专利名称：一种sars疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用生物工程技术制备的疫苗，特别是涉及一种SARS疫苗及其制备方法与应用。
背景技术：
SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)是一种严重的急性传染病，它首先在我国广东省部分地区发现并流行，患者的主要临床表现为肺炎，典型症状为高烧(＞38℃)、干咳、呼吸急促或呼吸困难。人群对SARS病毒普遍易感，医护人员是本病的高危人群。疾病的死亡率与患者年龄及其相关，年龄越大死亡危险也越大，患者的亡率可能达到14％到15％。2003年3月15日，世界卫生组织(WHO)将这种疾病命名为严重急性呼吸道综合症，我国习惯上称为非典型肺炎。2003年4月16日，WHO正式宣布SARS的致病原为一种新的冠状病毒，称为SARS病毒。据报道，SARS病毒的平均潜伏期是6.4天，其传播途径主要是短距离飞沫传播、接触病人呼吸道分泌物传播及密切接触传播。迄今为止，全球范围内，已经有22个国家和地区出现SARS病例的报道。
自WHO正式确认SARS的致病原为SARS病毒以来，界各国相继报告了它与其他冠状病毒的差异。NCBI的GeneBank于2003年4月18日发布了两条完整的SARS病毒基因组，NC_004718(29736bp)，AY278554(29206bp)-SARS coronavirus CUHK-W1。除了这些差别，SARS病毒基因组与其他冠状病毒的结构相似。初步的基因组注释在NCBI完成，预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)，S蛋白(spike protein)，E蛋白(small membrane protein)，N蛋白(nucleocapsid protein)等。使用Clustalx 1.82，用neighbor-joiningtree方法构建的冠状病毒的进化关系树如下M蛋白，N蛋白，S蛋白.(来源biosino.org)“SARS”病毒传播迅速，致病死亡率高，而其又非常独特，以前从未在人类中发现，因此，目前尚没有针对这种病毒的特效药物，现有的SARS治疗药物主要是干扰素类药物，但其不能从根本上有效地预防或治疗SARS疾病，SARS仍然严重地威胁着人民的健康。(资料来源http//www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Coronaviruses.html#SARS)发明概述本发明的目的是提供一种安全有效的SARS疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述SARS疫苗的方法。
本发明的再一个目的是提供所述SARS疫苗在预防和治疗非典型肺炎中的用途。
本发明的SARS疫苗包括至少一个类型的SARS病毒的全抗原，或者含有至少一个类型的SARS病毒的不完全抗原。
完全抗原是指能够直接诱导机体产生特异性免疫应答的一类物质。半抗原能与抗体特异性结合，但不能激发机体产生抗体，必须与蛋白质(载体)结合后进入机体，才能产生有效的免疫应答。大分子的半抗原在体外能与对应的抗体结合发生可见反应(凝集、沉淀)，小分子的半抗原能与对应抗体结合而不出现可见反应。
本发明的SARS疫苗是由分离自非典疫区的病例标本中的SARS病毒株，经大量培养并灭活后制得的。制备方法包括(1)将SARS病毒接种入适于其生长传代的细胞中，在合适的培养条件下培育细胞，收集上清液，继续传代，直至上清液中的病毒滴度大于5.80PFU/ml，筛选出适于大规模培养的含SARS病毒的细胞株；(2)将筛选出的病毒株接种于生长良好的适于传代的细胞中，在合适的培养条件下，经大规模培养，收获病毒原液；(3)病毒原液经加入福尔马林或β-丙内酯灭活后，再浓缩、纯化为纯化原液；(4)将纯化原液制备成疫苗。
优选的，本发明的方法还包括向灭活的纯化原液中添加药学上可接受的佐剂、保护剂、防腐剂和/或添加剂的步骤。
优选的，SARS病毒接种入细胞的比例是0.01PFU/细胞。
细胞的培养条件包括温度、湿度、培养基等，本方法优选的培养条件包括在含有10％小牛血清的MEM培养液中，35℃培养3-5天。
优选的，本方法中适于SARS病毒传代生长的细胞是Vero细胞、人二倍体细胞(2BS)或人肺上皮细胞，经过传代培养后，得到相应的含有SARS病毒的细胞株。
在本发明的一个优选实施方案中，筛选出SARS-Vero细胞，其上清液中SRAS病毒的滴度大于5.80PFU/ml。
在本发明的又一个优选实施方案中，筛选出SARS-2BS细胞，其上清液中SRAS病毒的滴度大于5.80PFU/ml。
在本发明的又一个优选实施方案中，筛选出SARS-人肺上皮细胞，其上清液中SRAS病毒的滴度大于5.80PFU/ml。
优选的，用福尔马林或β-丙内酯灭活病毒原液，更优选的，按照1∶2000(病毒原液∶福尔马林或β-丙内酯)的比例入灭活病毒原液。优选的，在灭活的病毒原液中加入防腐剂，如硫柳汞。
灭活的病毒原液可以经多种方法纯化，例如离子交换层析等各种层析手段。在本发明的一个优选实施方案中，灭活的病毒液经高倍超滤浓缩后，经分子筛层析柱、离子交换后，去除大部分杂蛋白，得到纯化原液。在本发明的另一个优选实施方案中，灭活的病毒液经疏水柱后，再经离子交换、分子筛层析柱，得到纯化原液。
可以将合适的佐剂加入纯化后的病毒原液，制备出免疫效果增强的疫苗。佐剂能够与抗原混合使用，不仅有助于注射物质的沉积或汇集，而且能够增强抗体反应。可以作为免疫佐剂的物质有①微生物及其产物，常用的微生物如分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等。②多聚核苷酸，如多聚肌苷酸∶胞苷酸(poly1∶C)，多聚腺苷酸(poly1∶A∶μ)等。③弗氏佐剂(Freundadjuvant)，包括不完全弗氏佐剂(将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或叶吐温80)制成的油包水抗原乳剂)和完全弗氏佐剂(在不完全佐剂中加入分枝杆菌，如死卡苗)。④无机物，如明矾及氢化铝等。
优选的，用0.4-0.7％(mg/ml)的Al(OH)3作为免疫佐剂。
本发明进一步涉及上述SARS疫苗在预防和治疗由SARS病毒引起的疾病中的用途。
例如，可以通过免疫注射本发明SARS疫苗的方法，预防非典型肺炎。具体而言，可以在第0、7、21天各注射一剂SARS疫苗，用于预防目的。
本发明的SARS疫苗效果显著，安全性好，无毒副作用。
体外中和试验表明，本发明的SARS疫苗中所含活性成分能特异性地中和SARS病毒，中和后的SARS病毒混和物不引起细胞的病变。
小白鼠动物试验表明，经腹腔免疫注射本发明的SARS疫苗两次后，小白鼠能抵抗SARS病毒的攻击，而未免疫过的对照组小白鼠全部死亡，疫苗效价可达2.0IU以上。
家兔试验表明，肌肉免疫注射本发明的SARS疫苗两次后，采血进行抗体测定，抗体平均滴度达1∶128以上，阳转率达100％。
动物安全、毒性试验表明，经腹腔注射本发明的SARS疫苗后，连续观察7～14天，动物未发现有发病，甚至死亡，体重增加。
人体临床观察试验表明，全程免疫注射本发明的SARS疫苗后，除少部分出现局部反应外，其余未发现大的毒、副作用，采血进行中和抗体测定，滴度都在1∶128以上，抗体阳转率为100％。
下列实例描述了获得本发明的疫苗，以及准备本发明的试验和组合的较佳方法。这些实例明显表明，本发明的SARS疫苗可作为预防非典型肺炎的首选，为安全、有效的疫苗。这些实例仅仅起描述作用，并没有限制本发明的范围。
具体实施例方式
实施例1、SARS病毒滴定试验(蚀斑法)A.病毒来源由非典型肺炎疫区的病例标本中分离的SARS病毒株，用于SARS疫苗的研制。
致密单层的Vero细胞(协和医科大学细胞中心提供)经胰酶消化，用含10％小牛血清的199培养液制备成浓度约为0.8×105个/ml的细胞悬液，接种于直径为35mm的6孔组织细胞培养板，置于含5％CO2的孵箱内，35-37℃培养两天后形成单层，移去6孔板内的细胞培养液。用含5％小牛血清的199培养液4倍系列稀释病毒，选择3个适宜稀释度1/40960、1/163840、和1/655360的病毒液，接种至培养板，每个稀释度的病毒接种2孔，每孔0.4ml；另设细胞对照2孔。在孵箱吸附1小时(每隔15分钟摇板1次)，然后每孔加入4ml最终浓度为0.75％的羧甲基纤维素(其中含10％牛血清，10％10倍浓缩199液，0.5％庆大霉素)，于孵箱继续培养6天后倾去覆盖物，加入1％结晶紫染色液染色15分钟，用自来水漂洗、晾干，计每孔30个以内的蚀斑数，计算PFU。
计算举例见下表。
注1/163840稀释度平均蚀斑数24；1/655360稀释度平均蚀斑数5；1/163840＝(24+5×4)/2＝22；22PFU×163840＝3604480PFU/0.4ml；即为9011200PFU/1.0ml(病毒LgPFU＝6.95).
实施例2、含SARS病毒的细胞株的制备1、SARS-V细胞株的制备开启细胞株安瓶，以2％小牛血清灭菌双蒸水，按1∶100稀释，取样进行无菌试验及外源因子检测，方法见《中国生物制品规程》2000年版中《生物制品无菌规程》和《生物制品病毒外源因子检查A项》，同时取样按例1方法进行病毒滴定，余冻存于-80℃以下备用。无菌试验和外源因子检查合格后方可进行以下的试验。
挑选生长形态良好的Vero细胞方瓶，消化下的病毒与细胞按0.01PFU/细胞混匀，分别接种于2个方瓶，置35℃培养3～5天，培养液为10％小牛血清的MEM，待细胞出现脱落，液体变酸时，收集上清液，取样进行无菌试验和病毒滴定，其余细胞立即冻存于-80℃以下，此为SARS-V1代细胞株。
SARS-V1经检测合格后，用于接下的传代，按上述方法继续接种于Vero细胞中，经培养、收获，为SARS-V2病毒，如此连续传代，直至病毒滴度大于5.80PFU/ml，无菌试验及外源因子检测合格后，收集细胞株并冻存于-80℃以下，此即为SARS-V细胞株，可用于SARS疫苗的制备。
2、SARS-2BS细胞株的制备与SARS-V的制备方法类似，SARS病毒在人二倍体细胞上(2BS细胞，协和医科大学细胞中心提供)进行传代适应，得到经传代适应的SARS-2BS细胞株，其产生的病毒滴度大于5.80PFU/ml，无菌试验及外源因子检测合格，该细胞株可用于SARS疫苗的制备。
3、SARS-人肺上皮细胞株的制备与SARS-V的制备方法类似，SARS病毒在人肺上皮细胞上(协和医科大学细胞中心提供)进行传代适应，得到经传代适应的SARS-人肺上皮细胞株，其产生的病毒滴度大于5.80PFU/ml，无菌试验及外源因子检测合格，该细胞株可用于SARS疫苗的制备。
实施例3、SARS疫苗的制备1、病毒原液的制备
SARS-Vero细胞、SARS-2BS细胞或SARS-人肺上皮细胞经35℃培养3-5天后，收获病毒原液。
病毒原液按照1∶2000加入福尔马林或β-丙内酯灭活，并补加1∶20000的防腐剂硫柳汞。
2、病毒原液的纯化方法1灭活的病毒原液，先以0.45μm的膜澄清过滤，去除细胞碎片、杂蛋白，用分子量为10万的超滤膜浓缩30～50倍(浓缩倍数视病毒收获液的病毒滴度而定)。然后柱层析纯化浓缩液，以10cm×100cm的柱为例，填入Amersham pharmcia公司出品的Sepharose 4 Fast flow介质5L，经柱压装成柱体积为2L的柱床，用于浓缩液的纯化。柱床用pH7.6的PBS缓冲液冲洗1.5个柱床体积，冲洗后将浓缩液样品泵入柱中，每次上样150ml，然后再用PBS(pH7.6)洗脱，流速为50ml/min，记录仪的纸动速度为2cm/hr，记录纸上出现的第一个峰即为应收集的病毒峰(见
图1)，收集的病毒蛋白液为白色透明液体。
方法2灭活病毒原液澄清过滤后，先经疏水柱StreamLine(Amersham pharmcia公司出品)，收集蛋白液，再加入离子交换柱(介质CMsepharose FF6或DEAEsephrose FF6)，最后加入层析柱(Sepharose 4Fast flow介质)，收集病毒峰，其余步骤同方法1。
3、蛋白含量的测定按照0.003g/ml的比例，加入保护剂人血白蛋白。测定方法参见2000年版《中国生物制品规程》附录中的蛋白含量测定法(Lowry法)。经测定蛋白含量为80μg/ml，而浓缩液的蛋白含量为7.9mg/ml，杂蛋白去除率为99％以上，接种于人体后，不易引起过敏等副反应。
4、疫苗的制备经纯化的病毒原液配以0.4-0.7％(mg/ml)Al(OH)3佐剂，制备成疫苗。
实施例4、SARS疫苗效力试验(BHK21细胞蚀斑抑制中和法)采用免疫小鼠中和抗体测定法，昆明种小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清由中国药品生物制品检定所提供。将被检疫苗(T)和参考苗(R)分别按1∶32进行稀释，体重12～14g小鼠10只，每只小鼠腹腔注射0.5ml疫苗，免疫2次，间隔7天。2次免疫后第7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混和，于56℃灭活30分钟，稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别稀释好的病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合。同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中5培养天，染色，蚀斑计数，计算被检苗和参考苗对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。
判定标准如下(1)合格T≥(RA+RB)/2-0.33；(2)重试(RA+RB)/2-0.66＜T＜(RA+RB)/2-0.33；(3)不合格T＜(RA+RB)/2-0.66。
实施例5、体外中和试验
1、血清采集SARS疫苗以PBS做10倍稀释后，在第0、3、7、14天进行疫苗注射，每批疫苗注射2500g家兔10只，每只0.5ml。注射前，注射后第7天、第14天、第28天分别采血，分离血清用于中和抗体试验。
2、中和试验(1)中和用病毒悬液制备取冻干SARS毒种1支，稀释成10-2悬液，取上清液脑内接种10～12克小白鼠，每只0.03ml/只，共接种10只，待小白鼠出现典型症状时，处死并收其脑组织，研磨，以20％小牛血清PBS稀释成10-1悬液离心，取上清液分装小管冻存于-70℃以下，同时取样做病毒滴定，一般传2～3代可制成-70℃冻存的中和用毒种。
(2)待检血清样品稀释待检血清用2％小牛血清PBS稀释、按0.2ml血清加1.8ml稀释液成1∶10，再取1∶10血清0.5ml加0.5ml稀释液成1∶20，同样依次稀释成1∶40、1∶80、1∶160、1∶320～1∶1280共6个稀释倍数的稀释血清以备用。
(3)中和取上述待检血清的8个稀释度待检样品各0.5ml，加入中和用病毒悬液0.5ml在小管内混匀，放置37℃水浴1小时，作注射小白鼠用。同样将抗SARS血清标准品的稀释液与中和用病毒悬液混匀，水浴中和。中和用病毒悬液再稀释成10-0、10-1、10-2、10-3四个稀释度，各取0.5ml与2％小牛血清PBS0.5ml混合于小管内，同样放置37℃水浴作用1小时，作中和病毒对照用。
(4)注射将已中和的待检血清的不同稀释度的悬液和病毒对照接种10～12克小白鼠，血清从浓到稀的倍数接种小白鼠，而病毒对照则从稀到浓的倍数接种，每个稀释度6只小白鼠，每只脑内注射0.03ml。
结果接种后观察14天，结果已中和病毒悬液接种小白鼠后，除1∶1280稀释度死亡只小白鼠外，余全部健存；而对照组小白鼠四个稀释度90％死亡，该结果说明本发明疫苗能有效抵抗SARS病毒的攻击。
实施例6、安全性和毒性试验1、安全性试验经灭活后的病毒液，脑内接种体重为11～13g小鼠20只，每只0.03ml。正常喂养并观察14天，无一出现发病、死亡。灭活效果能符合要求。
2、毒性试验用稀释、配制并分装的SARS疫苗，对小鼠和豚鼠进行腹腔注射，注射前，将实验动物称重，并进行记录。选取18～22g的小鼠5只，每只注射疫苗0.5ml；250～350g的豚鼠2只，每只注射疫苗5ml。注射后观察7天，所有动物未出现发病或其他异常，且体重增加。
上述结果表明疫苗无毒、副作用，安全性好。
权利要求
1.一种SARS疫苗，其含有至少一个类型的SARS病毒的全抗原，或者含有至少一个类型的SARS病毒的不完全抗原。
2.根据权利要求1所述的SARS疫苗，其还包含药学上可接受的佐剂、保护剂、防腐剂和/或添加剂。
3.根据权利要求2所述的SARS疫苗，其中所述佐剂是Al(OH)3.
4.根据权利要求2所述的SARS疫苗，其中所述防腐剂是硫柳汞。
5.一种制备SARS疫苗的方法，包括(1)筛选能够在适于SARS病毒传代的细胞中生长繁殖的SARS病毒株；(2)将筛选出的病毒株接种于生长良好的适于传代的细胞中，在合适的培养条件下，经大规模培养，收获病毒原液；(3)病毒原液经加入福尔马林或β-丙内酯灭活后，再浓缩、纯化为纯化原液；(4)将纯化原液制备成疫苗。
6.根据权利要求5所述SARS疫苗制备方法，还包括向灭活的纯化原液中添加药学上可接受的佐剂、保护剂、防腐剂和/或添加剂的步骤。
7.根据权利要求5或6所述制备SARS疫苗的方法，其中适于SARS病毒传代的细胞是Vero细胞、
8.根据权利要求5或6所述制备SARS疫苗的方法，其中适于SARS病毒传代的细胞是人二倍体细胞。
9.根据权利要求5或6所述制备SARS疫苗的方法，其中适于SARS病毒传代的细胞是人肺上皮细胞。
10.根据权利要求5或6所述制备SARS疫苗的方法，其中病毒原液按1∶2000的比例加入福尔马林或β-丙内酯，进行灭活。
11.根据权利要求5或6所述制备SARS疫苗方法，其中灭活的病毒液经高倍超滤浓缩后，经分子筛层析柱、离子交换后，去除大部分杂蛋白，得到纯化原液。
12.根据权利要求5或6所述制备SARS疫苗方法，其中灭活的病毒液经疏水柱后，再经离子交换、分子筛层析柱，得到纯化原液。
13.根据权利要求6所述SARS疫苗的制备方法，其中所述佐剂是Al(OH)3。
14.根据权利要求6所述SARS疫苗的制备方法，其中所述防腐剂是硫柳汞，保护剂是人血白蛋白。
15.根据权利要求1所述的SARS疫苗在预防和治疗SARS疾病中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中包括使用所述SARS疫苗进行免疫接种的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种SARS疫苗及其制备方法和用途。本发明的SARS疫苗包括至少一个类型的SARS病毒的全抗原，或者含有至少一个类型的SARS病毒的不完全抗原。本发明SRAS疫苗是通过将筛选出病毒株大规模培养后，灭活所收集的病毒原液而制得的。本发明的SARS疫苗安全有效，可用于预防和治疗非典型肺炎。
文档编号A61P31/00GK1569228SQ03145928
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月17日 优先权日2003年7月17日
发明者郑海发, 丁若愚, 王九裕, 王文辉, 李卫东, 李金建 申请人:北京华特森基因科技有限公司, 北京百欧赛地生物工程技术开发中心, 北京普世康医药技术开发中心