专利名称：一种京尼平酸龙胆二糖苷药物化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从中药栀子中提取的单一活性成分——京尼平酸龙胆二糖苷及其制备方法，属于中药技术领域。
栀子是茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的果实，性苦寒，无毒。入心、肝、肺、胃经。能清热泻火、凉血。主治热病虚烦不眠、黄疸、淋病、消渴、目赤、咽痛、吐血、衄血、血痢、尿血、热毒疮疡、扭伤肿痛。临床用于急性黄疸型肝炎、止血、扭挫伤等疾病。焦栀子凉血止血，用于血热吐衄，尿血崩漏。
现代研究发现，栀子属植物中含有许多的化学成分，如黄酮类(栀子素类)、环烯醚甙类(栀子甙类)、三萜类(栀子花酸类)、有机酸酯类(绿原酸、藏红花酸类等)，另外还含有D-甘露醇、甾醇类、三萜皂甙类、长链烷烃、醇及色素等。在果实和茎叶花中还含有挥发油、多糖等成分。
中药复方清开灵的主要功效是清热解毒、醒神开窍。它主要由牛黄、珍珠母、板蓝根、水牛角、黄芩、栀子、金银花等组成。其中栀子的主要功效是清热降火，苦寒，归心、肺、三焦经，是其中的主要药味，复方中与黄芩功效相似，二者相须而用。作为药材，栀子的基本成分与作用已有较多的研究，不同的组分群在动物药效实验中显示出不同的活性。目前，栀子在清开灵中的具体入药形式大致包括环烯醚萜、有机酸和色素三大类成分的提取物，主要通过水提醇沉的方式配伍入药。目前已有的研究仅在个别药效实验中发现栀子具有一定功效，起到了一定保护、调和的作用。
本发明提供的一种京尼平酸龙胆二糖苷药物化合物，其化学结构式
本发明的药物化合物可按如下步骤制备(1)首先将中药栀子制备成水溶性提取物，然后使水溶性提取物经大孔树脂柱层析，用水洗脱；(2)用30～50％乙醇水溶液继续洗脱，收集乙醇洗脱液，调节洗脱液的pH7.5～14；(3)将步骤(2)中的乙醇洗脱液蒸发去醇，再将pH调至7.5以下，经大孔树脂层析，用10～20％的乙醇洗脱、蒸干即得该化合物。
上述步骤(1)中所述的水溶性提取物，是将栀子用水，不同浓度乙醇、甲醇或丙酮提取的溶液；其水溶性提取物的pH值可控制在6.5以下或在上述步骤(2)中将洗脱用的乙醇水溶液的pH值可控制在7.5以下。
本发明中还可以采用如下方案将步骤(1)中的水溶性提取物的pH值控制在6.5以下，同时将步骤(2)中洗脱用的乙醇水溶液的pH值控制在7.5以下。
本发明的制备方法中，所述的大孔树脂可采用D101型大孔树脂或AB-8型大孔树脂。
本发明提供的药物组合物，是以京尼平酸龙胆二糖苷为活性组分组成的药物组合物。
本发明还提供了一种以京尼平酸龙胆二糖苷为活性组分在治疗缺血、缺氧引起的脑损伤和血管损伤疾病药物中的应用。
本发明针对栀子成分复杂、质量控制难的问题，经过提取、分离和转化，从中药栀子的提取物中获得一种具有生物活性的微量单一成分，创制质量控制简单，疗效确切、机理明确的新原料药。目标化合物为白色粉末，纯度85％-99％，经现代波谱学鉴定，其结构为京尼平酸-1-O-龙胆二糖苷。药理实验表明，以该药物化合物为活性组分的药物组合物在治疗缺血、缺氧引起的脑损伤和血管损伤疾病中有较好的作用。与黄芩苷、珍珠母和胆酸配伍，对血管内皮细胞和缺血脑神经细胞的保护作用强于栀子总提取物、栀子有效部位与上述中药的配伍。可作为与上述三味药材配伍的中药新药的原料药。
综上所述，化合物(I)的结构为京尼平酸-1-O-龙胆二糖苷。(I)的结构式见图I；H-H偶合关系与C-H偶合关系见图II(箭头表示相关关系)；主要远程相关关系见图III(箭头表示相关关系)。
表1化合物(I)的1H-NMR和13C-NMR全归属及其与京尼平苷的对比序号H(京尼平苷) H(I) Cδ(ppm) 峰型 偶合常 δ(ppm) 峰型 偶合常 京尼平苷 (I)15.11 d 6.8 5.11 d 6.8 95.6 96.537.46 s 7.41 s 151.5151.04- - - -- - 110.9111.253.06 m 3.06 m 34.4 34.96a dd 0.8，7.82.10 dd0.8 37.9 38.06b 2.05 dd 7.8，7.02.65 dd7.0.
72.68 d 0.8 5.70 s 125.4126.18- 144.0144.092.64 dd 7.0，6.82.57 dd7.0.6.8 45.8 45.510a 4.14 dd 14.6，5.1 4.00 Broad 14.659.3 59.410b 3.97 dd 14.6， 4.12 Broad 14.611 -- 166.8168.0OMe 3.64 s 50.9C11OOH /11.9 s1′ 4.53 d 7.87.8 4.53 d 7.8 98.5 98.92′ 2.98 m 3.04 m 69-7770-773′ 3.10 m 3.16 m 69-7770-774′ 3.42 m 3.00 m 69-7770-775′ 3.67 m 3.00 m 69-7770-776a′ 2.98 m 3.63 m 60.9 68.06b′ 3.11 m 3.43 m1″ 4.21 d 7.8 103.22″ 2.89 m 70-773″ 3.0-3.2 m 70-774″ 3.0-3.2 m 70-775″ 3.0-3.2 m 70-776a″ 3.55 m 61.06b″ 3.42 m 实施例1干燥栀子果实2.5kg，70％乙醇10升回流40分钟。醇液浓缩至无醇，制备水溶性提取物，过大孔树脂AB-8，柱径长比为60mm×900mm，流速30ml/min。分别用水、50％乙醇(pH5.0)洗脱，醇洗脱液调节pH至7.5，40℃减压浓缩，中和至pH4.0，去醇经大孔树脂柱AB-8，柱径长比为30mm×500mm，15％乙醇洗脱，干燥；95％乙醇重结晶，得京尼平酸龙胆二糖苷3.37g，纯度88.6％(HPLC-MS检测，归一化法定量)。
实施例2干燥栀子果实2.3kg，清水20升浸泡过夜，煮沸后继续加热20分钟。尼龙网过滤。滤液浓缩至1升，加95％乙醇至醇浓度60％；过滤、浓缩，去乙醇，制成水溶性提取物。过大孔树脂D101，柱径长比为60mm×900mm，流速30ml/min。分别用水、30％乙醇洗脱，调节洗脱液pH至14。醇洗脱液常压蒸发去除其中的乙醇，调节pH值6.0，经大孔树脂柱，柱径长比为30mm×500mm，15％乙醇洗脱，树脂为三菱SP20，其余处理同1，得京尼平酸龙胆二糖苷3.31g，纯度55.3％。
实施例3干燥栀子果实2.3kg，甲醇提取。树脂为D101，柱径长比为60mm×900mm，上样前PH调节至4.5-5.0，分别用水、30％乙醇(pH6.5)洗脱，醇洗脱液调节pH至8.3，50℃减压浓缩，调节pH值7.5，经大D101孔树脂柱，柱径长比为500mm×30mm，15％乙醇洗脱，其余处理同1，得京尼平酸龙胆二糖苷2.83g，纯度64.0％。
实施例4干燥栀子果实2.7kg，50％丙酮水溶液回流提取。其余处理同1，得京尼平酸龙胆二糖苷2.71g，纯度54.0％。
纯度测定HPLC/DAD分析。流动相20％甲醇-水，检测波长248nm。
实施例5生物活性实验复方“清开灵”阻抑脑缺血级连反应的多环节作用，突出表现在胆酸、黄芩苷、栀子提取物、珍珠母水解液的配伍当中。这些药物配伍在抑制脂质过氧化反应对脑微血管内皮细胞和神经元的损伤方面具有较好的作用，同时，在调控神经生长因子产生而保护神经元抵抗损伤方面也显示了作用优势。为进一步确定化合物(I)的功效，进行了以下的实验工作。
以Waster大鼠制作MCAT(Middle Cerebral Artery Thrombosis MCAT)脑梗塞模型，比较前述四部分不同配伍的生物效应，测定脑组织SOD、MDA、NOS含量。以清开灵全方为对照，共观察了三种配方，其中，A方为栀子药材总提取物的配伍，B为栀子的含栀子苷的有效组分的配伍，C方为京尼平酸龙胆二糖苷的配伍。组方比例按清开灵原方折合，C方的具体组成为1000毫升溶液含胆酸3.25克，黄芩苷5.0克，京尼平酸龙胆二糖苷10毫克，珍珠母50克；用药量为注射1毫升每千克体重。结果如表1表1京尼平酸龙胆二糖苷活性试验结果
与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01A方为栀子药材总提取物的配伍，B为栀子的含栀子苷的有效组分的配伍，C方为京尼平酸龙胆二糖苷的配伍A、B、C三方对于脑组织MDA含量均具有显著的降低作用，C方组的作用最为突出；对NOS的影响上，清开灵组、A方组、C方组均有显著作用，以前两者最为突出。但是，从微血管调节功能出发，NO即是一种导致神经元损伤的介质，也是一种重要的微血管调节物质，在缺血性病理过程的一定阶段有其积极的生理学意义。可以认为，对于缺血损伤特别是脂质过氧化反应过程这一重要环节来说，C方组意义更大。
权利要求
1.一种药物化合物京尼平酸龙胆二糖苷，其化学结构式
2.一种制备如权利要求1所述药物化合物的方法，该方法可按如下步骤制得(1)首先将中药栀子制备成水溶性提取物，然后使水溶性提取物经大孔树脂柱层析，用水洗脱；(2)用30～50％乙醇水溶液继续洗脱，收集乙醇洗脱液，调节洗脱液的pH7.5～14；(3)将步骤(2)中的乙醇洗脱液蒸发去醇，将pH调至7.5以下，经大孔树脂层析，用10～20％的乙醇洗脱、蒸干即得该化合物。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的水溶性提取物，是将栀子用水，不同浓度乙醇、甲醇或丙酮提取的溶液。
4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中将所述的水溶性提取物的pH调至6.5以下。
5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的乙醇水溶液的pH值为7.5以下。
6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的乙醇水溶液的pH值为7.5以下。
7.按照权利要求2～6任一权利要求所述的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。
8.按照权利要求2～6任一权利要求所述的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
9.一种药物组合物，其特征在于其中含有如权利要求1所述的药物化合物。
10.以权利要求1所述的药物化合物为活性组分在治疗缺血、缺氧引起的脑损伤和血管损伤疾病药物中的应用。
全文摘要
一种京尼平酸龙胆二糖苷药物化合物及其制备方法，涉及一种单一活性成分的药物化合物。本发明以栀子的水溶性提取物为原料，经第一步柱层析分离水溶性杂质，获得转化原料，再经过转化和第二次柱层析获得目标化合物的初提物，然后经纯化即得目标化合物。将京尼平酸龙胆二糖苷药物化合物与黄芩苷、珍珠母和胆酸配伍，对血管内皮细胞和缺血脑神经细胞的保护作用强于栀子总提取物、栀子有效部位与上述中药的配伍。
文档编号A61K31/7048GK1446816SQ0310912
公开日2003年10月8日 申请日期2003年4月4日 优先权日2003年4月4日
发明者罗国安, 肖盛元, 王义明 申请人:清华大学