专利名称：采用环糊精、脂质体和生物降解性聚合物和/或其混合物及其制品制备肽血管紧张素－(1 ...的制作方法
技术领域：
本发明的特征在于制备七肽血管紧张素-(1-7)及其类似物、激动剂和拮抗剂的制剂的方法，优选使用环糊精、其衍生物、脂质体和可生物降解聚合物，和/或这些系统的混合物和或其相应制品。其特征也在于通过采用或不采用包封的剂型，确认G-偶联受体、MAS与血管紧张素-(1-7)及其类似物之间的配体-受体相互作用，用作心血管、肾脏、生殖系统、皮肤、肿瘤、神经病和血液病中研究和治疗性干预的目标。
背景技术：
在世界上的大多数国家中，约有15％至25％的成年群体患有动脉高血压(MacMahon S.等，血压、中风和冠心病，Lancet 335；765-774，1990)。心血管风险随着动脉压的水平而增加。动脉压越高，脑血管意外和冠状动脉意外的风险就越大。据信，高血压是冠状动脉、脑和肾血管疾病的主要诱因，是成人死亡和无行为能力的主要原因。
在世界范围内，心力衰竭是60-80岁病人住院的主要原因。人口老龄化已经是心力衰竭发病率增加的一个重要因素约有1％的25-54岁个体存在心力衰竭，其中年龄越大发病率就越高，在大于75岁的个体中高达10％(Kaannel W.B.等，心力衰竭流行病学的变化特征，Br.Heart J 1994；72(增刊)S3-S9)。
心衰的临床特征在于其是一种限制性疾病，病人的生活质量随着病情的恶化而降低，并且对于在晚期病人而言，它是一种致命性疾病，即使目前，其第一年死亡率仍超过60％(Oliveira，M.T；晚期充血性心力衰竭病人的临床特征和预后，Faculty of Medicine，USP 1999)。据信，近年来仅在工业化国家就有超过1500万的个体患病，例如仅在美国，1973-1990年间的病案数量就增长了450％(Kannel W.B.等，心力衰竭的流行病学变化特性，Br.Hear J，1994；72(增刊3)S3-S9)。
高血压是一种多因素的高度流行的复杂疾病，可引起许多有害作用和高发病死亡率(Kaplan，N.M.，心血管的危险因素血压的预防和治疗，JAMA.2751571-1576，1996)。为了更好地了解高血压的病程，业已在普通和特殊群体中对其控制效力进行了若干项评估研究。对于没有经相关危险因素(例如糖尿病、肥胖病、吸烟)的非药物广泛干预而控制到正常水平血压而言，可减少、甚至避免动脉高血压长期治疗给例如冠心病所带来的降低致死率的益处(Wilson，P.W.等，高血压症心血管疾病的危险因素和风险，Raven Press.94-114)。
高血压能引起心血管动脉粥样硬化(The fifth Report of the JointNational Committee on detection，evaluation，and treatment of HighBlood Pressure.美国国立卫生研究院(VJNC).Arch.Intern.Med.153154-181，1994)。统计表明，每四个美国人中即有一个已患或将患有高血压，并且估计有47,800万人患有心衰。每年，新诊断出的病例有40万例，有80万人住院治疗，美国要为治疗支出178亿美元。
来源于National System of Health(SUS)的数据表明，1997年，在巴西，心衰是心脏病患者住院治疗的主要诱因，政府用于治疗的费用约R$1.50亿，这相当于整个健康卫生开支的4，6％(Filho，Albanesi F；巴西的心衰疾病，Arq.Bras.Cardiol，71561-562，1998)。
肾素-血管紧张素体系(RAS)对生理学或病理学条件下的动脉压、心血管内平衡和水电解质平衡的调节起作用(Krieger E.M.，Santos，R.A.S.，血管紧张素-生理学特点，Hypertension，17-10，1998)。血管紧张素II(Ang II)是RAS中主要的活性肽，具有若干作用血管加压药，肾上腺甾类合成的刺激剂，增殖作用(脉管系统的成纤维细胞、平滑肌)和肥大(cardiomiocites)。其形成途径包括肝形成血管紧张素原和肾小球旁器中产生肾素。这些物质在血液中释放，血管紧张素原在此经肾素水解形成Ang I，其主要在肺循环经血管紧张肽转化酶(ACE)转化成Ang II。后一种肽将作用于远离其形成部位的靶器官(Krieger，E.M；Santos，R.A.S；血管紧张素-生理学特点，Hypertension，17-10，1998)。
最近发现，与在循环中产生Ang II的循环RAS相似的是，还存在着可在不同组织产生可能具有局部作用的Ang II的自主系统。在血管壁、子宫、胰腺的外分泌部、眼、心脏、肾上腺皮质、睾丸、卵巢、垂体(hypophise)的前和中叶、松果体和脑中，发现了RAS的所有成分。然而，这些组织RAS的作用并不十分清楚(Ardaillou，R.；Michel J.B.，循环和组织肾素血管紧张素系统的相对作用，Nephrol.Dial.Transplant.，14283-286，1999)。RAS的局部作用能出现在细胞水平以产生肽即(自泌或胞分泌作用)、或邻近细胞(旁分泌作用)、或远离形成区域的位点(内分泌功能)。
近来的研究表明，RAS之重要的周围和脑作用受较小序列的血管紧张素原肽调节，这包括血管紧张素-III[Ang-(2-8)]、血管紧张素-IV[Ang-(3-8)]和血管紧张素-(1-7)。我们认为血管紧张素-I[Ang-(1-10)]和血管紧张素-II[Ang-(1-8)]均能经过生物转化过程，生成一“族”的生物活性血管紧张素肽(Santos，.R.A.S.，Campagnole-Santos，M.J.，Andrade，S.P.，血管紧张素-(1-7)新的调节肽，9145-62，2000).
血管紧张素-(1-7)是血管紧张素“家族”中的生物活性肽，是由非ACE转化途径形成的。Ang I经内肽酶作用、或者Ang II经脯氨酸肽酶或羧肽酶作用，能产生七肽Ang-(1-7)，Ang-(1-7)可经氨肽酶水解而生成Ang-(2-7)和Ang-(3-7)。Ang-(1-7)经ACE水解而产生Ang-(1-5)(Santos，R.A.S.，Campagnole-Santos，M.J.，Andrade，S.P.，血管紧张素-(1-7)最新修订本，《调节肽》，9145-62，2000)。
Ang-(1-7)和Ang II是RAS的主要效应物。然而，Ang-(1-7)有两种不同于Ang II的重要特征；第一是具有高度专属性的生物学作用，而且其形成途径与ACE无关(Santos，R.A.S.，Campagnole-Santos，M.J.，Andrade，S.P.，血管紧张素-(1-7)最新修订本《调节肽》，9145-62，2000)。
高血压症治疗的主要目标不仅仅是降低费用，而是要通过改善生活质量和必要时使用药物防止对终器官的损伤(The Fifth Report ofThe Joint National Committee on detection，evaluation，and treatmentof High Blood Pressure，美国国立卫生研究院(VJNC)，Arch.InternMeD.153154-181，1994)。
抗高血压药物的应用指征为，当病人对为期3-6个月的生活方式改变没有响应时，并出现终器官损伤(左心室肥大、心肌缺血、中风或高血压性视网膜病变)。动脉收缩压超过180mmHg或动脉舒张压超过110mmHg的所有病人应接受不同于已有疗法的独立药理学治疗(Report of Canadian Hypertension Society.Consensus Conference3.Pharmacological treatment of essential hypertension.Xan.Med.Assoc.J.149(3)575-584，1993)。
然而，在70和80年代期间，抗高血压药物成为治疗动脉高血压的重要手段(Menard，J.，Anthology of renin-angiotensin systemTheone hundred reference approach to angiotensin antagonistic II，J.Hypertension 11(增刊3)S3-S11，1993)。在过去的四十年间，药理学研究开发出了治疗高血压症的新药物利尿剂(60年代)、β-阻滞剂(70年代)、钙通道阻滞剂、血管紧张素II拮抗剂和ACE抑制剂。
利尿剂分为3类噻嗪类(Thazidics)、髓袢利尿剂和钾保留剂。噻嗪类和类似物包括氯噻嗪和氢氯噻嗪，它们能在治疗的第一天使动脉压下降10-15％，这主要是由于胞外容积的降低和利尿以及尿钠排泄的增加。六个月后，血容量和心输出量恢复至基线水平，并且由于周围血管阻力的降低使动脉压的下降得以保持(Frolich，E.，治疗高血压的新方法，Hypertension，405-469)。这些药物通常以低剂量单一疗法用于老年患者，并且对黑种(black)病人有最佳效果。它们具有并行的(collateral)效力增加对胰岛素的外周阻力，增加甘油三酯(trigliceride)水平，增加LDL，低血钙，多尿症。髓袢利尿剂中的呋塞米、布美他尼和trianterene，它们比噻嗪类更有效。它们主要作用于Henle袢的髓质和皮质部分。它们也具有似于噻嗪类的并行效力。然而，钾保留剂(包括amolonide、trianterene和speronolactones)是具有弱利尿作用的药物，并且很少单独使用。
β阻滞剂，例如阿替洛尔和纳多洛尔，属于β-1和β-2，其作用机理还没有完全确定。它们具有并行效力改变对胰岛素的应答，延长低血糖昏迷，增加甘油三酯水平和由于肾流下降而增加肌酐。
钙通道阻断剂的应用至少已有25年(Frolich，E.D.，治疗高血压的新方法，405-469，1994)。根据其药理作用，可分为两个主组在刺激传导方面作用较大的阻断剂，例如异搏定和地尔硫卓，和具有突出的血管扩张作用的阻断剂，例如二氢吡啶类(diidropirinicos)衍生物(硝苯地平等)(Frolich E.D.，高血压，成年人临床心脏病学自我评估程序(ACCSAP)，63-19，1995)。它们对下肢(inferior member)水肿和心动过速具有并行的作用。
ACE抑制剂的主要作用是抑制血管紧张素I转化为血管紧张素II。这样，血管紧张素II的血管收缩作用基本上被最小化了。临床上最早应用的ACE抑制剂替普罗肽，只有经静脉内途径施用时才发挥出抗高血压作用，这是因为其口服无效，这样就限制了其应用。已知ACE是具有多重作用的酶，即其作用于若干底物。除了在血管紧张素I和缓激肽中用作二肽酶之外，它还能水解利钠肽的肽(peptidic)链，这表明该酶能作用于多种组织。ACE在循环和组织Ang-(1-7)的失活作用中起着重要的作用。这种肽的循环浓度与Ang II浓度相似，并且抑制ACE后其浓度增加。这种增加可能是由于其前体(Ang I)的增加和ACE所致降解减少(Santos，R.A.S.，Campagnole-Santos，M.J.，Andrade，S.P.，血管紧张素-(1-7)最新修订本，《调节肽》，9145-62，2000)。当作为单一疗法施用时，ACE抑制剂的效力极好，它们能使60-70％高血压患者的动脉压较快地降低(Ganong，W.，心血管控制中的神经肽，J.Hypertens 2(增刊3)15-22，1984)。另外，患者通常对它们的耐受性较好，但是其应用能引起并行作用和不良反应，其中一些反应(例如干皮病、皮疹和干咳)是很严重的(8-10％)。
对Ang II拮抗剂的开发始于70年代，并且集中于对Ang II类似肽的研制上。第一个拮抗剂是肌丙抗增压素，随后又开发出一些拮抗剂，1-sarcosina、8-isoleucina血管紧张素II。然而，由于其存在的部分兴奋(agonistic)活性，而不为临床上接受。在1982年，研制出非肽性能的AT1受体的首批2种选择性拮抗剂(S-8307和S-8308)。然而，尽管具有高度特异性且没有兴奋活性，它们与Ang II的受体的结合较弱。为了提高其效力、保持选择性并达到药动学性能，对这两种前体分子结构进行的一系列修饰，开发出了有效和高度选择性的口服活性产品氯沙坦。随后，由此开发出了许多非肽来源的拮抗剂，例如坎地沙坦、厄贝沙坦、缬沙坦、替米沙坦、依普罗沙坦、他索沙坦和佐拉沙坦。
血管紧张素-(1-7)，(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro)及其衍生物[Sarl]-Ang-(1-7)能拮抗Ang II对人(Ueda S，Masumori-Maemoto S，Ashino K，Nagahara T，Gotoh AND，Umemura S，Ishii M.，血管紧张素-(1-7)减弱血管紧张素II诱发的人血管收缩、但不能减弱去甲肾上腺素诱发的人血管收缩，Hypertension 2000；35998-1001)和鼠(Bovy PR，Trapani AJ，McMahon EG，Palomo M.，一类新的血管紧张素II拮抗剂羧基端被截断的血管紧张素II类似物[Sarl]-血管紧张素II-(1-7)-酰胺，JMed Chem.1989，32520-522)的加压作用。血管紧张素-(1-7)也可降低Ang II在兔和人离体动脉中产生的收缩(Bovy PR，TrapaniAJ，McMahon EG，Palomo M.，一类新的血管紧张素II拮抗剂羧基端被截断的血管紧张素II的类似物[Sarl]-血管紧张素II-(1-7)-酰胺，JMed Chem.1989，32520-522；Roks AJ，Van-Geel PP，Pinto YM，Buikema H，Henning RH，of Zeeuw D，van-Gilst WH.，血管紧张素-(1-7)是人肾素-血管紧张素系统的调质，Hypertension 1999；34(2)296-301)。
目前仍未能确认对Ang-(1-7)响应的转导起作用的受体，并且形成许多有关Ang-(17)信号转导的可能性理论。存在着不同受体和/或Ang-(1-7)作用的信号转导存在着不同机制的第一个证据是已证明几种Ang-(1-7)的作用机制与Ang II的作用不同、甚至是相反的。最近，七肽D-[Ala7]-Ang-(1-7)(A-779)被证明是Ang-(1-7)作用的有效拮抗剂(Santos RAS，Campagnole-Santos MJ，Baracho NCV，Fontes MAP，Silva LCS，Neves LAA，Olivera DR，Caligiome SM，Rodrigues ARV，Gropen Jr.C，Carvalho WS，Silva ACS，Khosla MC.，表征选择性作用于血管紧张素-(1-7)的新型血管紧张素拮抗剂其经特异性血管紧张素受体介导对血管紧张素-(1-7)作用的证据，Brain Res.Bull.1994；35293-299)。该研究结果表明，这种类似物是Ang-(1-7)的选择性拮抗剂，而在一些生物制品中没有发现兴奋活性。A-779对Ang-(1-7)在水过载鼠中的抗利尿作用表现出有力的拮抗作用。Ang-(1-7)在兔入球小动脉中产生的血管扩张、在RVLM中的Ang-(1-7)加压作用、体内在肠系膜微循环中产生的血管舒张，均完全被A-779阻滞，并且不受选择性Ang II拮抗剂的影响。采用牛内皮细胞、狗冠状动脉、SHR主动脉、人上皮成纤维细胞、人心脏成纤维细胞和肾切片所进行的其它研究，均支持有关存在着可被A-779阻滞的Ang-(1-7)特异性受体的证据(Santos，RAS.，Campagnole-Santos，MJ.，Andrade，SP.，血管紧张素-(1-7)最新修订本，调节肽，9145-62，2000)。
A-779及其类似物，例如Sar 1-D-Ala 7-Ang-(1-7)(Bovy PR，Trapani AJ，McMahon EG，Palomo M.，一类新的血管紧张素II拮抗剂羧基端被截断的血管紧张素II的类似物[Sar]-血管紧张素II-(1-7)-酰胺，J Med Chem.1989；32520-522.)，和D-Pro7-Ang-(1-7)(Naves-Santos，V；Khosla，M.C；Olivera，R.C；Campagnole-Santos，M.J.，Lima，D.X；Santos，RAS.，对血管紧张素-(1-7)类似物[D-Pro7]-血管紧张素-(1-7)的中枢加压作用的选择性抑制，XI Reuniao Annual of the Federation of Society of ExperimentalBiology，1996，Caxambu，MG)，和其他类似物均可用作阐明Ang-(1-7)生物学作用的工具。
业已证实，Ang-(1-7)作为该系统的反调节(contraregulatory)肽作用于RAS中，并且作用于多个位点(Ferrario CM，Chappell MC，DeanRH，Iyer SN.，新的血管紧张素肽调节血压、内皮功能和尿钠排泄，JAm Soc Nephrol.1998；91716-1722；Santos，R.Campagnole-Santos，MJ，Andrade，S P.，血管紧张素-(1-7)最新修订本，《调节肽》9145-62，2000；Heringer-Walther S，Batista EN，Walther T，Khosla MC，SantosRAS，Campagnole-Santos MJ.，ACE抑制剂影响血管紧张素-(1-7)以后使SHR的压力反射改善，Hypertension，371309-1313，2001)。
Ang-(1-7)降低血管发生和细胞增殖(Machado，RDP，Santos，RAS，Andrade，SP.，血管紧张素-(1-7)诱导的血管发生抑制的机制，Am JPhysio，280994-1000，2001；Rodgers K，Xiong S，Felix J，Rotates N，Espinoza T，Maldonado S，Dizerega G.，血管紧张素-(1-7)在加速皮肤修复药物中的进展，Wound Repair Regen，9238-247，2001)，由此具有治疗损伤的潜力。Ang-(1-7)可在酶的氨基末端域用作ACE抑制剂，它在此作为底物，而在C-末端域作为抑制剂(Deddish PA，Marcic B，Jackman HL，Wang HZ，Skidgel RA，Erds EG.，血管紧张素-转化酶的N-域-特异性底物和C-域抑制剂血管紧张素-(1-7)和酮基-ACE，Hypertension.1998；31912-917；Tom B，Of Vries R，Saxena PR，Danser AHJ.，与ACE之C-和N-域阻滞相关的血管紧张素-(1-7)和ACE抑制剂增强缓激肽的作用，Hypertension，3895-99，2001)。其抑制ACE的IC50约为1μmol(Chappell MC，Pirro NT，Sykes THE，Ferrario CM.，血管紧张素-转化酶对血管紧张素-(1-7)的代谢作用，Hypertension.1998；31(2部)362-367；Paula，RD，Lima，CV，Britto，RR，Campagnole-Santos，MJ，Khosla，MC，Santos，RAS.，血管紧张素-(1-7)相关肽增强缓激肽的降血压作用，Peptides，20493-500，1999；Deddish PA，Marcic B，Jackman HL，Wang HZ，Skidgel RA，ErdsEG.，血管紧张素-转化酶的N-域-特异性底物和C-域抑制剂血管紧张素-(1-7)和酮基-ACE，Hypertension，31912-917，1998)。
除了ACE抑制活性之外，Ang-(1-7)通过两种不同机制抑制Ang II作用1)竞争与AT1受体的连接(ligation)(Bovy PR，Trapani AJ，McMahon EG，Palomo M.，一类新的血管紧张素II拮抗剂羧基端被截断的血管紧张素II的类似物[Sar]-血管紧张素II-(1-7)-酰胺，J MedChem.1989；32520-522.-Ueda S，Masumori-Maemoto S，Ashino K，Nagahara T，Gotoh AND，Umemura S，IshIIM.，血管紧张素-(1-7)减弱血管紧张素II诱发的人血管收缩、但不能减弱去甲肾上腺素诱发的人血管收缩，Hypertension 2000；35998-1001；Roks AJ，Van-Geel PP，Pinto YM，Buikema H，Henning RH，deZeeuw D，van-Gilst WH.，血管紧张素-(1-7)人肾素-血管紧张素系统的调质，Hypertension 1999；34(2)296-301；Rowe BP，Saylor DL，Speth RC，Absher DR.，血管紧张素-(1-7)与鼠脑中的血管紧张素II受体结合，Regul Pep.1995；56(2)139-146；Mahon JM，Carrr RD，Nicol AK，Hendersn IW.，血管紧张素-(1-7)是1型血管紧张素II受体的拮抗剂，J Hypertension 1994；121377-1381)，和2)可能通过改变胞内钙的可利用性而改变Ang II作用的信号机制(Chansel D，Vandermeerch S，Andrzej T，Curat C，Ardaillou R.，血管紧张素IV和血管紧张素-(1-7)对肾小球膜细胞中基底血管紧张素II-刺激的胞液Ca+2的作用，Eur J Pharmacol.2001；414165-175)。Ang-(1-7)对抗Ang II之心血管系统有害作用的第三种机制是对能增强缓激肽的效力(Paula，RD；It Rasps，CV，Khosla，MC，Santos，RAS.，血管紧张素-(1-7)增强缓激肽对清醒鼠的降血压作用，Hypertension，261154-1159，1995；Li P，Chappell MC，Ferrario CM，Brosnihan KB.，血管紧张素-(1-7)通过与ACE竞争并释放一氧化氮而增强缓激肽诱导的血管舒张作用，Hypertension.1997；29(2部)394-400)。
缓激肽是具有有效血管舒张作用的内源性肽(Rocha和Silva，M，Beraldo，WT，Rosenfeld，G；hyptersive and smooth musele stimulatingfactor releases from shapes globulin by snake venoms and by trypsin，Am.J.Physio.156，261-273，1949)。有关缓激肽对心脏的作用也有描述(Linz W，Wohlfart P，Scholkens BA，Malinski T，Wiemer G.，ACE、激肽与NO之间的相互作用，Cardiovasc Res.1999；43549-561)。Ang-(1-7)增强了缓激肽在血管中的作用(Paula，R.D.，Lima，C.V.，Khosla，M.C；Santos，R.A.S.，血管紧张素-(1-7)增强了缓激肽在清醒鼠中的降血压作用，Hypertension，261154-1159，1995；Li P，Chappell MC，FerrarioCM，Brosnihan KB.，血管紧张素-(1-7)通过与ACE竞争和释放一氧化氮而增加了缓激肽诱导的血管舒张。Hypertension.1997；29(2部)394-400)，在心脏(Almeida，AP，Frabregas，BC，Madureira，MM，RJS，Campagnole-Santos，MJ，Santos，RAS.，血管紧张素-(1-7)增强了缓激肽在离体大鼠心脏中的冠状血管舒张作用。Braz.J.Of Medical andBiological Research，33709-713，2000)。
为了改变某种药物的性质例如生物分布、药动学和溶解性，可对其进行化学修饰。许多方法用于提高药物的溶解性和稳定性，其中使用有机溶剂，掺入乳剂或脂质体中，调节pH，化学修饰和与环糊精络合。
环糊精是环状寡糖家庭，包括6、7或8个吡喃葡糖单元。由于空间上的相互作用，环糊精(CD)形成了具有非极性内腔的截头圆锥(cone truncado)形状的环结构。它们是能以区域选择方式修饰的化学稳定的化合物。环糊精主分子可在其腔中与不同的疏水性客分子形成络合物。CD可用于增溶或包封药物、香料和芳香剂，参见Szejtli，J.，Chemical Reviews，(1998)，98，1743-1753和Szejtli，J.，J.Mater.Chem；(1997)，7，575-587的描述。
有关环糊精毒性、诱变性、致畸性和致癌性的详尽研究[Rajewski，R.A；Stella，V.，J.Pharmaceutical Sciences，(1996)，85，1142-1169]表明，它们是低毒性的，尤其是羟丙基-β-环糊精，参见Szejtli，J.，环糊精的性能和应用，Drug investing.，2(增刊4)11-21，1990中的描述。除了一些高浓度的衍生物对eritrocites有危害之外，这些产品通常对健康是无害的。一些国家日本和匈牙利已批准环糊精作为食品添加剂的应用，在法国和丹麦还批准了更多特殊的应用。此外，还可通过再生性酰胺的降解来源获得环糊精。所有这些特征促使人们加大了对其新应用的研究。CD分子的结构类似于截锥形，近似Cn轴对称(approximatelysimmetry)。primary hydroxilas通过与分子内氢连接而位于锥体的最窄侧，这使其具有足够的变形性而不拘于规则形状。根据其极性、尺寸、生理活性等，可对已知的环糊精衍生物进行分类。按照其实际应用，可分为以下几类1).生物活性物质载体(增溶剂、稳定剂)；2).酶模型；3).分离剂(色谱法或分批法)；4).催化剂和添加剂(例如去垢剂、粘度改善剂等)，L.Szente和J.Szejtli.，Adv.Drug Deliv.Rev.36(1999)17。CD在水、甲醇和乙醇中具有中等溶解度，易溶于极性溶剂例如二甲亚砜、二甲基甲酰胺、N，N-dimetylacetamide e piridine。许多文献报道，通过环糊精包合化合物，提高了难溶于水的客分子在水中的溶解度，参见Szejtli，J.，Chemical Reviews，(1998)，98，1743-1753和Szejtli，J.，J.Mater.Chem，(1997)，7，575-587中的描述。为了设计给药系统(DDS)，对多种高性能载体进行了研究，以使其能在必要的时段内高效并准确地将必要量的药物传递至靶点。环糊精、生物可降解或不能生物降解聚合物、脂质体、乳剂、复乳可以改变客分子的物理学、化学和生物学特性，因此是完成上述任务的潜在选择物。
除了环糊精以外，已对许多给药系统进行了研究，这包括聚合物微囊、微粒、脂质体和乳剂。其中许多系统是由合成的可生物降解聚合物例如聚酐和聚(羟酸)制得的。在这些系统中，所述药物掺入聚合物微球中，每日施用较少和可控的剂量，可在机体内部释放药物达数天、数月或数年。
已在控释系统中试验了一些聚合物。例如具有弹性的聚氨酯，具有良好绝缘性能的聚硅氧烷或聚硅，具有物理力的聚甲基-metacrilate，具有疏水性和电阻的聚乙烯醇，具有硬度和不透过性的聚乙烯(Gilding，D.K；可生物降解聚合物，Biocompat.Clin.Impl.Mater.2209-232，1981)。已对生物降解聚合物和生物相容性聚合物进行了广泛研究，这类聚合物由于其可经表面降解而适于用作控释系统载体。这类聚合物选自聚(2-hidroxi-ethylmetacrilate)、聚丙烯酰胺、乳酸聚合物(PLA)、羟酸聚合物(PGA)、和相应的共聚物(PLGA)和聚(anidrides)，参见Tamada和Langer，J.Biomater.Sci.Polym.Edn，3(4)315-353的描述。
本发明制剂还可包括其它组分，例如可药用赋形剂。例如，可采用欲治疗动物能耐受的赋形剂配制本发明制剂。赋形剂还可包含少量的添加剂，例如那些能增强等渗剂和缓冲剂化学稳定性的物质。标准制剂可以是液态的注射剂或能分散于适宜液体成为混悬剂或注射用溶液的固体或口服制剂。适宜的控释载体包括但不限于生物相容性聚合物，其它聚合基质，胶囊，微囊，毫微囊，微粒，纳米粒，浓注制剂，渗透泵，扩散装置，脂质体，脂质粒(liposphere)和经皮给药系统，可埋植或不可埋植的。
近年来，已对一些给药系统进行了研究，旨在改善药物吸收以提高药物稳定性并靶向特定细胞群。这些研究已开发出一些以环糊精、乳剂、脂质体和聚合物作为药物运载和传递体为基础的产品。这些产品可经肌内、静脉内、皮下注射、口服、吸入或能埋植的装置施用。
脂质体是类脂泡囊，包括水性内室，其中包封有分子例如药物，目的是使药物在个体施用后能控制释放。
许多不同的技术适于制备脂质体[专利US4,552,803，Lenk；US4,310,506，Baldeschwieler；US4,235,871，Papahadjopoulos；US4,224,179，Schneider；US4,078,052，Papahadjopoulos；US4,394,372，Tailor；US4,308,166，Marchetti；US4,485,054，Mezei；和US4,508,703，Redziniak；Woodl和Papahadjopoulos，Methods Enzymol.171193-215(1989)]。单室泡囊具有单层膜[Huang，Biochemistry 8334-352(1969)]，而多室泡囊(MLVs)具有多层同心膜[Bangham等，J.Mol.Biol.13238-252(1965)]。Bangham的方法[J.Mol.Biol.13238-252(1965)]可生产出“普通MLVs”，即溶质在水性室间呈不均匀分布，因此渗透压不同。Lenk等(US4,522,803；US5,030,453和US5,169,637)、Fountain等(US4,588,578)、Cullis等(US4,975,282)和Gregoriadis等(WO99/65465)，介绍了制备溶质基本上均匀分布于不同室间的MLVs方法。相似的溶质分布于不同室中，这意味着药物包封率更大且渗透压差异更小，这使得这些MLVs比普通MLVs更稳定。对MLVs进行超声处理[Papahadjopoulo等(1968)]或经聚碳酸酯膜挤出[Cullis等(US5,008,050)和Loughrey等(US5,059,421)]，可制得单室囊泡。
适宜的类脂例如包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、心磷脂、胆固醇、磷脂酸、神经鞘脂、糖脂、脂肪酸、固醇、磷脂酰乙醇胺、以其聚合或非聚合形式的可聚合类脂，或这些类脂的混合物。
可对脂质体的成分进行处理，使之适于特定器官或细胞类型。根据结构因素或者根据其与环境的相互作用机制，可对脂质体的靶向加以分类。所述结构分类是基于其选择性的水平，例如器官特异性或细胞特异性。从其机制方面考虑，靶向可分为被动或主动靶向。
被动靶向是指常规脂质体自然地可被网状内皮系统(即主要是肝、脾、和骨髓中的固定巨噬细胞)捕获。立体稳定的脂质体(也称“PEG-脂质体”)的特点在于其从血循环中的清除速度降低[Lasic和Martin，隐形脂质体(Stealth liposomes)，CRC出版公司，Boca Raton，Fla.(1995)]。PEG-脂质体上的聚乙二醇聚合物能与一些磷脂的头基结合，这样就降低了脂质体与血浆蛋白例如调理素之间的相互作用，并且还降低被细胞摄取的速率。与常规脂质体相比，能形成立体屏障的脂质体可在循环中保持更长时间[Lasic和Martin，隐形脂质体，CRC出版公司，Boca Raton，Fla.(1995)；Woodle等，Biochim.Biophys.Acta1105193-200(1992)；Litzinger等，Biochim.Biophys.Acta 119099-107(1994)；Bedu Addo等，Pharm.Res.13718-724(1996)]。经PEG-脂质体包封后，许多化学治疗剂[Lasic和Martin，隐形脂质体，CRC出版公司，Boca Raton，Fla.(1995)]、和生物活性肽[Allen T.M；脂质体新系统及其应用中的新趋势(F.Puisieux，P.Couvreur，J.Delattre，J.-P.Devissaguet编辑)，Editions de la Sante，法国，1995，125页]的效力均得到了改善。
该领域的研究表明PEG-脂质体的效力受不同因素的影响。理想的是，囊泡的直径应低于200nm，PEG单元的数量约为2.000和PEG化类脂的比例为3-5mol％[Lasic和Martin，隐形脂质体，CRC出版公司，Boca Raton，Fla.(1995)；Woodle等，Biochim.Biophys.Acta 1105193-200(1992)；Litzinger等，Biochim.Biophys.Acta 119099-107(1994)；Bedu Addo等，Pharm.Res.13718-724(1996)]。
通过使脂质体与配体(liguand)，例如单克隆抗体、糖类、糖脂、蛋白质、聚合物结合，或改变类脂组成或脂质体尺寸，来实现活性靶向，使脂质体靶向到不同于常规脂质体蓄积的器官和细胞上。
以脂质体为基础的载体已被用于负载多种药理活性的物质，例如包括抗生素、激素和抗肿瘤剂[脂质体的医药应用(D.D.Lasic，D.Papahadjopoulos编辑，Elsevier Science B.V.，荷兰，1998]。
Ang-(1-7)类似物在许多疾病(包括心血管病)中具有很大的研究和治疗潜力。与RAS相关的另一重要方面是加强对其生理学作用的深入认识，以开发出新的治疗策略。然而，对于大多数抗高血压药物，尤其是生物活性肽，例如血管紧张素及其衍生物而言，由于肽较短的半衰期，常规给药方式受到了限制。在这方面，本发明的特征在于利用脂质体、环糊精和可生物降解聚合物作为血管紧张素及其衍生物的控释系统，从而提高其生物利用度、持续时间和生物学作用的强度。
本发明制剂的特征在于使用了Ang-(1-7)和/或类似物可接受的药用赋形剂混合物。示例性赋形剂包括水、盐水溶液、缓冲的磷酸盐溶液、Ringer溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液、含有或不含聚乙二醇的生物相容的盐水。还可采用非水性载体，例如不挥发油、芝麻油、油酸乙酯、或甘油三酯。其它有用的制剂包括能增强粘滞的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖。
赋形剂也可包含少量的添加剂，例如增强物质或缓冲剂的等渗性和化学稳定性的物质。示例性缓冲剂包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而示例性防腐剂包括硫柳汞(timerosal)、间-或邻甲酚、福尔马林和苄基醇。制剂可以是液态或固态。对于非液态制剂，赋形剂包括葡萄糖、人血清白蛋白、防腐剂等，可在施用前加入水或无菌盐水溶液。
本发明的特征还在于制备包含Ang-(1-7)和/或其类似物的控释系统，用于与G蛋白-偶联受体MAS的配体-受体相互作用。令人满意的控释系统包括但不限于环糊精、生物相容聚合物、可生物降解聚合物、其它聚合物基质、胶囊、微囊、微粒、浓注制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质粒和经皮给药系统。本发明其它控释组合物包括液态组合物，它在经历温度改变过程中原位形成固体或凝胶。
MAS受体(Young，D；Waitches，G.，Birchmeier，C；Fasano，O.，和Wigler，M.，分离和表征具有多重潜在跨膜区段的新的细胞癌基因编码蛋白，Cell(1986).45711-719)，最初被描述为血管紧张素II受体(Jackson，T.R；Blair，A.C；Marshal，J.，Goedert，M. & Hanley，M.R.，MAS肿瘤基因编码血管紧张素受体，Nature 335，437-440(1988))，然而随后的研究表明这种假说是不正确的(Ambroz，C；Clark，A.J.L.&Catt，K.J.，MAS癌基因在含有预成血管紧张素II受体的细胞中增强了血管紧张素诱导的[Ca2+]i反应，Biochem.Biophys.Acta 1133，107-111(1991))。这种蛋白在脑和其它组织中被表达(Bunnemann，B；Fuxe，K；Metzger，R；Mullins，J.，Jackson，T.R；Hanley，M.R. & Ganten，D.，采用原位杂交在成年大鼠脑中放射自显影定位MAS原癌基因mRNA，Neurosci.Lett.114，147-153(1990))。在文献中没有描述MAS与血管紧张素-(1-7)或其类似物的相互作用。
本发明的特征在于利用环糊精和/或其衍生物获得(obtention)了七肽血管紧张素-(1-7)和/或其衍生物的控释系统，减少了肽在胃肠道治疗(TGI)中的降解，肽在生物系统中呈现出更大的生物分配性(biodisponibility)。本发明的特征在于利用生物可降解聚合物、脂质体或这些系统与环糊精的混合物，获得了七肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物的控释系统，提高了肽的生物分配性。
迄今为止，现有技术中没有关于七肽血管紧张素-(1-7)其类似物、激动剂和拮抗剂与环糊精或其衍生物、可生物降解聚合物或脂质体结合的描述。
通过以下实施例可更好地理会本发明实施例1该实施例描述空间稳定脂质体包封的Ang-(1-7)的制备，以及以这种包封形式施用时Ang-(1-7)生物利用度的改善。
根据Kirby和Gregoriadis的方法[Biotechnology2979-984(1984)]，将Ang-(1-7)包封于脂质体中，然后通过200nm孔径的聚碳酸脂膜挤出脂质体混悬物[Nayar等，Biochim.Biophys.Acta.986200-206(1989)]。然后，经透析将包含肽的脂质体与未包封的肽分离，最终通过0.22微米无菌的膜进行过滤灭菌。类脂组成可选择摩尔比为5∶4∶0.3的二硬脂酰-磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)。利用内荧光测定被包封肽Ang-(1-7)的量。包封率为12％，肽/类脂比例为0.03(p/p)。通过动态光散射技术测定脂质体的尺寸。测得囊泡平均直径为0.19微米。
通过缓慢插入Wistar鼠脑中的针头(30G)，将包含Ang-(1-7)的脂质体(LAng)经延髓头端腹外侧(RVLM)单侧微注射(200nL，含35ngAng-(1-7))。同样，也将相同类脂剂量的空脂质体(LEmp)微注射。微注射之前4天和之后12天，经遥测测定了能自由移动的未被干扰动物的平均动脉血压(MAP)。微注射Lang在白天产生了显著的加压效应并保持5天。在第3天即达到最高MAP(114±4mmHg)，这明显不同于0天时的记录(100±3mmHg)。正如所预料的，LEmp没有使MAP产生显著变化(第3天时为94±5mmHg，而在0天时为90±5mmHg)。此外，在1、2和3天，LAng组的白天MAP显著高于Lemp组。与白天MAP相反的是，微注射LAng对夜间MAP的影响不显著。
在先研究确认，在RVLM中微注射相似剂量(25-50ng)的游离Ang-(1-7)(未包封)，使PAM提高了15mmHg并保持约10分钟。这种短效作用归因于游离形式肽的代谢作用增加。
因此，本发明技术确认了RVLM水平的Ang-(1-7)在慢性状态下的加压效应。本发明技术的特征还在于其具有提高肽生物利用度的能力。
实施例2制备以可生物降解聚合物(PLGA)为基础的肽Ang-(1-7)控释微球首先制备乳剂，包括溶于二氯甲烷中的聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)的有机相，和含有1.8mg Ang-(1-7)的水相。然后，将乳剂超声波半分钟，并加至1％(PVA)溶液中，形成另一乳剂，该乳剂搅拌1分钟成完全匀化的微乳。该体系在不加热条件下搅拌2小时，至溶剂蒸发出去。混合物离心2至3次，用水洗涤3次除去表面吸附的PVA，最后重新混悬于2mL水中并冻干。然后热分析和用扫描电子显微术SEM表征固体微球。微球DSC曲线显示有玻璃转化现象，这与在PLGA聚合物中观察到的现象类似。SEM显微照片显示粒度为50微米。这也验证了微球的多孔表面现象。采用放射免疫法(radioimunoensaio)[Neves等，Biochem.Pharmacol.(1995)501451-1459]，测定了包封的肽。包封了15％的肽。动力学曲线显示在8小时内释放了60％的肽，在48小时内了大约释放90％。
实施例3 制备Ang-(1-7)的α-环糊精包合物采用等摩尔比例的环糊精和Ang-(1-7)制备。简言之，经搅拌和加热，将-环糊精和/或其衍生物溶于水中。然后，将相应量的血管紧张素-(1-7)加至该水溶液中。溶解之后，混合物经液氮冷冻并冻干，获得干固体。采用FT红外光谱、热分析(TG/DTG和DSC)、X-射线衍射和1H和13C NMR光谱和T1驰豫时间，对所得固体进行物理-化学表征。
实施例4该实施例描述了鉴定血管紧张素-(1-7)及其类似物与G蛋白-偶联受体MAS之间相互作用的方法。
将用125I标记的血管紧张素-(1-7)或罗丹明-血管紧张素-(1-7)、荧光素与来源于正常或MAS基因剔除动物的鼠肾切片孵育。经可调间隔4℃孵育后，将切片暴露于放射自显影膜或经荧光显微镜分析。在基因剔除鼠中，血管紧张素-(1-7)的特异结合消失，而对照物Ang II或Ang IV的结合没有变化。野生型鼠肾切片中结合的Ang-(1-7)被类似物Ala7-血管紧张素-(1-7)e D-Pro7-血管紧张素-(1-7)取代。采用水利尿模型(给予5％体重的H2O)，进行基因剔除鼠中没有结合的功能试验。经Ang-(1-7)(4μmol/10g体重)处理的野生型鼠，其尿量减少(抗利尿作用)。Ang-(1-7)在MAS基因剔除鼠中没有抗利尿作用。
权利要求
1.制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素(1-7)的制剂的方法，特征在于采用环糊精、环糊精衍生物、脂质体、可生物降解聚合物、可生物降解聚合物衍生物或这些系统的混合物。
2.根据权利要求1的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其激动剂和拮抗剂的制剂的方法，特征在于采用可药用赋形剂混合物，包括水、盐水、缓冲溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液、生物相容的盐溶液、含或不含聚乙二醇、非水性载体例如油类、芝麻油、etiloleate、甘油三酯、羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或extran、硫柳汞、间-或邻-甲酚、福尔马林和苄基醇、血清白蛋白。
3.根据权利要求1和2的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素(1-7)的制剂的方法，特征在于其用于研究和治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，创伤、烧伤、红斑(erithema)、肿瘤、糖尿病、精子活动度、肾病、胃肠道和妇科病症，血管生成、血管成形术、脱发和血液病。
4.制备制剂的方法，特征在于使选自alquil、hydroxialquil、hydroxipropil和酰基，或交联的环糊精或环糊精聚合物的有机-水性环糊精溶液或其环糊精衍生物与肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的有机-水性溶液混合。
5.制备制剂的方法，特征在于混合选自alquil、hydroxialquil、hydroxipropil和酰基，或交联环糊精或环糊精聚合物的有机-水性环糊精溶液或其环糊精衍生物与有机-水性溶液，其特征在于其用于研究和治疗动脉高血压及其他心血管疾病和其并发症、创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管生成，血管成形术，脱发和血液病。
6.根据权利要求1和2的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素(1-7)的方法，特征在于其用于研究和治疗温血动物的皮肤损伤，创伤，烧伤，红斑，肿瘤，妇科病症，血管生成，血管成形术，脱发和血液病。
7.根据权利要求1和2的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的方法，特征在于增加了其作用的持续时间和/或效力。
8.根据权利要求1和2的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素(1-7)的方法，特征在于增加了其用于研究和治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管成形术，脱发和血液病的作用持续时间和/或效力。
9.根据权利要求2的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的方法，特征在于增加这些物质的生物分配性。
10.制备A-779(D-Ala7-血管紧张素-(1-7))和/或类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于使用环糊精、环糊精衍生物、脂质体、可生物降解聚合物、可生物降解聚合物的衍生物或这些系统的混合物。
11.根据权利要求10的制备肽D-Ala7-血管紧张素-(1-7)(A-779)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于其用于研究和治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管生成，血管成形术，脱发和血液病。
12.根据权利要求10的制备肽D-Ala7-血管紧张素(1-7)(A-779)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于增加了这些物质的生物分配性。
13.根据权利要求2的制备D-Pro7-血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于使用环糊精、环糊精衍生物、脂质体、可生物降解聚合物、可生物降解聚合物的衍生物或这些系统的混合物。
14.根据权利要求2和13的制备D-Pro7-血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于其用于研究温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，用于研究和治疗创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管生成和血管成形术。
15.根据权利要求13的制备D-Pro7-血管紧张素(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于增加了其作用的持续时间和/或效力。
16.根据权利要求13的制备D-Pro7-血管紧张素(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于增加了这些拮抗剂的生物分配性。
17.根据权利要求2、4、5的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的方法，特征在于经口服、肌内、静脉内、皮下、局部、吸入(肺、鼻内、颊内)途径或能植入或注射的装置施用，用于研究或治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，创伤，烧伤，红斑，肿瘤，脱发，血液病，糖尿病，精子活动度，肾病、胃肠道和妇科病症，血管生成和血管成形术。
18.根据权利要求2、5、10的制备D-Ala7-血管紧张素-(1-7)(A-779)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于经口服、肌内、静脉内、皮下、局部、吸入(肺、鼻内、颊内)途径或能植入或注射的装置施用，用于研究或治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，创伤，烧伤，红斑，肿瘤，脱发，血液病，糖尿病，精子活动度，肾病、胃肠道和妇科病症，血管生成和血管成形术。
19.根据权利要求2、5、13的制备D-Pro7-血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于经口服、肌内、静脉内、皮下、局部、吸入(肺、鼻内、颊内)途径或能植入或注射的装置施用，用于研究或治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，创伤，烧伤，红斑，肿瘤，脱发，血液病，糖尿病，精子活动度，肾病、胃肠道和妇科病症，血管生成、血管成形术、脱发和血液病。
20.制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的方法，特征在于鉴定G蛋白-偶联受体MAS与包封或未包封非制剂形式的血管紧张素-(1-7)及其类似物和衍生物之间的配体-受体或类似相互作用，用于研究心血管、肾、生殖、皮肤学、肿瘤、血液或脑疾病。
21.根据权利要求2、13、19、20的制备D-Pro7-血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于其用作MAS受体的拮抗剂。
22.根据权利要求2、10、18、20的制备D-Ala7-血管紧张素-(1-7)(A-779)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于其用作MAS受体的拮抗剂。
23.根据权利要求1、2、4、5、17、20的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的制剂的方法，特征在于其用作MAS受体的激动剂。
24.根据权利要求2、13、19、20的制备D-Pro7-血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于作为MAS受体的拮抗剂，并用于研究温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，和用于研究以及治疗创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管生成，脱发、血液病和血管成形术。
25.根据权利要求2、10、18、20的制备D-Ala7-血管紧张素-(1-7))(A-779)和/或其类似物和衍生物的制剂的方法，特征在于作为MAS受体的拮抗剂，并用于研究温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症，和用于研究以及治疗创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管生成，脱发、血液病和血管成形术，。
26.根据权利要求1、2、4、5、17、20的制备肽血管紧张素-(1-7)和/或其类似物和衍生物包括Sar1-血管紧张素-(1-7)的制剂的方法，特征在于作为MAS受体的激动剂，并用于研究和治疗温血动物的动脉高血压及其他心血管疾病及其并发症、创伤，烧伤，红斑，肿瘤，糖尿病，精子活动度，肾病，胃肠道和妇科病症，血管生成，血管成形术，脱发和血液病。
全文摘要
描述了新颖的D－Ala
文档编号A61K47/04GK1599620SQ02824013
公开日2005年3月23日 申请日期2002年11月5日 优先权日2001年11月5日
发明者R·D·S·米伦, R·A·S·多斯桑托斯, F·J·G·弗雷扎德, A·P·纳杜 申请人:米纳斯吉拉斯联合大学