专利名称：双苄基异喹啉-(7-0-11')-单醚键生物碱衍生物及类似物在治疗纤维化有关疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物及类似物在治疗纤维化有关疾病特别是真皮纤维化中的新用途，新的双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物及类似物、含莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱或新的双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物及类似物的药物组合物。
背景技术：
纤维化是许多疾病脏器损伤的结果，如肝纤维化、肺纤维化、真皮纤维化等，其中烧、创伤后由于成纤维细胞异常增生所形成的瘢痕组织是真皮纤维化的一种形式，现代细胞生物学和分子生物学的研究认为，成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制及细胞外基质中胶原合成与降解失衡，部分细胞因子的大量产生构成了瘢痕的生物学基础。临床治疗上主要以激素治疗为主，迄今为止，未发现一种对不同部位、面积、病程的瘢痕都有效而又可靠的药物及制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的抗纤维化特别是真皮纤维化药物，其具有优良的疗效且毒副作用很低。
本发明人经广泛深入地研究，出人意料地发现双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物及类似物对成纤维细胞有显著的抑制作用。本发明其于上述发现得以完成。
本发明第一个目的涉及式1(若存在对映体时，包括两对映体)的双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物及类似物在制备用于治疗纤维化有关疾病中的用途。
式1其中R1、R2、R3、R4、R5为H、CH3、CH3CO、CH3CH2CO、CH3CH2CH2CO等；Q1、Q2两个氮原子的结合状态为NH、NCH3、N→O、NR+等。
当Q1和Q2为N-CH3，R1、R2、R3、R4、R5各为CH3、CH3、CH3、H、H和CH3、H、CH3、H、CH3和CH3、CH3、CH3、H、CH3时，分别为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱，它们的乙酰化衍生物及其相应的盐。
本发明的再一目的涉及的含式1化合物的药物组合物，该药物组合物对成纤维细胞有显著的抑制作用。根据本发明，该药物组合物中可加有各种药用赋形剂、添加剂及载体。
根据本发明，本发明的式1化合物或含式1化合物的药物组合物可用于治疗与纤维化有关的各种疾病，尤其是烧、创伤后增生性瘢痕。
根据本发明，本发明的药物组合物可按本领域已知方法配成外用或内服巴布剂、乳剂、片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、喷雾剂、吸入剂、滴鼻剂等。
根据本发明，本发明的式1化合物，主要来自睡莲科植物的不同部位，如莲子心、莲须、莲叶等。或通过全合成或半合成方法制备。
根据本发明，本发明优选的抗纤维化化合物为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱。
根据本发明，本发明最优选的抗纤维化化合物为莲心碱。
根据本发明，莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱可从上述植物中通过以下提取路线制备植物(莲子心、莲须等)→乙醇提取→乙醚萃取→制备用高效液相分离下面将通过中草药对瘢痕成纤维细胞抑制作用的筛选来进一步阐述本发明。
一、中草药的选取和制备1、选取原则清热解毒、活血化瘀、破血散结、拔毒止痒、药性较强的中草药。
2、药物分组根据选取原则，经过文献查阅，我们筛选出以下8种药物A、赤勺B、毛冬青C、莲子心D、瑞香狼毒E、猫眼草F、千金子G、旋复花H、蒲公英3、药物提取上述生药各500G，60％的乙醇冷浸24小时，浓缩至干，密封于灭菌安瓿备用。
二、中草药的初筛1、材料与方法1.1材料中草药北京同仁堂；DMEM、胰蛋白酶美国Gibco公司；胎牛血清中国天津血清厂；MTT美国Sigma公司；DMSO美国进口分装。
1.2、方法1.2.1细胞培养与药物配制手术中取下的增生性瘢痕组织，年龄1岁-30岁，病程半年-2年。在无菌培养皿中漂洗，去除血污及脂肪，剪碎成约1mm3的小块，培养于含胎牛血清10％、100IU/L的青霉素、100ug/L的链霉素的DMEM培养液中，置37℃，CO2培养箱中培养。细胞长成致密单层后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，以1∶3传代，第3-9代细胞用于实验。
1.2.2乳酸脱氢酶(LDH)的测定取对数生长期的细胞，以105个/ml细胞浓度接种于24孔培养板培养，每孔接种500ul，置CO2箱培养7d，3d换液一次。加条件培养基分为实验组(加500ul中草药提取物，浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 ug/ml。)和对照组(加500ul的DMEM)继续培养24h，取上清液，用全自动生化分析仪测定LDH活性值。
1.2.3细胞形态学观察 取对数生长期的细胞，以105个/ml细胞浓度接种于24孔培养板培养，每孔接种500ul，置CO2箱培养8h后分为实验组(加500ul药物)和对照组(加500ul的DMEM)继续培养24h，于倒置显微镜下观察、照相。
1.2.4 MTT比色法测定细胞增殖状况取对数生长期的细胞，以105个/ml细胞浓度接种于96孔培养板培养，每孔接种100ul，加100ul培养液，置CO2箱培养12h，吸弃上清液，按分组加条件培养液200ul(浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81及0ug/mL)继续培养24h，吸弃上清液10ul，加5g/L的MTT液10ul/孔继续培养4h，吸弃上清液每孔加DMSO200ul，不时振荡显色，自动酶联免疫分析仪测定吸光度A(波长492nm)。计算抑制率抑制率＝(1-实验组吸光度均值/对照组吸光度均值)×100％。
2结果初筛结果显示，以下几组药物对增生性瘢痕成纤维细胞有抑制作用C、莲子心提取物 D、瑞香狼毒提取物F、千金子提取物G、旋复花提取物。而其他中药提取物对增生性瘢痕成纤维细胞无抑制作用。初筛结果如下2.1、乳酸脱氢酶(LDH)的活性LDH activity in the medium(n＝3，x±s)Groupρ(TMP)(ug/ml) Z(LDH)/(U/L)control 0 25.3±4.2C 50029.6±3.8D 50031.5±4.3F 50042.5±5.2G 50027.2±3.62.2、莲子心提取物对增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用观察(见
图1)2.3、狼毒提取物对增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用观察(见图2)2.4、千金子提取物对增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用观察(见图3)2.5、旋复花提取物对增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用观察(见图4)3讨论通过中草药的初步筛选，我们发现了莲子心、狼毒、千金子、旋复花这四种对人增生性瘢痕成纤维细胞有抑制作用的中草药，其中效果最佳、细胞毒作用最小的为莲子心提取物，EC50值约为120ug/ml。细胞形态学观察结果显示莲子心提取物使增生性瘢痕成纤维细胞数目减少，形状变的不规则，突起变短，细胞排列混乱，细胞内代谢产物增多。
三、莲子心有效部位的筛选睡莲科植物莲是一种重要的中草药，其叶能清暑利湿、止血，其梗能宽中理气等，其莲成熟种子的绿色胚芽---莲子心，主要含有生物碱碱类成分。因此我们把其粗提物萃取成两部分乙醚部分(含脂溶性生物总碱)和水部分。
2、筛选方法同初筛一致3、筛选结果(见图5、图6)4、莲子心脂溶性生物总碱对增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用时效关系的观察(见图7)5、讨论通过对中草药提取物有效部位的筛选，我们发现了对增生性瘢痕成纤维细胞抑制作用效果最好的中草药有效部位-莲子心脂溶性生物总碱，其EC50值约为8ug/ml，从时效关系上看，莲子心脂溶性生物总碱的抑制作用随时间的延长略有下降，但仍然保持在较高抑制率。
四、莲心碱对瘢痕成纤维细胞抑制作用的研究1、莲心碱的制备我们运用制备高效液相方法对莲子心脂溶性生物总碱进行进一步的分离，得到了3个单体化合物，经结构鉴定为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱，其中莲心碱含量最高，对其进行了进一步的抗纤维化活性研究。
2、方法同上3、结果(见图8)4、讨论通过莲心碱对瘢痕成纤维细胞抑制作用的研究，我们发现其抗纤维化作用显著，EC50值约为8ug/ml，浓度在62.5ug/ml时的LDH值为26.43，与空白组比较无显著性差异，证明其低毒高效，有望成为临床上治疗瘢痕及抗纤维化的新药。
权利要求
1.下式(若存在对映体时，包括两对映体)的双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物及类似物在制备用于治疗纤维化有关疾病中的用途。 式1其中R1、R2、R3、R4、R5为H、CH3、CH3CO、CH3CH2CO、CH3CH2CH2CO等；Q1、Q2两个氮原子的结合状态为NH、NCH3、N→O、NR+等。
2.一种用于治疗纤维化有关疾病的药物组合物，其包括作为活性成份的权利要求1双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物和类似物，及药用赋形剂或载体。
3.根据权利要求1的用途，其中双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物和类似物为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱。权利要求1式1中，当Q1和Q2为N-CH3，R1、R2、R3、R4、R5各为CH3、CH3、CH3、H、H和CH3、H、CH3、H、CH3和CH3、CH3、CH3、H、CH3时，分别为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱，它们的乙酰化衍生物及其相应的盐。它们在制备用于治疗纤维化有关疾病的药物中的用途。下图为结构式， 莲心碱 异莲心碱 甲基莲心碱
4.权利要求3的双苄基异喹啉-(7-O-11’)-单醚键生物碱衍生物和类似物在治疗烧、创伤后增生性瘢痕中的用途。
5.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物可被配成巴布剂、乳剂、片剂，胶囊，注射液或剂型。
全文摘要
双苄基异喹啉－(7－O－13')－单醚键生物碱衍生物及类似物在治疗纤维化有关疾病特别是真皮纤维化疾病中的新用途，本发明人出人意料地发现双苄基异喹啉－(7－O－13')－单醚键生物碱衍生物及类似物对成纤维细胞有显著的抑制作用。本发明摘要附图所示化合物或其药物组合物可用于治疗与纤维化有关的各种疾病，尤其是烧、创伤后增生性瘢痕；本发明的药物组合物可按本领域已知方法配成外用或内服的巴布剂、乳剂、片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、喷雾剂、吸入剂、滴鼻剂等；本发明优选的抗纤维化化合物为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱；本发明最优选的抗纤维化化合物为莲心碱。
文档编号A61P1/16GK1548423SQ03136949
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月23日 优先权日2003年5月23日
发明者王世岭, 万鲲 申请人:王世岭, 万鲲