专利名称：一种蒲公英冻干粉针剂及其制备方法
技术领域：
本发明属中药制药技术领域，具体涉及一种蒲公英冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术：
蒲公英是菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag.或同属数种植物的干燥全草，别名蒲公草、黄花地丁等。古方记载蒲公英为“解热凉血之要药”、“至贱而有大功”，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功。蒲公英同属植物中含有多种成分，主要有胡萝卜素类、三萜类、甾醇类、黄酮类、倍半萜内酯类、咖啡酸、绿原酸、香豆素类、酚酸类等。
蒲公英已有蒲公英注射液[张旭东，等。蒲公英注射液的制备及临床应用。中国医院药学杂志，2003，23(12)761]和复方蒲公英注射液(WS3-B-3917-98)。两者蒲公英提取物的制备均采用传统的水提醇沉的方法得到。水提取时，对其中所含的水溶性好的有效成分提取比较完全，但对水溶性差的有效成分比如甾醇类、咖啡酸等提取很不完全。而且，水提溶出了不少淀粉、黏液质、蛋白质、树脂、鞣质等无效成分，这些成分的存在，给后续的除杂工艺带来了很大的麻烦。蒲公英注射液的制备分别用75％和85％乙醇进行了两次沉淀，而复方蒲公英注射液的制备用60％、80％、85％乙醇进行了三次沉淀。沉淀在形成和沉积的过程中，会吸附、包裹有效成分，从而使有效成分损失很大。申请号为CN02111738的专利申请文献采用水提，过大孔树脂的方法得到蒲公英提取物，用于制备口服制剂。其中水提的方法不科学、不合理，而且对成分的精制方法选择不合理。
注射液对稳定性要求高，在携带、储藏、运输时容易破碎，带来许多麻烦。
在资料检索中未发现有关蒲公英冻干粉针剂的任何报道。
发明内容
本发明的目的是公开一种富含活性成分、疗效好、使用方便的蒲公英冻干粉针制剂。
本发明的另一个目的是提供上述冻干粉针制剂的制备方法。
蒲公英中含有的有效成分水溶性较差，用乙醇提取比用水提取的效率更高。蒲公英中除含有有效成分外，还含有大量的大分子的树脂、鞣质、蛋白质等无效成分。用普通水提醇沉的方法除去这些杂质的同时，使有效成分损失很多。这些杂质的分子量普遍较大，而有效成分的分子量较小，利用超滤法，选择合适的分子筛可以除去大部分的杂质而对有效成分几乎没有损失。蒲公英提取物经聚酰胺柱吸附，用水和低浓度的乙醇溶液洗脱除杂后，然后再用碱液洗脱，最终得到富含活性成分的提取物。
本发明通过以下技术方案实现。
一、制备方法(1)原料药的处方为蒲公英0.8-1.2重量份；(2)取蒲公英药材，粉碎，用6-12倍量的50％-80％乙醇提取1-3次，每次1-2小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以10000-20000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用4-6倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用2-4倍量稀乙醇溶液洗脱，弃去稀乙醇洗脱液，再换用碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物1.5-3.5重量份。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入冻干赋型剂3.7-5.5重量份，加注射用水至规定量，调节pH值至7.0-7.5，灌装，冷冻干燥，即得。
二、制剂中总黄酮含量测定测定方法按照复方蒲公英注射液(WS3-B-3917-98)[部颁标准20册，223]含量测定项下的方法测定。编号1蒲公英注射液按照文献[张旭东，等。蒲公英注射液的制备及临床应用。中国医院药学杂志，2003，23(12)761]中的方法制备；编号2复方蒲公英注射液(江西余江制药厂)；编号3为本发明蒲公英冻干粉针剂(北京乾露春科技有限公司提供)。结果见表1。
表1 制剂中总黄酮含量测定编号样品含量(mg/支)批次1 2 31 0.202 0.186 0.3352 0.196 0.227 0.3173 0.237 0.213 0.304二、提取物中总黄酮含量测定测定方法按照复方蒲公英注射液(WS3-B-3917-98)[部颁标准20册，223]含量测定项下的方法测定。编号1蒲公英提取物按照文献[张旭东，等。蒲公英注射液的制备及临床应用。中国医院药学杂志，2003，23(12)761]中的方法制备；编号2蒲公英提取物按照申请号为CN02111738中的方法制备；编号3蒲公英提取物按本发明制备方法得到；均由北京乾露春科技有限公司提供)。结果见表2。
表2 制剂中总黄酮含量测定编号样品含量(％)批次1 231 17.726.4 43.72 19.428.2 43.23 18.227.8 42.5以上药理说明，用本发明的制备方法得到的蒲公英提取物和蒲公英冻干粉针剂中主要有效成分总黄酮的含量明显高于对比文献中的含量。说明本发明的制备方法是科学的、合理的，更具有实用性。
五、药理实施例1.蒲公英制剂抑菌作用的实验研究实验材料金黄色葡萄球菌、变形杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌，均购于中国药品生物制品检定所；营养琼脂培养基，购于北京海淀区微生物培养基制品厂；游标卡尺，规格(0～150)mm×0.02mm，安徽桐城量具厂生产；复方蒲公英注射液(江西余江制药厂)；蒲公英注射液按照文献[张旭东，等。蒲公英注射液的制备及临床应用。中国医院药学杂志，2003，23(12)761]中的方法制备；本发明蒲公英冻干粉针剂，均由北京乾露春科技有限公司提供；实验方法将金黄色葡萄球菌、变形杆菌分别用取菌环致密接种到普通营养培养基表面，以无菌操作将含蒲公英制剂浸出液的直径0.4cm的滤纸片贴到培养基上，37℃培养24h观察测量抑菌环直径。在普通营养琼脂培养基基础上高压灭菌后，冷却至56℃时加上5％～10％无菌脱纤维绵羊血混匀，倒入培养皿中备用。将甲型链球菌、乙型链球菌用取菌环分别致密接种到血平板培养基上后，以无菌操作将含蒲公英浸出液的直径0.4cm的滤纸片贴到培养基上后，37℃培养24h观察测量抑菌环直径。结果见表3。
表3 蒲公英制剂的抑菌作用抑菌环直径平均值d/cm菌种蒲公英注射液复方蒲公英注射液本发明蒲公英冻干粉针剂金黄色葡萄球菌1.153 1.278 1.583*变形杆菌 1.175 1.292 1.644*甲型链球菌0.599 0.723 1.072*乙型链球菌0.618 0.740 1.108*注和蒲公英注射液、复方蒲公英注射液相比*P＜0.05。
本发明蒲公英冻干粉针剂、蒲公英注射液和复方蒲公英注射液对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌均有明显的抑菌作用，且本发明蒲公英冻干粉针剂的抑菌作用明显强于蒲公英注射液和复方蒲公英注射液(P＜0.05)。
2.蒲公英制剂免疫活性的实验研究实验动物昆明种小鼠，体重20～25g。
实验药物复方蒲公英注射液(江西余江制药厂)；蒲公英注射液按照文献[张旭东，等。蒲公英注射液的制备及临床应用。中国医院药学杂志，2003，23(12)761]中的方法制备；本发明蒲公英冻干粉针剂，均由北京乾露春科技有限公司提供；培养液RPMA-1640完全培养液(Sigma美国)；ConA(Sigma美国)刀豆蛋白A；MTT(瑞士)四甲基戊唑蓝；氢化可的松(北京化学试剂厂)。
实验方法将小鼠随机分为5组，正常对照组每日给予相应体积的蒸馏水；模型对照组每日每只小鼠1mg氢化可的松，肌肉注射5天，同时等容积蒸馏水灌胃；给药组每日每只小鼠1mg氢化可的松，肌肉注射5天，并同时每日给蒲公英制剂的药物10天。用MTT比色分析法，观察脾淋巴细胞增殖反应。无菌制备脾细胞悬液，将调整好的细胞悬液加入多孔细胞培养板种，每孔100μl，细胞数为2.5×105个/孔。每孔加入ConA。ConA最终浓度为3μg/ml；置于5％CO2、37℃温箱培养48h。于培养终止前4h加入MTT，使最终浓度为0.05mg/ml，离心，弃去上清液，加入100μl含0.04mol/lHCl的异丙醇溶液充分混合，用450型酶联免疫检测仪测定，波长570nm及630nm的OD值。期OD值能准确反应淋巴细胞的增殖率。结果见表4。
表4 蒲公英制剂对小鼠淋巴细胞增殖的影响X±S组别 ConA刺激物对照组0.898±0.034模型组0.597±0.018蒲公英注射剂组0.736±0.037*复方蒲公英注射液组0.754±0.028*
本发明蒲公英冻干粉针剂组0.792±0.022*★和模型组相比*P＜0.01和蒲公英注射液、复方蒲公英注射液组相比★P＜0.05本发明蒲公英冻干粉针剂、蒲公英注射液和复方蒲公英注射液均可对抗氢化可的松抑制脾淋巴细胞的增殖作用(P＜0.01)；本发明蒲公英冻干粉针剂组与蒲公英注射剂、复方蒲公英注射剂组相比也有差异(P＜0.05)；说明本发明蒲公英冻干粉针剂在对抗氢化可的松抑制脾淋巴细胞的增殖作用效果更强。
以上药理实验证明，用新工艺制备的本发明蒲公英冻干粉针剂具有更好的治疗效果。
六、制备实施例实施例1(1)原料药的处方为蒲公英1200g；(2)取蒲公英药材，粉碎，用12倍量的40％乙醇提取3次，每次2小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以20000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用60％乙醇溶液洗脱至Molisch反应为阴性，弃去乙醇洗脱液，再换用pH值为11.0的氢氧化钠水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用盐酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物330g。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖370g，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至7.5，灌装，冷冻干燥，即得蒲公英冻干粉针剂500支。
实施例2(1)原料药的处方为蒲公英800g；
(2)取蒲公英药材，粉碎，用6倍量的80％乙醇提取1次，每次1小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以10000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用6倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用40％乙醇溶液洗脱至Molisch反应为阴性，弃去乙醇洗脱液，再换用pH值为8.5的碳酸钠水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用硫酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物150g。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入甘露醇、果糖和乳糖550g，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至7.0，灌装，冷冻干燥，即得蒲公英冻干粉针剂500支。
实施例3(1)原料药的处方为蒲公英1000g；(2)取蒲公英药材，粉碎，用10倍量的50％乙醇提取2次，每次2小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以15000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用5倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用50％乙醇溶液洗脱至Molisch反应为阴性，弃去乙醇洗脱液，再换用pH值为9.0的氢氧化钾水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用醋酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎得到蒲公英醇提物230g。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入聚乙烯吡咯烷酮470g，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至7.2，灌装，冷冻干燥，即得蒲公英冻干粉针剂500支。
实施例4
(1)原料药的处方为蒲公英1100g；(2)取蒲公英药材，粉碎，用8倍量的60％乙醇提取3次，每次1小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以12000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用45％乙醇溶液洗脱至Molisch反应为阴性，弃去乙醇洗脱液，再换用pH值为9.5的碳酸氢钠水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用磷酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物305g。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入右旋果糖和乳糖395g，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至7.1，灌装，冷冻干燥，即得蒲公英冻干粉针剂500支。
实施例5(1)原料药的处方为蒲公英900g；(2)取蒲公英药材，粉碎，用9倍量的70％乙醇提取2次，每次2小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以18000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用5倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用47％乙醇溶液洗脱至Molisch反应为阴性，弃去乙醇洗脱液，再换用pH值为10.5的碳酸钾水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用冰醋酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物185g。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入甘露醇和葡聚糖515g，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至7.4，灌装，冷冻干燥，即得蒲公英冻干粉针剂500支。
实施例6(1)原料药的处方为蒲公英1050g；(2)取蒲公英药材，粉碎，用8倍量的55％乙醇提取3次，每次1小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以16000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用6倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用55％乙醇溶液洗脱至Molisch反应为阴性，弃去乙醇洗脱液，再换用pH值为10.0的氢氧化钾和碳酸氢钠水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用盐酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物280g。
(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入葡萄糖和果糖420g，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至7.3，灌装，冷冻干燥，即得蒲公英冻干粉针剂500支。
肌内注射，一次1-2支，一日2次。
权利要求
1.一种蒲公英冻干粉针剂，其特征在于它是由蒲公英醇提物1.5-3.3重量份和药用辅料3.7-5.5重量份组成的；其中蒲公英醇提物中有效部位总黄酮的重量百分含量大于或等于40％。
2.根据权利要求2所述的冻干粉针剂，其中药用辅料为冻干赋型剂，它是甘露醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、右旋果糖和乳糖中的一种、两种或几种的混合物。
3.一种蒲公英冻干粉针剂的制备方法，其特征包括以下步骤(1)原料药的处方为蒲公英0.8-1.2重量份；(2)取蒲公英药材，粉碎，用6-12倍量的50％-80％乙醇提取1-3次，每次1-2小时，合并提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，静置，过滤，滤液以10000-20000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的聚酰胺柱，先用4-6倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用2-4倍量稀乙醇溶液洗脱，弃去稀乙醇洗脱液，再换用碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液，用酸调pH值为中性，减压浓缩，干燥，粉碎，得到蒲公英醇提物；(3)取上述蒲公英醇提物加注射用水溶解，滤过，加入冻干赋型剂，加注射用水至规定量，调节pH值至7.0-7.5，灌装，冷冻干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中洗脱聚酰胺柱的稀乙醇溶液的浓度为1％-30％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中洗脱聚酰胺柱的稀乙醇溶液的浓度为10％-20％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于其中碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠中的一种或几种的混合物的水溶液。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中碱性水溶液的pH值为8.5-11.0。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中碱性水溶液的pH值为9.0-10.0。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于其中所述的酸是指盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、冰醋酸中的一种或几种的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种蒲公英冻干粉针剂及其制备方法。它是由蒲公英醇提物以及药用辅料组成的。蒲公英醇提物采用醇提、超滤、聚酰胺柱除杂的方法获得，其中的蒲公英总黄酮占到了蒲公英醇提物中的40％以上。含量测定结果和药理实验结果说明，本发明有效成分含量更高，药理作用更强，具有很好的清热解毒、消肿散结、利尿通淋的作用。
文档编号A61P13/00GK1628831SQ20041007408
公开日2005年6月22日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月3日
发明者张平 申请人:张平