专利名称：碘化－3，3＇－二乙基－9－甲基－硫杂羰花青的抗肿瘤新用途的制作方法
专利说明碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青的抗肿瘤新用途 本发明涉及一种碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青的抗肿瘤作用的新用途。肿瘤是当前对人类健康和生活素质、家庭幸福危害最大的一类疾病。抗肿瘤药物的开发一直是科学家们研究的热门课题。尽管目前临床上用于治肿瘤的药物有200～300种，但大多数药物选择性不高，在杀灭肿瘤细胞的同时对正常细胞亦有损伤作用，引起毒副反应。DNA引物酶是合成DNA引物和启动DNA合成的关键酶。由于在肿瘤细胞中DNA引物酶的含量远比正常细胞高。寻找基于对DNA引物酶具有抑制作用的抗肿瘤药物，是发展高效低毒副作用抗肿瘤药物的新途径。目前，临床上使用众多的抗肿瘤药物中尚未有以DNA引物酶为靶点的抗肿瘤药物，只要找出一种DNA引物酶抑制剂在临床上有抗肿瘤作用，基于其作用靶点与其他抗肿瘤药物的作用靶点不同，它就是一种新类型的抗肿瘤药物。本发明以肿瘤细胞的DNA引物酶为特异性靶点筛选了一系列化合物，发现碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青(简称碘化青，3，3’-Diethyl-9-methylthiacarbocyanine iodide，DMTCCI)在纳摩尔浓度(nmol/L)水平对DNA引物酶有强力的抑制作用。随后研究证明碘花青对多种人癌细胞株有强烈的细胞毒作用，对动物瘤株及人癌细胞裸鼠移植瘤模型有强烈的抗瘤作用。
本发明提供一种使用
图1所示的碘花青(DMTCCI)或与它的药学结合物制剂用于治疗恶性肿瘤的药物。 图1DMTCCI的化学结构式本发明通过肿瘤细胞DNA引物酶体外试验表明，碘花青对DNA引物酶具有强烈的抑制作用。
本发明通过人癌细胞株体外试验表明，碘花青对肝癌、鼻咽癌、白血病、宫颈癌、喉癌5类12株人癌细胞具有强烈的细胞毒作用。
本发明通过动物瘤株试验碘花青(DMTCCI)对艾氏腹水癌EAC、肉瘤S180和肝癌Hep-S具有强烈的抗瘤作用。
本发明通过人癌细胞裸鼠移植瘤模型体内试验，证明碘花青对鼻咽癌CNE2及肝癌Bel-7402瘤株有强烈的抗瘤作用。
本发明通过小鼠单次腹腔注射，观察2周，测得LD50为3.64mg/kg(3.25～4.03mg/kg)。
本发明通过动物实验，确定碘花青在动物的剂量范围是0.5mg/kg-1.0mg/kg/l次/每2天。
根据本发明，上述图1所示化合物和其可接受的溶剂组合可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂的形式使用，其给药途径可经静脉、肌肉、口服、腔内或皮肤给药。
以下通过实施例对本发明做进一步说明碘花青溶剂的配成用分析天平称取5mg碘花青，加入100％DMSO 10μl，然后逐步加入纯蒸馏水977.23μl稀释碘花青至10mmol/L原液，保存于-20℃。
碘花青对DNA引物酶活性的抑制作用方法按我们过去建立的方法，提取小鼠艾氏腹水癌(EAC)细胞的DNA引物酶存放于冰箱中备用。酶活性抑制试验每一测定管反应液为30μl，含有50mmol/L Tris-HCl，PH7.2，0.1％PEG1000，0.1mg/mlBSA，3mmol/L DTT，6mmol/L MgCl2，33μg/ml Poly(dT)，2mmol/LATP，0.25μmol/L3H-dATP，10％甘油，3μl酶液。对照管加入0.1％DMSO溶液作对照，其他各管加入不同浓度的碘花青，使其终浓度分别为18.5nmol/L、37.0nmol/L、111nmol/L、333nmol/L、1000nmol/L，每一浓度设3个平行管。向各管加入3μl酶液，37℃保温30min，加入EDTA溶液至终浓度为10mmol/L，终止反应。将各管酶反应液移至乙酸纤维菌膜上，室温晾干，用5％三氯醋酸漂洗3min×2次，95℃乙醇漂洗2min×2次，室温晾干后放入含有4ml闪烁液的测定瓶中，在BECKMAN LS6500液体闪烁计数仪中测定CPM读数。计出平均值，按下式算出抑制率，采用中效原理的方法计算IC50值。
抑制率＝(1-实验组平均CPM数/对照组平均CPM数)×100％结果表1 碘花青对引物酶的抑制作用药物浓度(nmol/L)18.537.0111 333 1000抑制率(％)24.9±2.0 31.4±5.0 38.5±3.8 52.5±6.4 80.4±2.9碘花青对人肝癌细胞的抑制作用方法MTT法分别取对数生长期人肝癌细胞株Bel-7402、HepG2、Hep3B和SMMC，各以2×104/孔细胞接种于96孔板上，分别加入不同浓度的DMTCCI，设0.1％DMSO对照组培养72h，结束前4h每孔加入5mg/ml MTT 10μl，培养结束时离心并小心吸去上清液，加入200μ1 DMSO并轻微振荡，使生成的甲臢完全溶解显色后，用Bio-Rad Model 550 Microplate Reader以570nm波长测OD值。实验共进行3次，算出平均值。按下式计算抑制率抑制率(％)＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。用Bliss软件计算细胞生长抑制率达50％的DMTCCI的浓度，以IC50表示。结果表2-1.碘花青对人肝癌细胞Bel-7402、Hep3B、SMMC的抑制作用药物浓度(μmol/L)及其抑制率(％)细胞株0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20Bel-740216.9±1.2 27.7±1.8 38.5±1.4 49.2±2.0 67.7±1.6 81.5±2.5 87.7±2.2Hep3B- 1.3±1.519.2±1.3 25.6±1.9 34.6±1.2 57.7±1.7 -SMMC - 36.6±1.7 46.7±1.8 48.9±1.8 49.2±2.1 52.2±2.5 -表2-2.碘花青对人肝癌细胞HepG2的抑制作用药物浓度(μmol/L)及其抑制率(％)细胞株1.5625 3.1256.25 12.5 25HepG233.8±2.145.9±1.362.2±2.670.3±1.074.5±3.1碘花青对人鼻咽癌细胞的抑制作用方法MTT法结果表3-1.碘花青对人鼻咽癌细胞HNE1、CNE1、CNE2的抑制作用药物浓度(μmol/L)及其抑制率(％)细胞株0.78125 1.5625 3.1256.25 12.5 25HNE117.0±2.120.0±1.826.0±1.345.0±1.279.0±1.986.0±2.4CNE122.4±1.027.1±1.728.9±1.446.3±1.884.1±1.586.9±2.5CNE239.4±1.943.6±2.858.5±2.272.3±1.276.6±1.583.0±1.4表3-2.碘花青对人鼻咽癌细胞HK的抑制作用药物浓度(μmol/L)及其抑制率(％)细胞株0.6251.25 2.5 510HK13.8±1.620.7±2.829.3±1.3 39.7±1.162.1±1.7碘花青对人白血病细胞的抑制作用方法MTT法结果表4-1.碘花青对人白血病细胞HL-60的抑制作用药物浓度(μmol/L)及抑制率(％)细胞株0.0625 0.1250.25 0.5 12HL-6024.6±1.238.5±1.849.2±1.175.4±1.481.5±1.886.2±1.5表4-2.碘花青对人白血病细胞K562的抑制作用药物浓度(μmol/L)及抑制率(％)细胞株0.6251.25 2.5 510K56237.0±1.243.2±1.145.7±0.964.2±1.070.4±0.8碘花青对人宫颈癌细胞HeLa的抑制作用方法MTT法结果表5.碘花青对人宫颈癌细胞HeLa的抑制作用药物浓度(μmol/L)及抑制率(％)细胞株0.5 3 10 15 20 30宫颈癌细胞HeLa25.4±2.1 47.6±1.7 65.1±1.8 71.4±1.073.0±1.9 82.5±2.9碘花青对人喉癌细胞Hep-2的抑制作用方法MTT法结果表6.碘花青对人喉癌细胞Hep-2的抑制作用药物浓度(μmol/L)及抑制率(％)细胞株0.15625 0.3125 0.6251.25 2.5 5喉癌细胞Hep-229.3±1.839 6±1.553.7±2.060.3±1.376.2±1.284.1±2.2碘花青对三种动物瘤株的抗瘤作用方法在无菌条件下分别抽取生长7天的艾氏腹水癌(EAC)、小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌Hep-S瘤株，加1倍生理盐水稀释后混匀，接种于昆明种小白鼠右腋皮下，0.2ml/只，随机分为生理盐水对照组、环磷酰胺阳性对照组(25mg/kg)、0.1％DMSO溶剂对照组以及不同剂量的DMTCCI组。每组10只，接种后24h经腹腔注射给药，每2天1次，共10天。实验重复两次。统计分析数据均以x±s表示，采用t检验处理，P＜0.05认为有显著性差异。结果表7.碘花青对动物瘤株EAC的抗瘤作用药物剂量(mg/kg)及抑制率(％)动物瘤株0.64 0.81.0EAC 46.1 55.8 62.3P＜0.01表8.碘花青对动物瘤株S180和Hep-S的抗瘤作用药物剂量(mg/kg)及抑制率(％)动物瘤株0.40.71.0S180 26.0*44.5 62.3Hep-S 31.3*52.5 61.9*P＜0.05，其余P＜0.01碘花青对人癌细胞裸鼠移植瘤的抗瘤作用方法分别收集人肝癌细胞株Bel-7402和人鼻咽癌细胞株CNE2，制成1×107/ml细胞浓度悬液。取0.5ml接种于裸小鼠腋窝皮下。待肿瘤长至约10mm3大小时，随机分成5组，每组8只，每组分别腹腔注射给药如下生理盐水对照组、环磷酰胺阳性对照组(25mg/kg)、0.1％DMSO溶剂对照组以及不同剂量的DMTCCI组低剂量0.5mg/kg组和高剂量1.0mg/kg组。每2天给药1次，共28天。实验过程中每4天称鼠重1次，以调整给药总量，用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，按以下公式算出肿瘤相对体积体积(V)＝1/2ab2，以肿瘤相对体积绘制肿瘤生长曲线。同时记录裸小鼠的毒性及耐受性。实验结束(至阴性对照组肿瘤约大于1g时)时处死裸小鼠，测量裸小鼠体重和肿瘤长径和短径，剥离肿瘤称瘤重，按以下公式计算各组的抑瘤率抑瘤率(％)＝(1-用药组平均瘤重/溶剂阴性对照组平均瘤重)×100％。统计分析平均瘤重以x±s表示，采用t检验处理，P＜0.05认为有显著性差异。结果表9.碘花青对人癌细胞裸鼠移植瘤的抗瘤作用药物剂量(mg/kg)及抑制率(％)瘤株0.5 1.0人肝癌细胞Bel-740252.2 80.3人鼻咽癌细胞CNE2 64.5 77.6P值均＜0.0权利要求
1.一种碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青的抗肿瘤新用途，其特征在于碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青用于抗肿瘤使用的新用途。
2.根据权利要求书1所述的碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青的抗肿瘤新用途，其特征在于碘化-3，3’-二乙基-9-甲基-硫杂羰花青的药学结合物制剂用于抗肿瘤作用的新用途。
全文摘要
本发明涉及一种碘化－3，3’－二乙基－9－甲基－硫杂羰花青的抗肿瘤新用途。其特征为该药物或与它的药学结合物制剂用于抗肿瘤作用的新用途。本发明对肿瘤细胞的DNA引物酶具有强烈的抑制作用。对人肝癌细胞株Bel－7402，HepG2，Hep3B和SMMC，人鼻咽癌细胞株HNE1，CNE1，CNE2和HK，人白血病细胞株HL－60和K562，人宫颈癌细胞株Hela以及人喉癌细胞株Hep－25类12株人癌细胞具有很强的细胞毒作用。对动物癌株EAC，S180和Hep－S，对人癌细胞株裸鼠移植瘤模型CNE2和Bel－7402有强力的抑制作用。
文档编号A61P35/00GK1390544SQ0213426
公开日2003年1月15日 申请日期2002年6月28日 优先权日2002年6月28日
发明者刘宗潮, 李志铭, 朱孝峰, 管忠震, 谢冰芬, 冯公侃, 周军民 申请人:中山大学肿瘤防治中心