专利名称:单个双层的脂质体的制备方法
本发明涉及单个双层脂质体的制备方法。更具体地说，本发明涉及一种生产单个双层并含有囊包生物活性物质的脂质体的改进方法。
脂质体在文献中作了广泛地叙述，它们的结构是众所周知的。它们由亲水脂分子如极性脂质所组成，其中包括磷酯酰胆碱、乙醇胺和绿氨酸、神经磷脂、心磷脂、质脂、磷脂酸和脑苷脂。使磷脂或其他合适的亲水脂分子在水或水溶液中膨胀以生成液晶可形成脂质体，它通常是多层结构，由被水相物质彼此分开的许多双层结构组成。另一类型的脂质体是众所周知的，它由单个的含有囊包水相物质的双层结构组成，也可称为单层小泡。在脂类膨胀时，如果水相中含有水溶性物质，它们就陷入双层脂质之间。
最近几年，应用脂质体作为化合物载体有很大的兴趣，对这些化合物有兴趣是由于它们具有某些生物学性质，比如药物、蛋白质、酶、激素以及诊断剂，此后称为“生物活性化合物”。
水溶性物质被囊包在生物分子层之间的含水空间。脂溶性物质被囊包在脂层中，而极性的头部基团可以伸进含水空间里，这些化合物的囊包可通过许多方法来达到。所用的最普通的方法包含通过有机溶剂的蒸发而使磷脂在烧瓶的壁上形成薄膜。当这薄膜分散在合适的含水介质中就形成了多层脂质体(亦称为粗脂质体)。进行合适的超声处理后，粗脂质体形成较小的类似闭合的小泡。
水溶性的生物活性物质通常是使形成的薄膜分散在该化合物的水溶液中而掺入的。未被囊包的化合物用离心、层析、透析或其他一些合适的方法除去。脂溶性的生物活性物质通常是在形成膜之前使它们与磷脂一道溶解在有机溶剂中而掺入的。如果这些物质在脂相中的溶解性不超过能与脂质结合的数量因而没有多余的物质存在，则用上述方法制备的脂质体，通常包含结合在脂双层中的大多数物质;脂质体与未囊包物质的分离就不需要了。
脂质体是包含一个或多个分散在水或电解质水溶液里的脂质层的脂质小泡。虽然它们被广泛地用于各种目的囊包生物活性物质，但脂质体通常用作药物的载体。所利用的脂质体有各种类型，它们由于脂质体的数目、大小、表面电荷、脂质组成及制备方法而不同。
Bangham等人描述了制备多层脂质小泡的一种方法〔(J.Mol.Biol.13238-252(1965)〕。多层脂质小泡由许多被含水介质相互分散的双分子层组成。脂类和亲脂性物质首先溶解在有机溶剂中，溶剂在减压下通过施转蒸发除去，残余脂质在容器壁上形成一层薄膜。加入通常含有电介质或亲水性生物活性物质的水溶液，搅拌混合物时则形成大的多层脂质体。大的多层小泡通过超声处理能制备小的单层小泡。
另一种方法是，使脂类和水溶液的混合物加热，再进行剧烈搅拌及超声振动。O.Zumbuehl和H.G.Weder叙述了一个方法，其中脂类和添加物通过振动或超声处理溶于去污剂中，产生一定的混合胶粒。去污剂用透析法除去〔(Biochem.Biophys.Acta.640252-262。(1981)〕。最近，在美国专利4235871中描述了用反相蒸发技术制备大的单层脂质小泡的方法。通过这个技术形成油包水型乳剂。在减压下除去有机溶剂，产生有胶状特性的混合物，它能通过搅拌或通过分散在含水介质中转化为脂质小泡。
制备单层小泡的几种技术已有报导。例如，对磷脂的水相分散体进行超声处理产生由双层组成的或由磷脂包围水相空间的微小泡。〔(Papahad-Joponlos和Miller，Biochem.Biophys Acta.，135224-238(1968)〕。
所有上述方法在实验室规模上产生可重复的脂质体。用已知的步骤依赖现有设备扩增为生产规模常常是困难或完全不可能的，这部分是由于很难重复产生脂质体生成的物理条件。克服此问题的一个方法包括使用由D.Deamer和A.D.Bangham〔(Biochem.Biophys.Acta;443629-634。(1967)〕所叙述的乙醚灌输技术。在此过程中含脂的乙醚快速注射到60℃的缓冲液中，当乙醚蒸发后则自动形成单层脂质体。注射方法简单而且快速，但产生的脂质体制品的浓度相对较低，而且囊包的效率较低。
制备小的单层小泡而避开超声处理的另一个方法是乙醇注射技术〔(S.Batzri和E.D.Korn.Biochem.Biophys.Acta;2981015-1019，(1973)〕。通过向水中注射磷脂的乙醇溶液的方法制备单个双层脂质体，悬液用超过滤浓缩，乙醇用透析法除去。
美国专利4206197中叙述了包膜化学物质的方法，使脂肪与水溶性溶剂、表面活性剂及需包膜的化学物质混合。然后，将溶液加压注射至水相中，但用这种方法所形成的产品是胶状悬液。
脂质体类型及它们的制备方法的综合评论包含在由G.Gregoriadis编著的“脂质体技术(Liposome Technology)”中(CRC出版公司，Boca Rafon Florida Vols Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ(1984))。
如上所述，制备单个双层脂质体的已知技术是以实验室规模产生脂质体，并且通常不能将其扩大到工业生产规模，或者只有在克服困难后才能达到。本发明的目的是提供大规模制备单个双层脂质体的方法，本发明的另一个目的是提供大规模囊包生物活性物质的方法。
本发明提供一个在单个双层脂质体中囊包生物活性物质的大规模方法，它包括将脂类组份溶解在一合适的有机溶剂中，在压力下把有机相组份直接注射进水相组份中，同时用高速混合装置混合有机相和水相，于是自发地形成脂质体。
含有囊包生物活性物质的单个双层脂质体能直接使用，或可使用在合适的可作为药物接受的载体中以进行局部或全身的施用。脂质体的粘度可用加入一种或多种合适的增稠剂来提高，例如呫吨胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物。
由于脂质体在使用前不需要进一步处理，例如超声波、过滤、离心或透析，因此，本发明的方法可用于制药工业中大规模地囊包生物活性物质。
根据本发明提供了一种制备单个双层脂质体的方法，此方法能用于大批量生产脂质体。
用本发明的方法，通过将含生物活性物质的有机溶液加压注射进水相组份中，同时用高速匀浆器或混合装置使有机相组分和水相组份混合，则可得到含有囊包生物活性物质的单个双层脂质体。
水相组份单由水组成或可含有电介质、缓冲体系及其他配料，例如防腐剂。能被使用的合适的电介质包括金属盐如碱金属和碱土金属盐类。最好的金属盐类是氯化钙、氯化钠和氯化钾。电介质的浓度可以从0到260mM这一较大范围内变化。最好的范围是5mM至160mM。水相组份被置于一合适的容器中，此容器可在有机相组份注射时通过产生巨大湍流，而进行匀浆作用。两种组份的匀浆可在容器器内进行，或者将水相组份和有机相组份分别注射到位于容器外的混合器中。在后一种情况中，脂质体在混合器中形成，然后再转移到另一容器中以进行收集。
有机相组份由一合适的在制药上可采用的无毒的溶剂如乙醇、甘油、丙二醇和聚乙二醇以及能溶于该溶剂中的合适的磷脂所组成。能够选用的合适的磷脂包括如卵磷脂、缩醛磷酯酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油。为了有选择地修饰脂质体的特性，还可使用其他亲脂性添加剂。这些添加剂包括硬脂酰胺、磷脂酸、维生素E、胆甾醇和羊毛脂提取物。
使生物活性物质溶解在有机相组份中，可溶于有机溶剂的所有生物活性物质都可使用。在说明书和权利要求
中所用的“生物活性物质”这一概念是指一种化合物或一种组合物，当它们有效量存在时，对活细胞或有机体产生一种效应。可用于本发明的生物活性物质的例子包括但不限于，皮科药剂(例如triamcinolone acefonide、视黄酸、13-顺-视黄酸、氢化可的松);抗菌剂(例如氨苄青霉素);抗真菌剂(例如益康唑碱、益康唑硝酸盐、双氯苯咪唑丁基苯咪唑、特康唑、两性霉素B);抗分泌剂(例如西未替丁、雷尼替丁);抗惊厥剂(例如二苯双酰脲);抗高血压剂(例如卡压定);抗癌药(例如氨甲蝶呤);免疫调节剂(例如胞壁酸基二肽的亲脂衍生物);抗病毒剂(例如Acyclovir，干扰素);非甾类消炎剂(例如布洛芬、舒洛芬);前列腺素(rioprostil、mesopro-stil)及类似物。
利用微粒化的生物活性物质可能是有利的，即物质的平均颗粒直径小于10微米，因为具有大的表面积而有利于脂质体组份的溶解。
此外，能防止磷脂氧化的其他配料可以加入有机相组份中。这种配料的例子包括维生素E、丁基化苯甲醚、丁基化羟甲苯，抗坏血酸软脂酸盐、抗坏血酸油酸盐。防腐剂如苯甲酸、甲基羟苯甲酯、丙基羟苯甲酯也可加入。
有机相组份的体积将随配料的溶解性而变化，通常必须使用足够的溶剂以溶解所有的亲脂性配料，但溶剂不能超过整个配方的10%。
任何能使组份在压力下高速混合的高速混合器或匀浆器都可使用。通常所用的混合器的速度为1500至20000转/分。在最好的方法中，有机相组份通过一个或多个附在混合器上的喷嘴注入水相组份中。利用具有直径大约为0.1至20mm喷咀的匀浆器更好，但任何合适直径的喷嘴也可使用，最好的直径约0.1至10mm。与匀浆器一同使用的泵应当能够产生0.1至300巴(0.01至21.4磅/吋2)的压力。在注射时有机相组份的流速变化约在1ml至1000ml/分之间。无论批量的大小，当两个组份在另一容器中混合时，水相组分的流速应至少超过有机相组份流速的50倍。所使用的实际流速将取决于所使用的混合装置的实际速度，最好用惰性气体如氮气或氩气清洗溶液以防止所用物质可能被氧化。用本发明方法所生产的脂质体可通过本领域的已知技术来收集。已经发现脂质体最适pH在5-7之间。任何适当的无机或有机酸如盐酸，氢溴酸或醋酸可以加入脂质体中直至达到所要的pH。
脂质体可用作具有生物学和或药学活性物质的载体，或它们本身也可构成药物制品。如上所述制备的脂质体药物根据具体情况能局部给药或口服。它们能局部给药而不需要进一步纯化。在口服的情况下，脂质体必须近一步纯化以除去潜在的毒性物质。取决于给药的特殊方式，脂质体最好是在一种合适的在制药上可接受的载体中进行施用。这种载体的例子包括凝胶、溶液和气雾剂。
下列实例说明了本发明较好的实施方案。虽然所有实例都包括一种生物活性物质，从步骤中可明显看出减去活性物质亦可制备单个双层脂质体。所以，下列具体的实施方案仅作为解释而不是作为本发明的限制。
实例1组成益康唑碱(微粒化) 2.5克磷脂酰胆碱 25.0克胆甾醇 2.5克苯甲酸 0.5克丁基羟苯甲醚 0.0125克乙醇 20.0克氯化钙溶液(8mM) 199.488克步骤将益康唑碱、磷脂酰胆碱、胆甾醇、苯甲酸和丁基化羟苯甲醚加入乙醇中混合，于45-50℃加热直到溶解。将氯化钙溶液于25℃下置于高效匀浆器内〔Polytron(PTAZSM)，瑞士Lucerne，Kinematica Littau生产〕。然后将乙醇溶液通过管道直接打入氯化钙溶液中，同时使此溶液在高速下混合。具有直径小于2.5微米的脂质体自然地形成。
技术数据匀浆器速度 20，000转/分流速 8ml/分喷嘴的直径 0.18mm压力 100-150巴(7-10磅/吋2)实例Ⅱ组成益康唑碱(微粒化) 2.5克磷脂酰胆碱 25.0克胆甾醇 2.5克羟苯甲酯 0.35克羟苯甲酯 0.025克丁基化羟甲苯 0.025克乙醇 12.5克氯化钙溶液(8mM) 207.1克步骤将羟苯甲酯、羟苯丙酯、丁基化羟甲苯、胆甾醇、磷脂酰胆碱和益康唑碱加入乙醇中，悬浮液于45-50℃加热直至原料溶解。在溶解过程中，悬浮液用N2净化。于20℃下将氯化钙溶液置于高效匀浆器中〔PoLyTRon(PTAZSM)瑞士，Lucerne，Kinemat-ica Littau生产〕。然后用泵将乙醇溶液通过管道直接打入氯化钙溶液中，同时使溶液高速混合。在混合过程中，每种溶液都用氮气净化。具有直径小于3微米的脂质体自然形成。
技术数据匀浆器速度 9，000转/分流速 8ml/分喷嘴直径 1mm压力 30巴(2磅/吋)实例Ⅲ批量为18公斤组成益康唑碱(微粒化) 180.0克卵磷脂 1800.0克胆甾醇 180.0克羟苯甲酯 25.2克羟苯丙酯 1.8克氯化钠 19.98克纯化水 13480.02克乙醇 1800.0克抗坏血酸软脂酸盐 18.0克羟丙甲基纤维素 396.0克香料 36.0克10%盐酸 63.0克步骤将羟苯甲酯、羟苯丙酯和氯化钠于80℃下溶于纯水中(锅Ⅰ)将益康唑碱、抗坏血酸软脂酸盐、卵磷脂和胆甾醇于40℃溶于另一锅中(锅Ⅱ)。在整个过程中乙醇溶液用N2纯化。两种溶液冷至室温，将锅Ⅰ连接在高效匀浆器上(Megatron MT-61，瑞士，Lucerne，Kemematica Littau生产)使水溶液循环(流速50升/分钟)。将乙醇溶液通过管道从锅Ⅱ直接注入匀浆器中(流速500ml/分;压力0.02磅/吋)。具有直径小于2.5微米的脂质体自然形成。并于锅Ⅰ中收集。完成这一步骤后，将10%的盐酸和香料加入锅Ⅰ。加入羟丙甲基纤维素使其凝胶化。
技术数据匀浆器速度 8，000转/分水溶液流速 50升/分乙醇液流速 0.5升/分喷咀直径 6mm压力 0.02磅/吋实例Ⅳ特康唑(微粒化) 2.0克卵磷脂 25.0克胆甾醇 2.5克乙醇 25.0克抗坏血酸软脂酸盐 0.25克氯化钠 0.2775克羟苯甲酯 0.35克羟苯丙酯 0.025克10%盐酸 1.03克纯水 193.5675克步骤将羟苯甲酯、羟苯丙酯和氯化钠于80℃溶于一容器中，此容器装配有高效匀浆器(Polytron PTA ZOSM;瑞士Lucorne，Kinematica Littau生产)。将特康唑、卵磷脂、抗坏血酸软脂酸盐和胆甾醇于40℃搅拌下溶于另一容器的乙醇中。两种溶液冷至室温，将乙醇溶液通过管道直接打入水溶液中;这两种溶液同时高速混合。具有直径小于2.5微米的脂质体便自然形成，并在装配有高效匀浆器的容器中收集，用盐酸将pH调至5.5。
技术数据匀浆器速度 20，000转/分乙醇溶液流速 8ml/分喷咀直径 1.0mm压力 1磅/时按本发明方法制备的脂质体可用下列物理化学方法进行测定1.流体动力学性质即质量的测定和颗粒半径的测定采用分析超速离心法(BeckMan L-65，其有折射附件)和动力学激光散射仪进行。
2.颗粒的均一性用冰冻蚀刻技术在电子显微镜下观察进行测定。
图Ⅰ按实例Ⅰ制备的脂质体的电镜图谱。
图Ⅱ按实例Ⅱ制备的脂质体的电镜图谱。
权利要求
1.一种制备单个双层脂质体的方法，该方法包括如下步骤a)提供一个装有部分水相组分的容器；b)提供一种溶于另一容器的合适的有机溶剂中的脂质组分；c)提供一个高速匀浆器，其搅拌装置浸于所述水相组分中；d)利用注射器将脂质组分在压力下直接注射入水相组分中，同时通过搅拌装置高速搅动此混合物，从而形成一种脂质的水相分散体，这样便形成了单个双层脂质体。
2.根据权利要求
1的方法，其中的水相组分含有一种电解质。
3.根据权利要求
2的方法，其中的电解质是氯化钙。
4.根据权利要求
1的方法，其中的脂质组分是一种磷脂。
5.根据权利要求
4的方法，其中的磷脂是缩醛磷脂酰胆碱。
6.根据权利要求
4的方法，其中的磷脂存在于与胆甾醇形成的混合物中。
7.根据权利要求
1的方法，其中的有机溶剂是乙醇。
8.根据权利要求
1的方法，其中搅拌装置的速度在1500至20000转/分之间。
9.根据权利要求
1的方法，其中所说的注射器具有一个或多个喷嘴。
10.根据权利要求
9的方法，其中喷嘴的直径为0.1至10.0毫米。
11.根据权利要求
1的方法，其中的脂质组分在0.1-300巴的压力下注射入水相组分中。
12.根据权利要求
1的方法，其中有机相组分的流速为1至1000毫升/分。
13.根据权利要求
1的方法，其中的水相和有机相溶液用氮气进行清洗。
14.根据权利要求
1的方法，其中加入一种合适的增稠剂。
15.根据权利要求
14的方法，其中的增稠剂由下述一组物质中选出呫吨胶、羟基丙基纤维素及其混合物。
16.一种制备含有生物活性物质的单个双层脂质体的方法，该方法包括下列步骤a)提供一个装有部分水相组分的容器;b)提供一种溶于另一容器的合适的有机溶剂中的有机相组分，其中包括脂质组分和生物活性物质;c)提供一个高速匀浆器，其搅拌装置浸于所述水相组分中;d)利用注射器将脂质组分在压力下直接注射入水相组分中，同时通过搅拌装置高速搅动此混合物，从而形成一种脂质的水相分散体，这样便形成了单个双层脂质体。
17.根据权利要求
16的方法，其中的水相组分含有一种电解质。
18.根据权利要求
17的方法，其中的电解质是氯化钙。
19.根据权利要求
16的方法，其中的脂质组分是一种磷脂。
20.根据权利要求
19的方法，其中的磷脂是缩醛磷脂酰胆碱。
21.根据权利要求
20的方法，其中的磷脂存在于与胆甾醇形成的混合物中。
22.根据权利要求
16的方法，其中的亲脂性生物活性物质存在于与脂质组分形成的混合物中。
23.根据权利要求
22的方法，其中的亲脂性生物活性物质是一种抗真菌剂。
24.根据权利要求
23的方法，其中的抗真菌剂是益康唑、特康唑或双氯苯咪唑。
25.根据权利要求
22的方法，其中的亲脂性生物活性物质是一种非甾类消炎剂。
26.根据权利要求
22的方法，其中的亲脂性生物活性物质是一种前列腺素。
27.根据权利要求
16的方法，其中的有机溶剂是乙醇。
28.根据权利要求
16的方法，其中的匀浆器的速度在1500至20000转/分之间。
29.根据权利要求
16的方法，其中所说的注射器具有一个或多个喷嘴。
30.根据权利要求
29的方法，其中喷嘴的直径为0.1至10.00毫米。
31.根据权利要求
16的方法，其中的脂质组分在0.1-300巴的压力下注射入水相组分中。
32.根据权利要求
16的方法，其中有机相组分的流速为1至1000毫升/分。
33.根据权利要求
16的方法，其中的水相和有机相溶液用氮气进行清洗。
34.根据权利要求
16的方法，其中加入一种合适的增稠剂。
35.根据权利要求
34的方法，其中的增稠剂由下述一组物质中选出吨胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物。
36.一种制备含有生物活性物质的单个双层质体的方法，该方法包括下列步骤a)提供一个装有部分水相组分的容器;b)提供一种溶于另一容器的合适的有机溶剂中的有机相组分，其中包括脂质组分和生物活性物质;c)提供一个具有搅拌装置的高速匀浆器;d)通过所述匀浆器使所述水相组分循环;e)利用注射器在压力下将所述脂质组分直接注射入所述匀浆器中;f)高速搅拌溶液以形成脂质的水相分散体，收集所形成的单个双层脂质体。
37.根据权利要求
36的方法，其中的水相组分中含有一种选自氯化钠和氯化钙的电解质。
38.根据权利要求
36的方法，其中的脂质组分是一种磷脂。
39.根据权利要求
36的方法，其中的磷脂是缩醛磷脂酰胆碱，而生物活性物质是益康唑、特康唑或双氯苯咪唑。
专利摘要
提供了一种制备含有囊包生物活性物质的单个双层脂质体的改进方法。将一种磷脂及生物活性物质的乙醇溶液在压力下注射入含水电解质溶液中，此溶液装在高速匀浆器内。脂质体则自发地形成。
文档编号A61K9/10GK87105547SQ87105547
公开日1988年5月18日 申请日期1987年7月15日
发明者弗里茨·霍·博勒, 罗兰·拉·尼德尔 申请人:西拉格有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan