专利名称：一种多功能生物修复材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于皮肤、神经及软骨修复的生物材料的制备方法，主要利用壳聚糖/胶原/透明质酸钠为原料制备薄膜状或管状材料，属于生物医学技术领域。
背景技术：
皮肤、神经系统是人体中最重要的组织和器官，一旦受到损伤，正常功能就会受到影响。虽然皮肤的再生能力很强，但是，大面积的烧伤或创伤，单靠自身皮肤或自体移植皮肤来愈合是远远不够的，需要(人造皮肤作为)在治疗过程中的一种暂时性的创面保护覆盖材料来帮助。由合成材料或胶原蛋白等制成的人造皮肤，已经在临床上使用多年，但都存在着一定的缺陷。壳聚糖是已知天然多糖中唯一的碱性多糖，其分子中含有某些有助于细胞粘附和保持细胞分化的功能信息，具有减少成纤维细胞生长，减少癍痕形成，促进内皮细胞、毛细血管、心肌细胞及神经生长等功能，已广泛应用于生物医学领域如药物载体、人工皮肤、手术缝合线、人造肾膜、隐形眼镜等。由壳聚糖或甲壳素制成的人工皮肤，被认为是一种较理想的材料。它柔软、舒适，与创面的贴合性好，既透气，又吸水，既有止血止痛的功能，又有抑菌消炎作用，随着创伤慢慢愈合，自身皮肤生长，能自行溶解而被机体吸收，对治疗高热创伤特别有效。与非降解材料相比，既免除了揭除时病人流血多引起的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，还会促进皮肤再生。从20世纪40年代开始，就已有人研究壳聚糖人造皮肤了。日本开发了甲壳素无纺织物Beschitin W(BCW)创伤敷料，厚度为0.12mm，具有止血、止痛、抗溶化及促进表皮形成等功能。用于1度和2度烧伤，有效率高达90％，对3度烧伤，疗效也达53％(蒋挺大.甲壳素.化学工业出版社，2003.538)。Katakura-Chikarina制药公司(北海道，日本)开发的壳聚糖-胶原复合材料人工皮肤，已用于治疗创伤或烧伤。我国青岛海洋大学和青岛医学院研制的人造皮肤，除了壳聚糖和胶原蛋白掺用外，还加入了中药有效成分，收到了良好的效果。Sparkes等人(Sparkes B G，Murray D G.US Patent.4572906.1986)用壳聚糖、明胶和甘油制成了一种人造皮肤，能抑制伤口的收缩，防止严重烧伤的伤口产生硬伤疤。目前用壳聚糖、明胶、肝素等制成的复合人造皮肤，对修补伤口虽取得了一定的效果，但仍存在修复速度慢，愈合效果不够理想等缺陷。同时上述人造皮肤造价昂贵，难以被常人接受。
周围神经修复是90年代才发展起来的一门新兴科技。由于神经细胞具有一般不分裂、生长没有穿透力等特点，使神经修复十分困难。目前应用于临床的神经系统修复方法有直接缝合法和自体移植法。前一种方法只适合断损较小的情况，后一种是以肢体的其它功能受损为代价。针对上述两种方法的缺陷，人们提出了神经导管法，与自体移植法相比，该方法具有明显的优势[Dunnen WF，Lei B，Schakenraad JM，et al.Long-term evaluation of nerveregeneration in a biodegradable nerve guide.Microsurgery，1993；14508；Meek MF，DenDunnen WF，Schakenread JM，et al.Peripheral nerve regeneration and functionalrecovery after reconstruction with a thin-walled biodegradable poly(DL-lactide-ε-caprolactone)nerve guide.Cells Mater，1997；7(1)53]。据文献报道，目前人工神经导管主要有生物不可降解的和生物可降解的两类。生物不可降解的包括硅酮、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、丙烯腈-氯乙烯等惰性聚合物[Carole AH，Gregory E，Rutkowski.Thedevelopment of bioartificial nerve grafts for peripheral-nerve regeneration.Tibtech，1998；16163；Valentini RF，Sanatini AM，Dario P，et al.Polymer electret guidancechannels enhance peripheral nerve regeneration in mice.Brain Research，1989；480300]。这些材料制成的导管在修复神经时都会产生持续炎症反应，如不及时拆除，会压迫神经甚至造成神经损伤[杨吟野，李训虎等.壳聚糖及相关材料用于神经修复的前景.生物医学工程学杂志.200118(3)444]。生物可降解导管包括聚羟基乙酸、聚乳酸、聚酯、胶原、乳酸-ε-己内酯共聚物等[Carole AH，Gregory E，Rutkowski.The development ofbioartificial nerve grafts for peripheral-nerve regeneration.Tibtech，1998；16163；Li ST，Archibald SJ.Peripheral nerve repair with collagen conduits.Clin Materials，1992；9195]。由于神经导管的结构直接影响着营养物质的供给、神经导管材料还存在降解性能、力学性能与神经修复速度相匹配，与周围组织相容性等问题，至今生物可降解材料对神经修复的研究仍处于实验阶段，估计到临床应用还有一段距离。如前所述，壳聚糖作为一种有潜力的可降解生物材料，已被用于神经修复材料的研究。但已知作为神经修复的壳聚糖，其力学强度、降解速度和修复效果等仍存在一些问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种多功能生物修复材料的制备方法，该方法制备工艺简单，成本较低，它是以壳聚糖、胶原、透明质酸钠为主要成份，所制备的生物材料功能多，可用于皮肤、神经及软骨组织的修复，使用方便，具有良好的生物相容性、机械强度以及抗菌性。
本发明的技术方案如下一种多功能生物修复材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将壳聚糖溶于弱酸中，配成浓度为0.5～3％壳聚糖溶液；将胶原溶于酸中，制成0.1～2％的胶原溶液，将两种溶液混合；将透明质酸钠加入去离子水，配成0.1～10％的透明质酸钠溶液，将盐酸逐滴加入透明质酸钠溶液，调节其pH值达到1～4；将透明质酸钠溶液加入胶原/壳聚糖溶液中，混匀混合，制得壳聚糖与胶原、透明质酸钠混合溶液；其中透明质酸钠与胶原、壳聚糖溶液的体积比为1∶1～50∶1～200；
(2)将所配混合溶液装入模具中冻干，制成多孔薄膜或管子，其中膜厚为0.5～5毫米，管子内径为2～6毫米；(3)将制成薄膜状或管状样品用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡后直接冻干或凉干，或用蒸馏水冲洗后，再冻干或凉干；(4)在步骤(3)所制得的薄膜或管内复合一层壳聚糖、壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液，烘干或凉干，制得双层复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层薄膜或管状复合材料再用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡，蒸馏水冲洗，再冻干，消毒、备用。
上述步骤(1)中制备的壳聚糖/胶原/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚乙烯醇或硫酸软骨素。
在上述方案的基础上，本发明的技术特征还在于在上述步骤(1)的溶液中或步骤(5)冻干前的样品中加入干重比为0.1～1％的生长因子、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、生物蛋白胶、肝素钠或多聚赖氨酸。
在制备好的薄膜层中还可加入薄膜重量的1～100％的细胞悬浮液，所述的细胞为表皮细胞、神经细胞或软骨细胞；在管内可加入与管壁平行排列的至少一根诱导纤维，该诱导纤维采用胶原纤维、甲壳素/壳聚糖纤维、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠复合纤维。
本发明所用胶原为I型胶原、II型胶原或IV型胶原，其中作为软骨修复时可使用II型胶原；作为神经修复时可使用IV型胶原，作为皮肤修复时可使用I型胶原。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和突出性效果本发明采用壳聚糖/胶原/透明质酸钠为基本原料，制备工艺简单，成本低；所制备的多功能生物修复材料用于皮肤、神经、软骨修复等组织修复时，不仅具有良好的生物相容性、机械强度以及抗菌性，且使用方便，价格低廉。是一种促进组织修复的、在体内降解速度可调的、适合大众多功能材料，在生物医学领域具有广泛的应用价值。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1(1)将脱乙酰度为50％、分子量为400000道尔顿的壳聚糖、I型胶原、透明质酸钠分别溶解在1％的醋酸溶液或蒸馏水中，制成浓度为2％的壳聚糖醋酸溶液、1％的I型胶原醋酸溶液和1％的透明质酸钠水溶液；用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至3左右，然后按1∶50∶200(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为3毫米的海绵层薄膜或内径2毫米，外径5毫米的多孔管状材料；(注管状材料是将壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液注射到由同心管状聚四氟乙烯制成的环形容器中，然后迅速凉冻，干燥而得。)(3)用25％氨水浸泡样品10分钟后，再冻干。
(4)在步骤(3)所制得的薄膜或管内涂覆一层壳聚糖溶液、立即烘干，制得双层复合材料；所得双层复合材料可直接用于皮肤、周围神经及软骨的修复。用于周围神经修复时可将管子套在缺损神经两端，不用缝合。
实施例2(1)将透明质酸钠、II型胶原、脱乙酰度为70％、分子量为200000道尔顿的壳聚糖分别溶解在蒸馏水或1％的醋酸溶液中，制成浓度为10％的透明质酸钠水溶液、2％的I型胶原、1％的壳聚糖醋酸溶液；用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至2左右，然后按1∶20∶50(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为4毫米的海绵或内径3毫米、外径5毫米、长为15毫米的多孔管状材料；(3)用40％氨水浸泡样品10分钟；然后用蒸馏水冲洗净，再冻干。
(4)将2％壳聚糖溶液溶液(烘至将干不干时，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵状薄膜放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；若在直径略小的聚四氟乙烯棒上涂一层或蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，70℃下立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡，蒸馏水冲洗，加入1％的肝素钠，再冻干，γ射线消毒、备用。
实施例3(1)将透明质酸钠、IV型胶原、脱乙酰度为90％、分子量为10000道尔顿的壳聚糖分别溶解在蒸馏水或2％的醋酸溶液中，制成浓度为3％壳聚糖溶液，0.1％的透明质酸钠水溶液、2％的I型胶原、2％的壳聚糖醋酸溶液；用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至1左右，然后按1∶1∶1(v/v)比例将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为0.5毫米的海绵或内径2毫米，外径3毫米的多孔管状材料；(3)用25％氨水浸泡样品20分钟；然后用蒸馏水冲洗净，再冻干。
(4)将步骤(1)所制溶液烘至将干不干时，加入微量粒径在1微米的氯化钠混匀，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；在直径略小的聚四氟乙烯棒上涂一层上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡，蒸馏水冲洗，加入0.1％(W/W)纤维粘连蛋白，再冻干，γ射线消毒、备用。
作为人工皮肤，在使用前可在海绵层中加入50微升的成纤维细胞悬浮液；作为神经修复导管，使用前还可在导管中装入80微升的许旺氏细胞与IV型胶原混合液，3根甲壳素纤维(与导管长轴平行排列)，以防液体流失，可用明胶凝胶封住端口；作为软骨修复材料，可在海绵层中加入80微升的软骨细胞，将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去，以促进软骨细胞迁移。
实施例4(1)将脱乙酰度为80％、分子量为150000道尔顿的壳聚糖溶解在1％的盐酸中，制成浓度为1.5％壳聚糖溶液。将透明质酸钠与聚乙二醇分别溶于去离子水，配置成1％的透明质酸钠溶液与15％的聚乙二醇溶液。将上述透明质酸钠溶液与聚乙二醇溶液按1∶1(v/v)比例混合，然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右；将上述透明质酸钠/聚乙二醇溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖溶液，充分搅拌、混匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为5毫米的海绵或内径6毫米，外径7毫米的多孔管状材料；(3)用氨水/丙酮(9∶1)浸泡样品20分钟；然后用蒸馏水冲洗净，再冻干。
(4)将壳聚糖/透明质酸钠溶液烘至将干不干时，加入微量粒径为1微米的氯化钠混匀，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚硅酮板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；若在直径略小的聚硅酮棒上涂一层上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡，蒸馏水冲洗，加入1％(W/W)的表皮生长因子，再冻干，Co60消毒、备用。
作为人工皮肤，在使用前可在海绵层中加入100微升表皮细胞悬浮液，使用时可用少量1％的壳聚糖的氯化钙醋酸溶液(用碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值到5左右)涂抹壳聚糖/透明质酸钠海绵层附着面，以增强海绵的粘附性；作为神经修复导管，使用前还可在导管中装入80微升的许旺氏细胞与层粘连蛋白的混合物，3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列)；作为软骨修复材料，可在海绵层中加入80微升的软骨细胞，将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去，以促进软骨细胞迁移。
实施例5将脱乙酰度为85％，分子量为100000的壳聚糖溶解在0.5M的盐酸溶液中；将透明质酸钠与聚乙烯醇分别溶于去离子水，配置成1％的透明质酸钠溶液与20％的聚乙烯醇溶液。将上述透明质酸钠溶液与聚乙烯醇溶液按1∶1(v/v)比例混合，然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右；将上述透明质酸钠/聚乙二醇溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖溶液，充分搅拌、混匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为2毫米的海绵或内径2毫米，外径3毫米、长为50毫米的多孔管状材料；(3)用氨水/乙醇(9∶1)浸泡样品20分钟；然后用蒸馏水冲洗净，再冻干。
(4)将壳聚糖/透明质酸钠溶液烘至将干不干时，加入微量粒径为3微米的氯化钠混匀，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；若用直径略小的玻璃棒蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/乙醇(9∶1)溶液浸泡，蒸馏水冲洗，加入1％的生物蛋白胶，再冻干，Co60消毒、备用。
作为人工皮肤，在使用前可在海绵层中加入80微升(W/W)的成纤维细胞生长因子悬浮液，100微升表皮细胞悬浮液。使用时样品海绵层可用生物蛋白胶涂抹海绵层或创伤面，以增强海绵的粘附性和防粘连效果；作为神经修复导管，使用前还可在导管中装入80微升的成神经细胞生长因子悬浮液，80微升的许旺氏细胞与纤维粘连蛋白的混合物，3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列)；作为软骨修复材料，可在海绵层中加入80微升的软骨细胞，将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去，以促进软骨细胞迁移。
生物蛋白胶的配制将1g猪(血)纤维蛋白原37℃下溶于约10mL的蒸馏水中制成溶液A。将5000单位的人的凝血酶溶于由1mL 0.5M氯化钙(CaCI2)，4mL抑肽酶(5000KIE)及7mL蒸馏水配制成的B溶液中。使用前将相同体积的A液和B液混合均匀，取一定量剂涂抹于出血处或伤口周围，然后贴上海绵。
实施例6将脱乙酰度为90％，分子量为10000的壳聚糖溶解在0.5M的盐酸溶液中；将I型胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素分别溶于酸或去离子水，配置成2％的透明质酸钠溶液、1％的I型胶原与1％的硫酸软骨素溶液。将上述壳聚糖、I型胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素50∶20∶10∶1(v/v)比例混合均匀，(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为3毫米的海绵或内径3毫米，外径4毫米的多孔管状材料；(3)用EDC/NHS/MES体系(将1.731g EDC，0.415g NHS溶于215mL 0.05M MES缓冲液中即可)浸泡样品4小时，蒸馏水冲净，冻干；(4)将壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液烘至将干不干时，加入微量粒径为0.5微米的蔗糖混匀，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；若在直径略小的聚硅酮棒上涂一层上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用EDC/NHS/MES体系浸泡2小时，蒸馏水冲洗后，加入0.1％的层粘连蛋白，再冻干，消毒、备用。
作为人工皮肤，在使用前可在海绵层中加入80微升(W/W)的成纤维细胞生长因子悬浮液，100微升表皮细胞悬浮液；作为神经修复导管，使用前还可在导管中装入80微升的成神经细胞生长因子悬浮液，80微升的许旺氏细胞与纤维粘连蛋白的混合物，3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列)；作为软骨修复材料，可在海绵层中加入80微升的软骨细胞，将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去，以促进软骨细胞迁移。
作为人工皮肤，使用中在海绵层上涂抹壳聚糖/PLGA/EDC(10∶90∶1)，以增强海绵的粘附性。
壳聚糖/PLGA/EDC胶粘剂的配制将等量的壳聚糖醋酸溶液和PLGA的1，4-二氧六环溶液混合，37℃下预热后加入一定量的EDC的水溶液中即可。使用时将上述液体涂抹在海绵层，接触组织的一面。
实施例7(1)将透明质酸钠、I型胶原、脱乙酰度为50％、分子量为400000道尔顿的壳聚糖分别溶解在蒸馏水或1％的醋酸溶液中，制成浓度为1％的透明质酸钠水溶液、1％的I型胶原、0.5％的壳聚糖醋酸溶液；用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至3左右，然后按1∶50∶100(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液凉或烘至将干不干时，在聚硅酮板或棒外围涂上薄薄一层，凉干或烘干。
(3)用25％氨水浸泡样品10分钟；然后用蒸馏水冲洗净，凉干或烘干。
(4)将上述薄膜铺在聚硅酮板上，其上倒上一层由(1)配制的溶液；在粘附有一层壳聚糖/透明质酸钠/I型胶原的聚硅酮棒放在环形容器中，注入上述溶液，立即放在-80℃的冰块上冷冻，再冻干。用25％氨水浸泡样品10分钟；然后用蒸馏水冲洗净，加入1％的多聚赖氨酸，冻干。所得双层支架材料可直接用于皮肤、周围神经及软骨的修复。
实施例8(1)将透明质酸钠溶解在蒸馏水，制成浓度为1％的透明质酸钠水溶液，I型胶原和脱乙酰度为80％、分子量为150000道尔顿的壳聚糖分别溶解在1％的醋酸溶液中，配制成0.1％的I型胶原、3％的壳聚糖醋酸溶液；用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至2左右，然后按1∶30∶90(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为3毫米的海绵或内径6毫米、外径9毫米、长为35毫米的多孔管状材料；(3)用EDC/NHS/MES体系(将1.731g EDC，0.415g NHS溶于215mL 0.05M MES缓冲液中即可)浸泡样品4小时；然后用蒸馏水冲洗净，再冻干。
(4)将2％壳聚糖溶液或将步骤(1)所制溶液中加入1％粒径为5微米的氯化钠，烘至将干不干时，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；若在直径略小的聚硅酮棒上涂一层或蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层或蘸一下上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡，蒸馏水冲洗，加入0.5％的肝素钠，再冻干，γ射线消毒、备用。
实施例9将脱乙酰度为80％、分子量为200000道尔顿的壳聚糖与胶原分别溶解在1％的盐酸中，制成浓度为1.5％、0.5％的壳聚糖、胶原溶液。将透明质酸钠与羧甲基纤维素钠分别溶于去离子水，配成1％的透明质酸溶液与2％的羧甲基纤维素钠溶液。将上述透明质酸钠溶液与羧甲基纤维素钠醇溶液按1∶1(v/v)比例混合，然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右；将上述透明质酸钠/羧甲基纤维素钠溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖/胶原(1∶1)溶液，充分搅拌、混匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为2毫米的海绵或内径4毫米，外径6毫米的多孔管状材料；(3)用氨水/甲醇(9∶1)浸泡样品20分钟；然后用蒸馏水冲洗净，再冻干。
(4)将壳聚糖/透明质酸钠溶液烘至将干不干时，加入微量粒径为1微米的氯化钠混匀，在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上，立即烘干，制得双层复合材料；若在直径略小的聚四氟乙烯棒上涂一层或蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层或蘸一下上述将干溶液)，将步骤(3)制得的管状材料套在上面，立即烘干，制得双层管状复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/甲醇(9∶1)溶液浸泡，蒸馏水冲洗，加入0.6％(W/W)的纤维粘连蛋白，凉干，Co60消毒、备用。
作为人工皮肤，在使用前可在海绵层中加入100微升表皮细胞悬浮液，使用时可用少量壳聚糖/PLGA/EDC/丙酮溶液涂抹壳聚糖/透明质酸钠/胶原/羧甲基纤维素钠海绵附着面，以增强海绵的粘附性；作为神经修复导管，使用前还可在导管中装入80微升的许旺氏细胞与层粘连蛋白的混合物，3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列)；作为软骨修复材料，可在海绵层中加入80微升的软骨细胞，将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去，以促进软骨细胞迁移。
实施例10(1)将脱乙酰度为80％、分子量为180000道尔顿的壳聚糖、I型胶原、透明质酸钠分别溶解在1％的醋酸溶液或蒸馏水中，制成浓度为1％的壳聚糖醋酸溶液、1％的I型胶原和1％的透明质酸钠水溶液；用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至3左右，然后按1∶10∶100(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干，形成厚度为1毫米的海绵层薄膜或内径3毫米，外径4毫米的多孔管状材料；(注管状材料是将壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液注射到由同心管状聚四氟乙烯制成的环形容器中，然后迅速凉冻，干燥而得。)(3)用25％氨水浸泡样品10分钟；然后用蒸馏水冲洗净，加入1％的多聚赖氨酸，再冻干，Co60消毒、备用。
(4)在步骤(3)所制得的薄膜或管内涂覆一层壳聚糖、壳聚糖溶液烘干，制得双层复合材料；所得海绵可直接用于皮肤、周围神经及软骨的修复。用于周围神经修复时可将管子套在缺损神经两端，不用缝合。
权利要求
1.一种多功能生物修复材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将壳聚糖溶于弱酸中，配成浓度为0.5～3％壳聚糖溶液；将胶原溶于酸中，制成0.1～2％的胶原溶液，将两种溶液混合；将透明质酸钠加入去离子水，配成0.1～10％的透明质酸钠溶液，将盐酸逐滴加入透明质酸钠溶液，调节其pH值达到1～4；将透明质酸钠溶液加入胶原与壳聚糖混合溶液中，混合均匀，制得壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液；其中透明质酸钠与胶原、壳聚糖溶液的体积比为1∶1～50∶1～200；(2)将所配混合溶液装入模具中冻干，制成多孔薄膜或管状材料，其中膜厚为0.5～5毫米，管内径为2～6毫米；(3)将制成薄膜状或管状样品用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡后冻干，或用蒸馏水冲洗净后，再冻干；(4)在步骤(3)所制得的薄膜上或管内复合一层壳聚糖、壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液，烘干或凉干，制得双层复合材料；(5)将步骤(4)制备的双层薄膜或管状复合材料再用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡，蒸馏水冲洗，再冻干，消毒、备用。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)中制备的壳聚糖/胶原/透明质酸钠混合液中按体积比0.1～10％加入浓度为1～2％的羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸、硫酸软骨素溶液。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于在上述步骤(1)的溶液中或步骤(5)冻干前的样品中加入干重比为0.1～1％的生长因子、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、生物蛋白胶、肝素钠或多聚赖氨酸。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于在薄膜层中加入薄膜重量的1～100％的细胞悬浮液，所述的细胞为表皮细胞、神经细胞或软骨细胞；在管内加入与管壁平行排列的至少一根诱导纤维，该诱导纤维采用胶原纤维、甲壳素/壳聚糖纤维、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠复合纤维。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)和步骤(4)中所述的胶原为I型胶原，II型胶原或IV型胶原，其中作为软骨修复时可使用II型胶原；作为神经修复时可使用IV型胶原，作为皮肤修复时可使用I型胶原。
全文摘要
一种多功能生物修复材料的制备方法，涉及一种用于皮肤、神经及软骨修复的生物材料的制备。本发明以壳聚糖、胶原和透明质酸钠为基本原料，分别配成一定浓度的溶液并按一定的体积比混合，经脱泡，装入模具中冻干，制成薄膜状或管状；经氨水等浸泡后冻干或凉干；也可用蒸馏水冲洗净，再冻干；然后再复合一层壳聚糖、壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液，烘干或凉干，制得双层复合材料。该方法制备工艺简单，所制备的复合生物材料用于皮肤、神经、软骨等组织修复时，不仅具有良好的生物相容性、机械强度以及抗菌性，且使用方便，价格低廉，是一种可在体内降解速度可调的、适合大众使用的多功能生物修复材料。
文档编号A61L27/00GK1539514SQ20031010321
公开日2004年10月27日 申请日期2003年11月3日 优先权日2003年11月3日
发明者刘永庆 申请人:刘永庆