专利名称：一种诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用胰岛细胞与神经细胞具有相似发育机制的特点，分阶段诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化，并将获得的细胞植入糖尿病患者体内治疗糖尿病的方法。
背景技术：
近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的应用。干细胞作为一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞，已经逐渐成为人们寻找胰岛细胞的新资源。
骨髓间充质干细胞(MSC)易于分离培养扩增，遗传背景稳定，体内植入反应较弱，在特定的诱导条件下可分化为多种中胚层组织细胞，还可跨胚层分化为神经细胞。利用神经细胞与胰岛细胞发育的相似性，诱导间充质干细胞向胰岛细胞分化是寻找胰岛细胞来源的重要途径。
近年来，随着胚胎干细胞的建系，神经干细胞体外扩增方法的建立，胰腺干细胞的培养、扩增方法的建立等，使得体外操纵干细胞成为可能。另外，各种营养素和细胞因子功能的揭示，促胰腺增殖分化基因的发现与克隆等，又使我们可以在体外部分模拟体内的胰腺发育微环境，对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化、功能激活与调控及目的基因转染等，以获得大量胰岛样细胞，满足临床所需，并为与之相关的药物开发和筛选提供了一种新的模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得大量胰岛样细胞团以用于糖尿病细胞治疗的方法。采用以下技术方案1)分离、培养及扩增骨髓间充质干细胞利用骨髓间充质干细胞的密度特性及粘附在培养皿上的特性，达到分离纯化扩增骨髓间充质干细胞的目的。
2)本发明的重要内容是分两阶段诱导骨髓间充质干细胞分化通过添加特异的神经生长因子，诱导骨髓间充质干细胞分化为nestin阳性的胰岛干、祖细胞，再添加促进胰岛增殖分化的几种重要因子诱导nestin阳性的细胞分化为胰岛样细胞。
3)将获得的胰岛样细胞以一定数量植入糖尿病患者体内(肾包囊下或经肝门脉移植)，可以发挥一定的降血糖作用。
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的诱导分化方法。
具体实施例方式
实施例1、骨髓间充质干细胞的分离培养和扩增无菌条件下，挤出肋骨中的骨髓，肋骨可以由非血液系统疾病胸外科手术后获得；或由非血液系统疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓，约5ml。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(GIBICO)充分混合，1500r/min离心5min，弃上清，再加入5mL完全培养液混匀后轻轻叠加到密度为1.073的percoll分离液上，1500r/min离心20min，取白细胞膜层以上的部分，加入完全培养液洗两遍。按1×106/mL密度接种于完全培养基中，置37℃，5％CO2饱和湿度的孵箱中培养。培养72h后更换培养液，以后每4d换液一次。细胞达80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3传代继续扩增培养。
实施例2、分两阶段诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化第一阶段的诱导取培养的骨髓间充质干细胞按2×104/mL密度接种于6孔板中，每孔加2.5mL诱导液1。诱导液1的配方为添加10ng/mL或20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF，10ng/mL或20ng/mL表皮细胞生长因子EGF及2％B27的IMDM培养液。MSC经诱导液1诱导3天后，逐渐分化为nestin阳性的胰腺干、祖细胞。此阶段的细胞可以反复传代培养几周至几月。第二阶段的诱导取第一阶段诱导分化出的nestin阳性的细胞，去除旧培养液，用PBS缓冲液洗细胞，添加诱导液2。诱导液2的配方为添加10mmoL/L尼克酰胺，10ng/mLβ细胞调节素Betacellulin，10ng/mL活化素Activin A和10ng/mL肝细胞生长因子HGF或胰高糖素样肽GLP-1 10nmol/L的2％B27的IMDM培养液(或添加一定葡萄糖浓度的DMEM培养液)，继续培养一周。
实施例3、胰岛样细胞团的鉴定利用RT-PCR鉴定nestin，ngn3(neurogenin3)，IPF-1，胰岛素，胰高血糖素基因的表达。利用primer 3软件设计基因引物，序列如下
结果表明经第一阶段诱导的细胞(1周)强表达nestin及ngn3基因，微弱表达IPF-1，胰岛素，胰高血糖素基因。第二阶段诱导的细胞中nestin及ngn3基因的表达逐渐减弱至消失，高表达IPF-1，胰岛素，胰高血糖素基因。
利用免疫组化鉴定nestin、胰岛素、胰高血糖素抗原的表达。结果显示第一阶段诱导的细胞表达nestin，第二阶段诱导的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素蛋白。
利用放射免疫分析法检测胰岛素水平。挑取第二阶段诱导的细胞团，置24孔板中，分3孔，每孔约90～100个细胞团，直径约150μm。各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液，置37℃孵箱中孵育1h。弃掉旧缓冲液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液依次孵育1h，收集上清。收集各孔的细胞团，加入酸乙醇溶液，4℃过夜，用细胞超声破碎仪破细胞，上清保存于-20℃。用放射免疫分析法检测各上清中的胰岛素含量。用BCA(Bicinchoninic acid)测定法检测细胞内总蛋白含量。结果诱导的胰岛样细胞团在5.6mmol/L葡萄糖浓度下胞内胰岛素含量为(54.45±9.14)ng/mg蛋白；而在16.7mmol/L葡萄糖浓度下胞内胰岛素含量为(130.14±12.24)ng/mg蛋白。具有一定的糖反应性。
实施例4、体内移植实验首先制作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，体重约180-200g。按70mg/kg剂量给每只大鼠腹腔注射链脲霉素。链脲霉素粉剂用0.1M柠檬酸缓冲液(Ph＝4.5)配制成液体使用，现配现用。当大鼠血糖升高(≥16.7mmmol/L)且稳定一周，表明糖尿病模型已经建成。无菌条件下，向糖尿病大鼠肾包囊下或肝门脉小分支注入1000个胰岛样细胞团。术后，定期观测血糖情况。
结果糖尿病大鼠在植入细胞后第二周时血糖平均下降5.6mmol/L。表明诱导的胰岛样细胞团具有一定的降血糖作用。
权利要求
1.一种诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，其特征在于利用骨髓间充质干细胞能够向神经细胞分化的特点，采用分两阶段诱导的方法获得胰岛样细胞团。
2.按照权利要求1的诱导分化方案，其特征在于利用胰岛细胞与神经细胞具有相似的发育机制，采用一或两种促神经细胞生长的因子诱导间充质干细胞分化为nestin阳性的胰岛干、祖细胞，即第一阶段的诱导。
3.按照权利要求1的诱导分化方案，其特征在于获得nestin阳性的胰岛干、祖细胞后，采用三种促进胰岛细胞增殖分化的细胞因子诱导其分化为胰岛样细胞团，即第二阶段的诱导。
4.按照权利要求3的方案，其特征在于获得的胰岛样细胞团具有一定的降血糖作用。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于糖尿病患者可以实现以自身细胞治疗自身的疾病，使得部分糖尿病患者避免了异体细胞移植引起的免疫排斥反应。
全文摘要
一种诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法。本发明的目的是提供一种获得大量胰岛样细胞团以用于糖尿病细胞治疗的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案1)分离、培养及扩增骨髓间充质干细胞；2)分阶段诱导骨髓间充质干细胞分化，通过添加特异的生长因子，诱导骨髓间充质干细胞分化为nestin阳性的胰岛干、祖细胞，再添加促进胰岛增殖分化的因子诱导其分化为胰岛样细胞；3)将获得的胰岛样细胞植入糖尿病患者体内(肾包囊下或经肝门脉移植)，可以发挥一定的降血糖作用。本发明为糖尿病细胞治疗提供了新的胰岛细胞来源，为糖尿病患者实现自体干细胞治疗自身疾病奠定了基础，并为与之相关的药物开发和筛选提供了一种新的模型。
文档编号A61K35/12GK1536075SQ0310926
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者裴雪涛, 李艳华, 谢超, 岳 文 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 中国人民解放军军事医学科学院野战输