专利名称：制备不饱和脂族羟基酸及其酯的方法、在药物和/或化妆品组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学方法领域以及通过该化学方法得到的产物的应用。
更具体而言，本发明涉及制备以下通式(Id)之不饱和羟基脂肪酸及其酯的方法 其中n＝1-4，m＝2-16，R1＝OH、Cl、Br、OR3，其中R3代表具有1-16个碳原子的直链或支链烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它们任选被一个或者多个碳、氮、硫或卤原子取代，所述卤原子例如是氟、氯、溴和碘，R2代表H、SiR′1R′2R′3，其中R′1、R′2、R′3相同或不同，并代表具有1-16个碳原子的直链或支链烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它们任选被一个或者多个碳、氮、硫或卤原子取代，所述卤原子例如是氟、氯、溴和碘，或者R2代表C-Ar3，其中Ar代表任选被一个或多个碳、氮、硫或卤原子取代的芳基，所述卤原子例如是氟、氯、溴和碘，或者R2代表以下式的四氢吡喃基
本发明还涉及所述产物在药物和/或化妆品组合物中作为抗胶原酶活性剂、解脂活性剂或抗痤疮剂的应用。
背景技术：
通式(Id)的化合物是已知的并且在文献中已描述了其生物性质、特别是其化妆和药物性质。此外，构成蜜蜂之蜂皇浆脂质的主要成分是羟基-10-癸烯-2(反式)油酸(或DHA)，相应于其中R1＝OH、R2＝H、n＝1且m＝3的通式(Id)化合物。
现有技术中的许多文献报道了制备不饱和羟基脂肪酸及其酯的方法(Lee等人，1993，J.Org.Chem.，vol.58，p.2918-2919；Hurd和Saunders，1952，J.Am.Chem.Soc.，vol.74，p.5324-528；Krishnamurthy等人，1989，Indian J.Chem.Sect.A，vol.28，p.288-291；Plettner等人，1995，J.Chem.Ecol.，vol.21，p.1017-1030)。目前现有技术中已知的方法具有一个氧化步骤，在此期间使用金属盐，例如铬或锰的盐。然而，金属盐的使用具有许多不便之处。一方面，在通过所述方法得到的产物的水平上，该产物被金属盐污染并由此在化妆品或药物中的应用受限于该污染。另一方面，金属盐的使用也给实施该合成的工业环境带来污染。
发明内容
因此，本发明的目的是解决上述问题，并提出一种新且具有创造性的合成方法，该方法能够运用到工业中。
另外，根据本发明的方法的特征在于，能够得到比现有技术中已知的方法更快的合成法，并具有更高的收率。实际上，根据本发明的方法在初始的步骤中避免了色谱纯制，而色谱纯制不是纯制用的工业方法。
合成的总路线如下所示 其中R1、R2、m和n与通式(Id)中的定义相同。
该合成法的第一步是溴化，该反应的起始化合物是式(II)的二醇。多种溴化的方法在本领域中是已知的，而且本领域技术人员可用于该步骤中。该溴化反应需要使用溶剂，该溶剂特别是甲苯、苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、环己烷、庚烷、石油醚等。该溴化步骤中使用的反应物可以是含水或不含水的HBr、Ph3P-Br2、四溴化碳-三苯基膦、氢溴酸。例如，可以如Geresh等人，Tetrahedron Asymmery，1998，vol.9，p.89-96所述，溴化反应的实验条件是使用含水的HBr。
第二步是在环状或非环状、无水或含水的叔胺N-氧化物以及DMSO存在下氧化形成式(IV)的醛。在反应结束时，通过简单的过滤除去叔胺的相应氢溴酸盐(bromydrate)。有利的方式是，第二步中使用的环状或非环状、无水或含水的叔胺N-氧化物选自于N-甲基吗啉氧化物、三甲胺氧化物或三乙胺氧化物或者它们的混合物。现有技术中还有用于合成通式IV的醛的其他方法。在此情况下，本发明方法的步骤2解决了现有技术中已知方法的缺陷。例如，可以提及在锰盐存在下氧化相应的环烯的反应(Lee等人，1993，J.Org.Chem.，vol.10，p.2918-2919)。因此，本发明方法的步骤2避免了金属盐的存在。Guindon等人于1984年的文章(J.Org.Chem.，vol.49，p.3912-3920)描述了由1，1-二甲氧基-8-甲氧基甲氧基-辛烷起始来合成8-羟基-辛醛。另外，合成8-羟基-辛醛的产率相对较低(36％)，而本发明步骤2的收率则得到很大的提高。现有技术中合成通式IV醛的其他已知方法是具有4个步骤以上的长合成法。
本发明方法的步骤3是一个Witting-Horner反应。该方法对于本领域技术人员是已知的(Modern Synthetic Reaction，第二版，Herbet O.House，Wittig Horner reaction，p.682-709)，而且现有技术中描述的所有实验条件都可用于本发明中。例如，Witting-Horner反应可在三乙基磷酰乙酸酯和碳酸钾存在下来实施。
本发明方法的步骤4是一个皂化步骤。在本发明的方法中没有使用任何特殊的实验条件。本领域技术人员可直接找到足以适用于该步骤的实验条件。
本发明方法的步骤5是一个特异性保护在步骤4中得到的通式Ib化合物的醇官能团的步骤。该反应是在酸催化剂存在下在烯醇醚中实施的。有利的方式是，该反应是在APTS(对甲苯磺酸)存在下在二氢吡喃中实施的。步骤5之后得到的通式Ic化合物通过简单的水洗以及在硫酸盐上干燥来纯制。本发明方法的步骤2和步骤5在现有技术没有描述。它们可以解决现有技术中的技术问题，同时增加了产率以及合成式I化合物的方法的快速性。
通过本发明方法的步骤5得到的式(Id)产物可进行最终的脱保护，以得到通式(Ie)的化合物。该脱保护的反应是在包含酸催化剂的甲醇溶液中实现的。所有的酸催化剂都可用于本发明中。有利的方式是，所用的酸催化剂是ATPS。
通过本发明方法的步骤5得到的式(Id)产物可用于甘油的酯化反应中。根据甘油的相对用量，可得到单酯(2个可能的异构体在1和2位上)、二酯(2个可能的异构体二酯1，1和1，2)以及三酯。在甘油的酯化步骤后，所得的化合物可在与上述式(Id)化合物的脱保护条件相同的实验条件下进行最终的脱保护。
通过本发明方法得到的产物例如可如上所述用于化妆品和/或药物领域中。另外，申请人所做的工作表明通过本发明的方法得到的产物在最终的脱保护后具有抗胶原酶活性。
胶原是人体和皮肤中最丰富并且是最重要的蛋白质。具体而言，该硬蛋白占皮肤蛋白的75％，并在皮肤中确保坚固性。成纤维细胞由氨基酸(羟基脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸)制造溶原胶分子，该溶原胶分子在维生素C存在时转化为胶原分子。为形成纤维网，胶原在不同的分子之间产生连接。
胶原的更新随着年龄而变化。使皮肤和内膜柔软并具有抵抗力的可溶性胶原在作为胶原酶的蛋白水解酶的作用下越来越快地分解，在皮肤水平上导致蛋白纤维结构的老化。另外，导致弹性丢失的不溶性胶原由于难以逆转的多重连接而发生硬化，并且与葡萄糖分子聚合(糖化(glycation)现象)。该连接使胶原更加耐受胶原酶的攻击，使得胶原纤维的硬度越来越大。该硬化现象是皮肤组织老化的特征，应尽可能早地治疗，这是因为其通过游离基增加了对成纤维细胞的破坏以及皮肤蛋白的变性。
胶原酶是一种在正常生理条件下很少表达的酶。其在衰老、特别是在女性绝经时的超表达导致绝大部分的皮肤纤维蛋白变性。
但是，在老化的情况下，胶原纤维的破坏有可能突然增加。事实上，在被细菌感染时，细菌的胶原酶有可能破坏被感染宿主的胶原纤维。
另外，肿瘤的侵入导致基底膜的分解、细胞外基质的分解以及其中存在胶原的组成结构的分解。因此，在肿瘤的侵入能力和人肿瘤中是否存在胶原酶活性之间发现存在非常明显的关系。在肿瘤细胞以及肿瘤周围的成纤维细胞中都发现有胶原酶。正常的表皮细胞分泌非常少量的胶原酶，而该蛋白在侵入或者转移的肿瘤细胞中被超表达。
另一种变性疾病是胶原类纤维蛋白的变性，并通常称为“胶原病”。
因此，本发明涉及通过本发明的方法制得的产物作为抗胶原酶活性剂的应用。申请人的工作特别是为羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯(在1位处的甘油单酯)的抗胶原酶活性提供了证据。本发明还涉及羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)或羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在药物和/或化妆品组合物中作为抗胶原酶活性剂的应用。
本发明涉及羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制备用于预防或抵抗胶原分解的药物中的应用。该药物特别是用于预防或抵抗细菌感染时细菌胶原酶对胶原的分解作用。
本发明还涉及羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制备用于皮肤和韧带再生的药物中的应用。
本发明还涉及羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制备用于预防或抵抗肿瘤侵入的药物中的应用。
本发明还涉及羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制备用于预防或者抵抗包括胶原类纤维蛋白变性并且称为“胶原病”的变性疾病的药物中的应用。
通过本发明的方法制得的产物可如前所述用于化妆品和/或药物领域中。申请人的工作证实了在最后的脱保护步骤后根据本发明的方法得到的产物、特别是羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)具有脂解活性。因此，在最后的脱保护步骤后根据本发明的方法得到的产物、特别是DHA可特别地用于减肥治疗以及需要脂解活性的所有已知治疗中。
根据本发明的方法得到的产物可如上所述例如用于化妆品和/或药物领域中。申请人的工作证实在最后的脱保护步骤后根据本发明的方法得到的产物、特别是羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)具有抗痤疮活性。
痤疮的治疗需要克服两个主要的问题，其中一个是过度的皮脂溢性，另一个是导致皮肤感染的细菌的增殖。申请人的工作证实在最后的脱保护步骤后根据本发明的方法得到的产物、特别是DHA同时具有皮脂调节活性和抗菌活性。
实际上，DHA能够抑制皮肤中的5α-还原酶，其是负责产生二氢睾酮的酶。与未经治疗的对照组相比，用0.1％的DHA治疗以及用0.5％的DHA治疗分别将5α-还原酶活性降低约70％和约90％。该抑制作用可大大降低皮脂的量。
另外，用Propionibacterium acnes、Staphylococcus aureus和Malasseziafurfur进行测试，在治疗14或28天后，0.5％的DHA产生约95-100％的杀菌作用。
本发明的其他优点和特征通过以下实施例将变得更为明显。这些实施例一方面涉及本发明的合成方法，另一方面涉及通过本发明的方法得到的产物的抗胶原酶以及脂解性质。
具体实施例方式
实施例1合成Ia(n＝1，m＝6，R1＝OEt)和Ie(甘油三酯)1、步骤1溴化反应 将438g(3mol)的1，8-辛二醇混合至3L的甲苯中形成溶液。随后添加375ml(3.3mol)48％的含水HBr。加热反应物以通过共沸蒸馏除去所存在的水以及在反应中形成的水。接触13.5小时后，重新冷却反应物，然后再添加饱和碳酸氢钠溶液。分离有机相并用饱和氯化钠溶液洗涤。在硫酸镁上干燥后，浓缩反应液，得到672g的粗产物。
在96℃、P＜1mbar的条件下减压蒸馏，由此纯制8-溴辛醇，m＝575g(92％)。
表征-CCMRf＝0.8(庚烷/异丙基醚8/2)-1H NMR(200MHz，CDCl3)3.65(t，2H，J＝6.4Hz)，3.43(t，2H，J＝6.8Hz)，1.87(m，2H)，1.36-1.69(m，10H)
2、步骤2氧化为醛 在N2下将708g(5.87，3当量)的无水N-甲基吗啉N-氧化物溶解在3L的DMSO中。在30分钟的时间内添加溶解在1L的DMSO中的410g(1.96mol)8-溴辛醇。反应液变为澄清。N-甲基吗啉的铵溴化物沉淀。在室温下搅拌65小时后，过滤出所述盐，而反应液用4L的氯化钠饱和溶液处理。用4×1L乙酸乙酯萃取并干燥后，得到320g的粗产物，其由74％的醛(R＝83％)和26％的1，8-辛二醇组成。
表征-CCMRf＝0.6(庚烷/乙酸乙酯8/2)-1H NMR(400MHz，CDCl3)9.74(t，1H，J＝1.7Hz)，3.61(t，2H，J＝6.6Hz)，2.41(dt，2H，J＝1.7和7.3Hz)，1.51-1.65(m，4H)，1.24-1.37(m，6H)3、步骤3Witting-Horner反应
将前述粗产物(320g)放置溶解在3L的水中。添加800ml(4.2mol，2.1当量)的三乙基磷酰乙酸酯，然后添加830g(6mol)的碳酸钾。搅拌20小时后，终止反应。反应液用4×1L异丙基醚萃取。在硫酸镁上干燥后，蒸发有机溶剂，得到650g的粗产物。
该产物在E＝120℃、P＜1mbar的条件下蒸馏纯制。
在此情况下，回收得到280g的无色液体，通过MRN(R＝80％，由醛起始，或者66％，由溴化衍生物起始)或者用庚烷/乙酸乙酯8/2进行洗脱，证实是相同的，在此情况下得到119.6g的产物(28％，由溴化衍生物起始)。
表征-CCMRf＝0.8(庚烷/乙酸乙酯8/2)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.91(m，1H)，5.78-5.82(dt，1H，J＝1.4和15.6Hz)，4.17(q，2H，J＝7.1Hz)，3.63(t，2H，J＝6.6Hz)，2.18(dq，2H，J＝1.2和7.3Hz)，1.22-1.65(m，11H)4、步骤4皂化反应 将119.6g(0.56mol)的羟基酯溶解在600ml的乙醇中，然后添加400ml的4.6N氢氧化钾溶液。反应溶液搅拌8小时。用异丙基醚萃取反应液。含水相酸化至pH＝1，并用乙酸乙酯萃取。干燥并蒸发后，得到99.6g的粗固体物质。在异丙基醚/石油醚中重结晶，得到白色固体的产物(86g，83％)。
表征-CCMRf＝0.2(庚烷/乙酸乙酯7/3)-熔点61.3℃-1H NMR(400MHz，CDCl3)7.06(dt，1H，J＝15.6和7Hz)，5.81(dt，1H，J＝1.5和15.6Hz)，3.64(t，2H，J＝6.6Hz)，2.22(dq，2H，J＝1.2和7.3Hz)，1.52-1.58(m，2H)，1.45-1.48(m，2H)，1.33-1.3765(m，6H)5、步骤5保护反应 86g(0.46mol)羟基酸放置并溶解在45ml(0.48mol)3，4-二氢-2H-吡喃在500ml的THF中的溶液内。添加1ml的浓盐酸，并搅拌反应溶液24小时。
浓缩THF，粗产物溶解在乙酸乙酯中，然后用氯化钠溶液洗涤至中性pH。在硫酸镁上干燥后，得到132g的粗产物(＞100％)。
表征-CCMRf＝0.4(庚烷/乙酸乙酯7/3)-1H NMR(400MHz，CDCl3)7.06(dt，1H，J＝15.6和7Hz)，5.81(dd，1H，J＝1.6和15.6Hz)，4.58(t，1H，J＝2.8Hz)，3.82-3.91(m，1H)，3.71-3.73(m，1H)，3.51-3.52(m，1H)，3.36-3.39(m，1H)，2.20(m，2H)，1.33-1.89(m，16H)
6、步骤6甘油的酯化反应 将8.4g(0.091mol)的甘油放置并溶解在500ml的二氯甲烷中。在通过共沸蒸馏除去痕量的水后，将上述粗产物(0.46mol)溶解在500ml的二氯甲烷中，然后添加在反应溶液中。添加56.8g(0.46mol)的二甲基氨基吡啶和97g(0.46mol)的二环己基碳二亚胺。反应溶液搅拌78小时。过滤所形成的沉淀。
反应溶液浓缩并溶解在异丙基醚中。过滤并浓缩后，得到156g的粗产物，然后通过色谱用庚烷/乙酸乙酯7/3作为洗脱液进行纯制。
得到99g的流出物，其包含2/3的产物和1/3的乙酰化物(acyluree)。
表征-CCMRf＝0.7(庚烷/乙酸乙酯7/3)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.96(m，3H)，5.80(dd，3H，J＝1.6和15.6Hz)，5.29-5.31(m，1H)，4.54-4.57(m，3H)，4.20-4.39(m，4H)，3.81-3.89(m，3H)，3.68-3.72(m，3H)，3.41-3.49(m，3H)，3.34-3.39(m，3H)，2.25-2.18(m，6H)，1.33-1.99(m，48H)
7、步骤7最终的脱保护 将99g(0.136mol)的上述混合物溶解在1L包含9.9g APTS的甲醇中。反应溶液搅拌14小时。终止反应。反应溶液浓缩。所得的油放入水中，然后用饱和碳酸氢钠溶液调节至pH＝6。含水相用二氯甲烷萃取。有机相在干燥并蒸发后，得到77g黄色油。
该产物在硅胶上用二氯甲烷/丙酮9/1至1/1以及二氯甲烷/甲醇95/5作为洗脱液进行色谱纯制。
得到27g油状产物，其结晶为黄白色无定形固体，纯度为85-90％。
表征-CCMRf＝0.2(二氯甲烷/丙酮9/1)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.94-7.01(m，3H)，5.78-5.84(m，3H)，5.29-5.31(m，1H)，4.20-4.34(m，4H)，3.60-3.65(m，6H)，2.16-2.22(m，6H)，1.33-1.99(m，30H)实施例2合成以下式的化合物
1、步骤18-溴辛醇的保护 将21g(0.1mol)的8-溴辛醇溶解在200ml的二氯甲烷中。在0℃下添加16g(0.104mol)的叔丁基二甲基甲硅烷基氯，随后添加7.5g(0.11mol)的咪唑。立刻形成沉淀。搅拌3小时后，过滤反应溶液，然后浓缩，并蒸馏粗产物。
在99-104℃和P＜1mbar的条件下分离出25.8g的产物(82％)。
表征1H NMR(400MHz，CDCl3)3.59(t，2H，J＝6.6Hz)，3.39(t，2H，J＝6.9Hz)，1.82-1.89(m，2H)，1.30-1.50(m，10H)，0.88(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(s，6H)2、步骤2氧化为醛 20g(61mol)的甲硅烷基衍生物放置并溶解在200ml的DMSO中。添加21.7g(0.18mol)的N-甲基吗啉N-氧化物。反应溶液搅拌72小时。形成沉淀。反应溶液用饱和氯化钠溶液稀释，然后用异丙基醚萃取。干燥并蒸发后，得到15.3g的粗产物。
在81℃和P＜1mbar的条件下蒸馏，由此纯制产物(9g，57％)。
表征1H NMR(400MHz，CDCl3)9.76(t，1H，J＝1.9Hz)，3.59(t，2H，J＝6.6Hz)，2.42(dt，2H，J＝1.8和7.2Hz)，1.49-1.68(m，4H)，1.30-1.32(m，6H)，0.88(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(t，6H，J＝2.9Hz)3、步骤3Witting反应 将835g(21mmol)的NaH溶解在5ml的THF中并冷却至T＜℃。滴加4.2ml(22mmol)的三乙基磷酰乙酸酯。在室温下搅拌3小时后，在冷却下添加5g(19mmol)的醛，然后搅拌17小时。用水进行水解后，用乙酸乙酯萃取，干燥并蒸发，得到6.7g的粗产物。
在硅胶上(用庚烷/乙酸乙酯8/2洗脱)进行纯制，得到3.7g的产物(60％)。
表征-CCMRf＝0.6(庚烷/乙酸乙酯8/2)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.95(dt，1H，J＝8.6和15.6Hz)，5.79(dt，1H，J＝1.4和15.6Hz)，4.17(q，2H，J＝7.1Hz)，3.58(dt，2H，J＝6.6和9.8Hz)，2.15-2.21(m，2H)，1.46-1.51(m，4H)，1.24-1.42(m，9H)，0.88(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(t，6H，J＝2.9Hz)4、步骤4皂化 将2g(6mmol)的酯溶解在10ml乙醇中，然后添加5ml的3.8N氢氧化钠溶液。4小时后终止反应。反应溶液酸化至pH＝1，并用乙酸乙酯萃取。无需进一步的纯制就可得到产物(1.5g，83％)。
表征-CCMRf＝0.2(庚烷/乙酸乙酯7/3)-1H NMR(400MHz，CDCl3)7.07(dt，1H，J＝8.6和15.6Hz)，5.81(dt，1H，J＝1.4和15.6Hz)，3.59(dt，2H，J＝6.6和9.8Hz)，2.21-2.27(m，2H)，1.46-1.51(m，4H)，1.24-1.42(m，6H)，0.89(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(t，6H，J＝2.9Hz)实施例3在人皮肤的冷冻切片上评估根据本发明的方法得到的产物的抗胶原酶活性1、操作模型该研究是用活性成分的浓度为1％和2％的不同溶液来完成的，同时与单独使用赋形剂、缓冲液对照和胶原酶进行比较。所用的活性成分是DHA(羟基-10-癸烯-2(反)油酸，ML40)和羟基-10-癸烯-2(反)油酸甘油酯(GM)。表1总结了所测试的不同溶液。
表1
在组织学玻片上放置5μm的冷冻切片(每个玻片上放置4个切片)，该切片来自于一位54岁妇女的乳房。
所述切片上覆盖待测试的溶液，并在37℃下于潮湿的空间内温育2小时。通过重复冲洗除去所述溶液，然后用picrosirius对切片进行染色。显微镜检查是用2.5的镜头完成的，并用Kodak Gold 100 ASA胶片进行照相。
2、结果表2总结了胶原结构随测试溶液而发生改变的结果。0表示胶原结构没有发生改变，而1或2分别表示胶原的结构平均或者净发生非常强的改变。
表2
另外，应用Tris缓冲液对照和赋形剂都没有使胶原的结构发生改变。
因此，1％和2％的产物DHA完全抑制了胶原酶的活性，而2％的产物ML40和GM轻微地抑制胶原酶的活性。
实施例4在保持存活的人皮肤外植组织上评估根据本发明的方法得到的GM的抗胶原酶活性1、操作模型该研究是在100U/ml胶原酶存在下用5％的GM产物与赋形剂(hydrocerine)、阳性对照和对照进行比较来完成的。
Hydrocerine是用于待施用的产物制剂的赋形剂。该研究做两次。在第一次的研究中，观察到胶原酶在第2天时的作用非常有限，而且仍是不显著的。在第二次的研究中，延长了施用时间，并在第2天和第4天对外植组织进行提取。
a、外植组织的制备如下表3所示，制备人皮肤的外植组织并分为16组，每组3个外植组织。
表3
b、施用5％的GM产物按照每个外植组织20mg的比例在第0天和第2天施用产物，在后24组的培养液中掺入胶原酶。
c、组织学每组的3个外植组织在第2天进行提取，在第4天固定在普通的Bouin上，然后进行组织学检查。
组织学研究包括在石蜡中的浸入切片用红色sirius F3B染色通过分析图象对胶原进行比色测量与照片的关系2、结果在所检查的组中，第2天进行的提取没有对胶原酶表现出任何显著的活性。为此原因，存活、接触和施用都延长至第4天。从两个方面评价胶原酶的作用胶原网的着色强度和皮肤结构的厚度。通过本研究，活性成分的渗透作用与其对胶原酶的抑制活性是相关的。所得结果如下—对于没有胶原酶的对照，皮肤具有正常的结构，而且胶原束在所有的腔室中都是规律的，—对于含有胶原酶的对照，胶原束被非常强烈地分解，而且皮肤的厚度减到一半，—对于使用赋形剂和胶原酶的外植组织，胶原束被强烈分解，其变化小于用含有胶原酶的对照的细胞，而且皮肤的厚度减小差不多一半，—对于使用5％GM产物和胶原酶的外植组织，胶原束被略微分解，而且皮肤的厚度略微减小，—对于使用阳性对照(菲咯啉)和胶原酶的外植组织，皮肤结构与没有使用胶原酶的对照是相同的。
实施例5在活体外的脂肪组织的外植组织上评估根据本发明的方法得到的DHA的抗脂解活性1、操作模型DHA以0.25和0.5％的最终浓度掺入到培养液中。接触8天后，通过培养液中析出的脂质量来评估活性。
a、外植组织的制备制备12个脂肪组织的外植组织，然后放入BEM培养基(BIO-EC′s外植组织培养基)中。将外植组织分为4个组，每组3个外植组织对照组阳性对照组(0.1％的咖啡因)两个产物组(0.25和0.5％的DHA)b、产物的施用在第0天，将外植组织放入2ml的培养基中，在该培养基中掺入了待测试的产物。
该处理在第2、4和6天时进行更新。
c、提取在第2、4、6和8天时，提取培养基。对于每个外植组织，在第2、4、6和8天时提取的培养基都放入一个相同的试管中，并在-20℃下保存以检测脂质的量。
在第8天时，提取脂肪组织的外植组织并固定在普通的Bouin中以进行组织学研究。
d、组织学已固定的脂肪组织的外植组织被脱水，浸渍在石蜡中，成块状，切片，然后用trichrome de Masson染色。
e、脂质的量在提取培养基后，分离并用CCM测量脂质的量。
2、结果通过组织学研究检查脂肪细胞的存活率和形态。
脂解活性通过分析甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯以及游离脂肪酸的比例来评估。
a、组织学维持存活8天后，对照和经过处理的外植组织既没有肉眼可见的改变，也没有细胞坏死。
b、脂质的量所得结果总结在以下表4中。这些结果是用8天的处理时间内在培养基中各类游离脂质的质量(μg)来表示。
表4
以下表5表示通过对在8天的处理期间培养基中的游离脂肪酸的量的结果进行Student检验而得到的统计分析。
表5
该研究中的基本参数是量的变化量以及在处理后培养基中游离脂肪酸的百分比。
对于未经处理的对照，观察到阳性对照(0.1％的咖啡因)增加约29倍(2780％)。
0.25％和0.50％的DHA分别导致1075％和1087％的显著增加。所用浓度的增加没有产生更高的效力。这好像说明最大效力的剂量应在0.25％的数量级上。
在以上描述的操作条件下并根据Student检验，以0.25％和0.5％剂量施用的DHA与咖啡因处理的细胞相比具有显著的脂解活性。
权利要求
1.制备以下通式(Id)之脂族不饱和羟基酸及其酯的方法 其中n＝1-4，m＝2-16，R1＝OH、Cl、Br、OR3，其中R3代表具有1-16个碳原子的直链或支链烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它们任选被一个或者多个碳、氮、硫或卤原子取代，所述卤原子是氟、氯、溴或碘，R2代表H、SiR′1R′2R′3，其中R′1、R′2、R′3相同或不同，并代表具有1-16个碳原子的直链或支链烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它们任选被一个或者多个碳、氮、硫或卤原子取代，所述卤原子是氟、氯、溴或碘，或者R2代表C-Ar3，其中Ar代表任选被一个或多个碳、氮、硫或卤原子取代的芳基，所述卤原子是氟、氯、溴或碘，或者R2代表以下式的四氢吡喃基 该方法的特征在于是根据以下反应路线来合成 其中R1、R2、m和n与通式(Id)中的定义相同。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步是溴化反应，起始化合物是式(II)的二醇。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，第一步需要使用溶剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自于以下组中甲苯、苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、环己烷、庚烷和石油醚。
5.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第一步中所用的反应物选自于含水或不含水的HBr、Ph3P-Br2、四溴化碳-三苯基膦、氢溴酸。
6.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第二步是在环状或非环状、无水或含水的叔胺N-氧化物以及DMSO存在下氧化形成式(IV)的醛。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述环状或非环状、无水或含水的叔胺N-氧化物选自于N-甲基吗啉氧化物、三甲胺氧化物或三乙胺氧化物或者它们的混合物。
8.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第三步是Witting-Homer反应，而第四步是皂化反应。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Witting-Homer反应是在三乙基磷酰乙酸酯和碳酸钾存在下实施的。
10.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第五步是一个特异性保护在第四步中得到的通式(Ib)化合物的醇官能团的步骤。
11.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第五步是在酸催化剂存在下于烯醇醚中进行的。
12.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第五步是在APTS(对甲苯磺酸)存在下于二氢吡喃中进行的。
13.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，第五步中得到的通式(Id)产物进行最终的脱保护以得到通式(Ie)的化合物。
14.如权利要求1-12之一所述的方法，其特征在于，第五步中得到的通式(Id)产物在进行最终的脱保护之前用于甘油的酯化反应中。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述的脱保护是在包含酸催化剂的甲醇溶液中进行的。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所用的酸催化剂是ATPS。
17.根据任一前述权利要求的方法得到的产物在药物和/或化妆品制剂中作为抗胶原酶活性剂的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述产物是羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)或羟基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是用于预防或者抵抗胶原的分解。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是用于预防或者抵抗细菌感染期间细菌胶原酶对胶原的分解。
21.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是用于皮肤和韧带的再生。
22.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是用于预防或者抵抗肿瘤的侵入。
23.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是用于预防或者抵抗包括胶原类纤维蛋白变性并且称为“胶原病”的变性疾病。
24.根据权利要求1-16之一所述的方法制得的产物在药物和/或化妆品制剂中作为脂解活性剂的应用。
25.根据权利要求1-16之一所述的方法制得的产物在药物和/或化妆品制剂中作为抗痤疮活性剂的应用。
26.如权利要求24或25所述的应用，其特征在于，所述产物是羟基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)。
全文摘要
本发明涉及制备通式(Id)的不饱和羟基脂肪酸及其酯的方法，以及该化合物在药物和/或化妆品制剂中作为抗胶原酶活性剂、脂解活性剂和/或抗痤疮活性剂的应用。
文档编号A61P11/00GK1555351SQ02817943
公开日2004年12月15日 申请日期2002年9月11日 优先权日2001年9月12日
发明者皮埃尔·波捷, 弗朗索瓦丝·皮科, 让－路易·布拉耶尔, 住げ祭 , 瓦丝 皮科, 皮埃尔 波捷 申请人:皮埃尔·波捷, 皮埃尔 波捷