾倒出未被化合物结合的水与橄揽油。在20℃，小与0.10Torr的条件下真空干燥12小时。称重，计算出化合物与橄榄油的结合量。
结果如下化合物V、VII和VIII每克结合橄榄油分别为14、19和10克。
尽管本发明已经描述具体的实施例，但本领域的技术人员，在不背离本发明精神和所附权利要求书所限定的本发明范围的情况下，可以作形式上和细节上的多种变化。本领域中的技术人员可以认知或仅使用常规试验能确定本发明描述的具体实施的许多等同物，这些等同物都包括在本发明的范围内。
权利要求
1.壳聚糖衍生物，其特征在于由如下的单元结构组成 其中R1是脂肪酶抑制剂；R2是胺，或是季铵盐或与胺连接的季铵盐基团，或氮杂环胺及其铵盐；R3是羧酸或磷酸或磺酸；(R1)、(R2)(R3)分别是R1、R2、R3连接到壳聚糖-CH2OH上的结构；n1为壳聚糖分子链中的基本单元数；n2为壳聚糖分子中未脱乙酰的部分的单元数；n3为壳聚糖接枝脂肪酶抑制剂的单元数；n4为壳聚糖接枝季铵盐化合物的单元数；n5为壳聚糖接枝羧酸或磷酸或磺酸的单元数；
2.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中的脂肪酶抑制剂R1的结构如下 其中R是H、-(CH2)n-NR21R31、-(CH2)n-CO2H、-(CH2)n-OCOR21、-(CH2)n-NHCOR21、取代的或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳族基团；X是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；Y是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；R21和R31各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；n、m、p各自分别是0到35之间的整数；
3.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中的脂肪酶抑制剂R1的结构也可以如下 其中R是H、-(CH2)n-NR21R31、-(CH2)n-CO2H、-(CH2)n-OCOR21、-(CH2)n-NHCOR21、取代的或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳族基团；X是硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-、氨基酸或它们的衍生物；R21和R31各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；m、p各自分别是0到35之间的整数。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中的脂肪酶抑制剂R1的结构还可以如下 其中X是硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-、氨基酸或它们的衍生物；Y是是亚烷基、硫、氧、-SO2-、-CO2-、NR21-、-CONR21-、-PO4H-或间隔基团；R21各自分别是氢、取代的或未取代的脂肪族基团、或取代的或未取代的芳族基团；m、p、r各自分别是0到35之间的整数。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中壳聚糖上R2胺的结构如下 其中R11、R21、各自分别表示氢或烷基基团，其中每个R都可单独分别是正常的或支链的，取代的或未取代的，正常的，支链的或环状的，含1个到35个碳原子长度的烷基基团；R31是间隔基团，包括饱和的烷烃、不饱和的烷烃、芳环、杂环、氧、硫、酰基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、亚磺酸基、亚磷酸基、亚硫酸基、胺基、以及它们的组合；n是1到35之间的整数。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中壳聚糖上R2季铵盐的结构如下 其中R11、R21、R31各自分别表示氢或烷基基团，其中每个R都可单独分别是正常的或支链的，取代的或未取代的，正常的，支链的或环状的，含1个到35个碳原子长度的烷基基团；R41是间隔基团，包括饱和的烷烃、不饱和的烷烃、芳环、杂环、氧、硫、酰基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、亚磺酸基、亚磷酸基、亚硫酸基、胺基、以及它们的组合；当连接壳聚糖-CH2OH上时，n是1到35之间的整数；当连接壳聚糖NH2上时，n是0到35之间的整数；当n＝0时，壳聚糖的NH2基团直接季铵盐化；Y-是负电平衡离子。
7.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中壳聚糖上R2胺或季铵盐的结构也可以是氮杂环组成的胺或铵盐，结构如下-R21-R22其中R21是连接基团；R22是氮杂环胺或铵盐，包括吡咯、吲哚、咔唑、吡啶、喹啉、哌啶、咪唑、吡唑、嘧啶、吡嗪、吩嗪、吖啶，以及它们的衍生物，以及它们的铵盐。
8.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中壳聚糖接枝羧酸或磷酸或磺酸基团R3的结构如下 其中R是羧酸、磺酸或磷酸、或它们的盐；R11是间隔基团，包括饱和的烷烃、不饱和的烷烃、芳环、杂环、氧、硫、酰基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、亚磺酸基、亚磷酸基、亚硫酸基、胺基、以及它们的组合；n是是1到35之间的整数。
9.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其游离的氨基也可使用二醛类化合物形成部分交联，交联度控制在0至5％的取代度。
10.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中壳聚糖的脱乙酰度[(n1+n3+n4+n5)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在70％到100％之间。
11.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中接枝脂肪酶抑制剂(n3)单元的取代度[(n3)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0.1％到20％之间。
12.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中接枝季铵盐或胺类基团(n3)单元的取代度[(n4)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0到40％之间。
13.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其中接枝羧酸或磷酸或磺酸的基团(n3)单元的取代度[(n5)/(n1+n2+n3+n4+n5)]×100％在0到20％之间。
14.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其壳聚糖的分子量范围在1万到500万之间。
15.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于n3、n4、n5的单元内R1、R2、R3既可以同时连接到壳聚糖的-CH2OH和-NH2上，也可以分别连接到壳聚糖的-CH2OH或-NH2上。
16.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，还包括其异构体、盐、水合物、溶剂化物和前药衍生物。
17.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于至少连接一个脂肪酶抑制剂。
18.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于所述的壳聚糖衍生物是脂肪结合衍生物。
19.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物及其中间体的制备方法。
20.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，可用于治疗哺乳动物的肥胖症。
21.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，可用于治疗哺乳动物高甘油三酯症。
22.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，可用于治疗哺乳动物中至少一种因摄入脂肪的不必要吸收所导致的疾病或者用于有效降低摄入脂肪的哺乳动物的吸收热量的方法。
23.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，在用于治疗肥胖症的同时，还可以避免出现脂肪便或油性便。
24.一种药物组合物，其中包含至少一种药学可接受的载体和赋形剂，以及对于限制或防止某些摄入脂肪吸收为治疗目的的至少一种如权利要求1所述的壳聚糖衍生物。
全文摘要
本发明涉及将脂肪酶抑制剂、铵盐或羧酸按一定比例要求衍生到壳聚糖上，生产出一类新型壳聚糖衍生物。该壳聚糖衍生物用于治疗肥胖、高血脂并防止油性便的产生。
文档编号A61K31/722GK1443540SQ0210406
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月8日 优先权日2002年3月8日
发明者项炜 申请人:北京正青星光生物医学科技有限公司