作为血管内皮生长因子受体的f1k－1的制作方法

专利名称：作为血管内皮生长因子受体的f1k－1的制作方法
本申请系1993年11月13日提交的，申请号为93115345.X的，发明名称与本申请相同的已授权的申请的分案申请。
本发明涉及Flk-1受体的配体对调节血管形成和维管形成的用途。本发明部分是基于Flk-1酪氨酸激酶受体表达与内皮细胞相关的证明及作为Flk-1的高亲和性配体的血管内皮生长因子(VEGF)的鉴别。这些结果指出了维管形成和血管形成期间在信号系统中Flk-1的主要作用。本发明公开了表达Flk-1的宿主细胞的工程以及被表达的Flk-1对评价和筛选Flk-1调节中所涉及的VEGF药物和类似物的用途，所述的调节是以激动剂或拮抗剂活性进行的。
本发明也涉及Flk-1配体，这包括VEGF激动剂和拮抗剂，在通过调节维管形成和血管形成来治疗疾病，包括癌症中的作用。
受体酪氨酸激酶包括一个具有各种各样生物活性的多肽生长因子的横垮膜受体的大族。它们固有的酪氨酸激酶功能在配体结合时被激活，这导致该受体和多细胞物质的磷酸化作用，并随后形成多种细胞反应(Ullrich A.and Schlessinger，J.，1990，Cell 61203-212)。
受体酪氨酸激酶cDNA，被称之为胎儿肝脏激酶1(Flk-1)是由富集生血茎和先祖细胞的小鼠细胞群落克隆出的。该受体被认为是与生血茎细胞更新有关的(Matthews et al.，1991，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 889026-9030)。Flk-1克隆的序列分析显示了与受体激酶的C-kit亚科，特别是与Flk基因产物的相当大的同源性。这些受体共同都具有含免疫球蛋白状结构的一种细胞外区域。
血管的形成和扩展，或维管形成和血管形成，分别在多种生理过程中，如胚胎发育、伤口愈合、器官再生以及雌性生殖过程中，如在排卵期间黄体中的滤泡发育和受孕后胎盘生长中起重要作用。不受控制的血管形成可能是病理性的，如取决于生长的血管化的固体肿瘤的生长。
血管形成包括血管内皮细胞的增生、迁移和浸润，并很可能是被多肽生长因子所调节。已鉴别了某些具有离体内皮细胞生长促进活性的多肽。实例包括酸性和碱性或纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胎盘生长因子。尽管已有FGF族不同成员的四种截然不同的受体被已特征化了，但其中还没有一种被报导过能在体内于血管中被表达。
尽管FGF对大量不同细胞类型而言显得是促细胞分裂素，但最近已报导VEGF是一种内皮细胞的特定分裂素(Ferrara.N.and Henzel.W.J.，1989，Biochem.Biophys Res.Comm.161851-858)。最近，fms类酪氨酸受体，flt被表明具有对VEGF的亲和性(Devries，C.et al.，1992，Science255989-991)。
本发明涉及使用Flk-1受体的配体对调节血管形成和维管形成的用途。本发明部分是基于这样的发现Flk-1酪氨酸激酶受体在内皮细胞表面被表达并基于鉴别了作为Flk-1的高亲和性配体的血管内皮生长因子(VEGF)。在血管形成和维管形成期间内皮细胞增生和迁移作用表明了Flk-1在这些过程中的重要作用。本发明是以鼠Flk-1的例子来描述，然而，这些原则可以用于其它物种，包括人类。
企图抑制Flk-1/VEGF相互作用的药剂可用于抑制肿瘤生长。VEG和/或VEGF激动剂可用以促进伤口愈合。本发明涉及预定为生产表达Flk-1受体的Flk-1蛋白和/或细胞系的表达体系。可溶的重组体Flk-1蛋白的表达可用于筛选抑制Flk-1/VEGF相互作用的分子的肽库。在它们表面上表达Flk-1的工程细胞系可有利地用以选筛和鉴别VEGF激动剂和拮抗剂。


图1.Flk-1氨基酸序列与相关RTK的比较。Flk-1与人体KDR和大鼠TKr-C的氨基酸序列的比较。所有三种受体已知序列的段落区域被比较但仅示出了与Flk-1序列的区别。
图2.Flk-1基因表达的Northern印迹分析。(A)Flk-1 RNA在9.5-18.5天小鼠胚胎中的表达。在每道中分析了由全部小鼠胚胎得到的总RNA试样(10mg)。标明了28s和18s核蛋白体RNA的位置。(B)与来自出生后四天的脑毛细管片段比较Flk-1 mRNA在出生后四天的和成年脑中的表达。在每道上载有1mg Poly(A+)RNA。使用Flk-1cDNA的5’2619bp作为探针。在下部的方格中示出了与GAPDH cDNA探针的对比杂交。
图3.在胚胎组织中多量Flk-1基因的表达。在14.5天小鼠胚胎中Flk-1表达的原位杂交分析。(A)通过全部用35s标记的反义探针(5’2619bp)杂交的胚胎的平行矢形区域的明扬照度。(B)相同区域的暗场照度。(C)与有意义探针的相邻区域的对比杂交。缩写Ao，主动脉；At，心房；L，肺；Li；肝；Ma，下颌骨；Mn，脑膜；Ms，中脑；T，端脑；V，心室；Vt，椎骨。
图4.将胚胎器官中Flk-1 RNA的表达限制于特定细胞。高倍放大的在145天小鼠胚胎中的Flk-1 RNA表达。(A)用35s标记的反义探针探测的心区。(B)与有意义探针杂交的相邻区域。(C)以细胞水平示出的部分主动脉壁。内皮细胞层由一个箭头指明。(D)用Flk-1反义探针探测的肺。(E)与有意义探针杂交的相邻区域的对比杂交。缩写At，心房；B，支气管；Ed，内皮细胞层；En，心内膜；L，肺；Li，肝；Lu，主动脉腔；M1，肌肉；My，心肌。
图5.在发育中的小鼠脑中的Flk-1基因表达。在不同发育阶段的脑中的Flk-1基因表达的原位杂交分析。全部区域都用Flk-1反义探针探测过。(A)11.5天小鼠胚胎端脑的矢形区。由箭头表示表达Flk-1的单独血管，该血管由脑膜发展入神经外层。(B)14.5天胚胎以及(C)出生后四天脑的矢形区域。所示出的是中脑区域。由箭头指出了表达Flk-1的分支毛细管和血管。(D)成年脑的矢形区；示出了中脑的区域。由箭头指出了表达Flk-1的细胞。缩写M，脑膜；V，心室。
图6.成年脑的脉络丛中的Flk-1的表达。(A)与Flk-1反义探针杂交的成年鼠脑脉络丛的暗场照度。(B)以交流放大示出的脉络丛。箭头指出了显示强Flk-1表达的单一细胞。缩写Cp，脉络丛；E，室管膜；Ep，上皮细胞；V，心室。
图7.在肾小球中表达Flk-1。(A)与Flk-1反义探针杂交的出生后四天肾的平行矢形区。如箭头所指出，杂交信号积累在肾小球中。(B)与有意义探针相邻区域的对比杂交(C)用Flk-1探测过的成年肾的矢形区。箭头指出了肾小球。(D)高倍放大的成年肾小球。(A)和(D)中的箭头指出了排列在表达Flk-1的近小珠区域的链中的细胞。
图8.在早期胚胎和胚外组织中的Flk-1表达的原位杂交分析。(A)在用Flk-1探针的母体脱落物中的8.5天小鼠胚胎的矢形区。箭头指出了强烈表达Flk-RNA的母体血管的内皮。(C)9.5天小鼠胚胎卵黄囊和滋养外胚层的高倍放大。(D)血岛的高倍放大。缩写A.尿囊；Bi，血岛；Bv，母体血管；D，脱落物；En，卵黄囊的内皮层；M，间质；Ms，卵黄囊的中胚层；NF，神经褶；T，滋养层；卵黄囊。
图9.Flk-1是一种VEGF受体。(A)125I-VEGF与短暂表达Flk-1受体的COS细胞交联，并用125I-VEGF于4℃将对比细胞培育过夜，然后用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤两次并于4℃暴露在0.5mM于PBS中的交联剂DSS中经1小时。将细胞溶解，免疫沉淀出Flk-1受体，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，随后经放射自显影照相分析。以Kb标明了分子尺寸标记。(B)125I-VEGF与表达Flk-1的COS细胞的特定结合。从平板分去除短暂表达Flk-1的COS细胞并重新悬浮在连接介质中(DMEM，25mM Hepes，0.15％明胶)。在含有2×105细胞，150000cpm125I-VEGF，和指定浓度的未标记配体的总体积为0.5ml的介质中于15℃进行连接90分钟。用PBS 0.1％BSA洗涤这些细胞两次并在伽马计数器上计数。
图10.Flk-1的VEGF诱导的自动磷酸化作用。如所指出的在含有0.5％胎牛犊血清的DMEM中使短暂表达Flk-1受体的COS细胞和对比细胞饥饿24小时，然后用VEGF刺激10分钟。这些细胞被溶解，用抗其C末端的Flk-1受体多克隆抗体而免疫沉淀，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至硝化纤维素。用抗磷酸酪氨酸抗体(5B2)探测印迹。通过使用辣根-过氧化物酶偶联的二次抗体和BCLTM(Amersham)探测试验目视观测该蛋白带。
图11.鼠的Flk-1的核苷酸序列。
图12.逆转录病毒载体构件的质粒图。pLXSN Flk-1TMcl.1和pLXSN Flk-1 TMc1.3含有Flk-1氨基酸1至806。PNTK-cfms-TM含有c-fms的541N-端氨基酸。
图13.通过Flk-1的转显性-阴性抑制对C5恶性胶质瘤瘤生长的抑制。C5细胞或是单独被移植或是与产生病毒的细胞一起移植。在各个图片中指出了细胞数。使用了两种不同的产生的病毒细胞系一种表达Flk-1 TM(转显性阴性)突变体和作为对照的一种表达转显性阴性c-fms突变体(c-fmsTM)。在第一次肿瘤出现时开始，每2-3天测量肿瘤的体积以得到生长曲线。四只小鼠代表每一组。
图14.通过Flk-1的转显性-阴性抑制对恶性胶质瘤肿瘤生长。C5细胞或是单独被移植或是与产生的病毒细胞一起共同移植。各个图片中指出了细胞数。使用了两种不同的产生病毒的细胞系一种表达Flk-1 TM(转显性-阴性)突变体及一种作为对比的表达转显性-阴性c-fms突变体(c-fmsTM)。在第一次肿瘤出现时开始，每2-3天测量肿瘤体积以得到生长曲线。每组由四只小鼠所表示。
本发明涉及Flk-1受体的配体对调节血管形成和/或维管形成的用途。本发明也涉及评价和筛选VEGF药物和类似物的Flk-1的表达，所述的药物及类似物与受体激活、调节和解偶联有关。这些Flk-1的调节基因可在治疗上被使用。例如，VEGF的激动剂可用于如象伤口愈合这样的过程，相反，VEGF的拮抗剂可用于治疗依赖于维管形成而生长的肿瘤。
本发明部分是基于由表明Flk-1是一种内皮细胞特定RTK的原位杂交和Northern印迹分析所得的结果。此外，交联试验已显示出Flk-1是一种对维管内皮生长因子(VEGF)的高亲和性受体，这表明Flk-1在维管形成和血管形成期间对成血管细胞的发育和分化以及随后的内皮细胞生长起决定作用。
本发明也基于这样的发现Flk-1分子的转显性-阴性突变体形式的表达能抑制的内源野生型Flk-1的生物活性。本文描述了这些试验，在这些试验中将肿瘤细胞和产生将平截的Flk-1受体编码的重组体逆转录病毒的细胞混合并注射入小鼠中。在表达平截形的Flk-1受体的小鼠中观察到血管形成和被注射的肿瘤细胞生长的抑制。Flk-1分子转显性-阴性形式的表达可用于治疗由于血管异常增生造成的疾病，如风湿性关节炎、视网膜病和固体肿瘤生长。
如下文中工作实施例所解释的，使用了聚合酶链反应(PCR)法以分离专在移植后胚胎和内皮细胞中表达的新受体酪氨酸激酶。发现了这样一种的克隆，将一个RTK编码的，它具有差不多与早先鉴别的由富集生血细胞和指定的胎儿肝脏激酶-1(Flk-1)的细胞群落中分离出的cDNA克隆相同的序列同源性(Matthews et al.，1991，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.889026-9030)(图11)。
为了讨论的清晰，在下面段落中以鼠的Flk-1为实例说明本发明。然而，这些原则可类似地应用于克隆和表达其它物种，包括人类的Flk-1。
1.Flk-1编码序列鼠Flk-1基因的核苷酸编码序列以及推导出的氨基酸序列被描述在图11(SEQ.ID NO.1)并且最近已公开(Matthewset al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，889026-9030)。哺乳动物中，包括人类的Flk-1蛋白的核苷酸序列或其功能等同物可用于产生导致Flk-1表达的重组体分子；在下文中这一受体将称之为“Flk-1”，与由什么物种所产生无关。
在本文所公开的一个特定的实施方案中，通过使用两个根据在受体酪氨酸激酶区内高度保守的序列而设计的简并低核苷酸引物库进行的聚合酶链反应(PCR)分离出鼠Flk-1基因(Hanks et al.，1988)。使用由8.5天小鼠胚胎制得的λgt10 cDNA库的DNA作为模板。在平行方法中，使用类似的引物以充实来自由出生后4-8天小鼠脑中分离出的毛细管内皮细胞的RTK cDNA序列。这是脑内皮细胞增生最大的时间。两种方法都产生将新近公开的胎儿肝脏RTK、Flk-1编码的cDNA序列(Matthews et al.，1991)。根据氨基酸同源性。这一受体是RTKIII型亚纲中的一员(Ullrich andSchlessinger)，RTK在其细胞外区域中含有免疫球蛋白类复制物(图1)。
本发明也涉及由其它物种，包括人类分离的Flk-1基因，其中存在Flk-1活性。本文以结合肽的VEGF或片段的那些受体定义Flk-1族成员。这些受体可证实在DNA序列的实际范围中的氨基酸含量上的80％同源性。使用放射性标记的小鼠Flk-1克隆片段，在减低强度的条件下，可筛选噬菌体cDNA库。换句话说，小鼠Flk-1序列可被用于设计可用作PCR探针的简并或完全简并的低核苷酸序列或筛选噬菌体cDNA库。以聚合酶链反应为基础的策略可用于克隆人体Flk-1。可将相应于保持小鼠Flk-1和受体酪氨酸激酶之间特色的两种简并低核苷酸库用作PCR反应中的引物。该反应的模板是通过由已知表达人体Flk-1的细胞系或组织产生的mRNA的逆转录而获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆和定序以保证被充实的序列代表Flk-1序列。可使用该PCR片段，通过放射性标记放大的片段和筛选噬菌体cDNA库以分离出全长Flk-1 cDNA克隆。另一方面，可使用该被标记的片段以筛选基因库。为评述可使用的克隆方案，参见例如Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y.；and Ausubel et al.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，(Green PublishingAssociates and Wiley Interscience.N.Y.)。
也可通过在哺乳动物表达载体中，如含有可以在转移入COS细胞时高复制数表达质粒的复制序列的SV40源的PCDNAI中构建cDNA库而完成人体Flk-1 cDNA的分离。可用一系列方法检测在转染的COS细胞表面上的Flk-1的表达，这包括使用标记的配体，如用放射性标记、荧光标记或酶标记的VEGF或VEGF拮抗剂。可通过将转染的细胞进行FACS(荧光激活细胞分类器)分类来富集表达人体Flk-1的细胞。
按照本发明，可在合适的宿主细胞中使用将Flk-1、Flk-1的肽片段、Flk-1融合蛋白或其功能等同物编码的Flk-1核苷酸序列来产生导致Flk-1蛋白或其功能等同物的表达的重组体DNA分子。另一方面，在核苷酸杂交试验、Southern和Northern印迹分析等中也可以使用与Flk-1序列部位杂交的核苷酸序列。
由于基因密码的固有简并性，在本发明的实践中可使用将基本上相同或功能上等同的氨基酸序列编码的其它DNA序列，以克隆和表达Flk-1蛋白。这些DNA序列包括在严格条件下能与鼠Flk-1序列杂交的那些序列。
可按照本发明使用的改变的DNA序列包括不同核苷酸残基的缺失、附加或取代，结果形成将相同或功能上等同的基因产物编码的序列。该基因产物本身在Flk-1序列范围内可有氨基酸残基的缺失、附加或取代，结果导致静变化，从而产生功能上等同的Flk-1。可根据所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性质方面的相似性进行这些氨基酸的取代。例如，荷负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；荷正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似亲水值的不带电极性头基团的氨基酸包括以下氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸(analine)、天冬酰胺、谷氨酸胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。本文所用的功能上等同的Flk-1是指与VEGF或片段结合，但不必具有其对应的天然Flk-1的相同结合亲和性的受体。
可设计本发明的DNA序列以使Flk-1编码序列变成多种末端，这包括但不限于基因产物的修饰过程和表达的变化。例如可使用现有技术中公知的技术，例如位点定向诱变来引入突变，以插入新的限制性位点，改变糖基化模式磷酸化等。例如，在某些表达体系中，如酵母，宿主细胞可能全部使基因产物糖基化。当使用这些表达体系时，改变Flk-1编码序列以消除任何N连接的糖基化位点可能是较佳的。
在本发明另一个实施方案中，Flk-1或经修饰的Flk-1序列可与导源序列配合以将融合蛋白编码。例如，为了筛选肽库，可以用于将表达为市购抗体所识别的异源抗源决定基的嵌合Flk-1蛋白编码。也可设计融合蛋白，以使其含有位于Flk-1序列和异源蛋白序列之间的分裂位点，从而使Flk-1能从异源部分中分裂出去。
在本发明的一个可选择实施方案中，可使用现有技术中的公知化学方法全部或部分地合成Flk-1的编码序列。例如参见Caruthers，et al.，1980，Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7215-233；Crea and Horn，180，Nuc.Acids Res.9(10)2331；Matteucci and Caruthers，1980，Tetrahedron Letters 21719；and Chow and Kempe，1981，Nuc.Acids Res.9(12)2807-2817。另一方面，该蛋白质本身可使用化学方法全部或部分地合成Flk-1氨基酸序列。例如，肽可通过固相技术合成，由树脂中排出，并通过初步高效液相色谱提纯(例如参见Creighton，1983，Proteins Structures And Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，N.Y.pp.50-60)。可通过氨基酸分析或定序证实合成肽的组成(例如，Edman degradationprocedure；参见Creighton，1983，Proteins，Structures andMolecular Principles，W.H.Freeman and Co，N.Y.，pp.34-49)。
2.Flk-1受体的表达和表达Flk-1的细胞系的产生为了表达生物活性的Flk-1，将上文1.中所述的将Flk-1编码的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体，即含有对所插入编码序列的转录和转译为必要成分的载体中。用重组体表达载体或转化的Flk-1基因产物以及宿主细胞或细胞系可用于多种目的。这些目的包括，但不限于，产生与该受体结合的抗体(即单克隆或多克隆的)，这包括竞争性抑制结合VEGF和“中和”Flk-1活性的那些抗体，筛选和选择通过Flk-1受体起作用的VEGF类似物或药物等等。
(1)表达体系可将现有技术的普通技术人员公知的方法用于构建含有Flk-1编码序列和合适转录/转译对比信号的表达载体。这些方法包括离体重组体DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。这类技术如可见于Maniatis el al.，1989，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.N.Y.and Ausubel et al.，1989，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.。
可使用多种宿主表达载体体系表达Flk-1编码序列。这些体系包括，但不限于微生物，如用重组体噬菌体DNA转化的细菌、含有Flk-1编码序列的质粒DNA或装配型质粒DNA表达载体；用含有Flk-1编码序列的重组体病毒表达载体(例如杆状病毒(baculovirrus))感染的昆虫细胞体系；用含有Flk-1编码序列的重组体病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含Flk-1编码序列的重组体质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞体系；或用重组体病毒表达载体(例如，腺病毒、牛痘病毒)感染的动物细胞系，包括设计成在双小片染色体中含有多次复制的或是稳定放大的(CHO/ahfr)或是不稳定放大的Flk-1 DNA的细胞系(例如鼠细胞系)。
这些体系的表达要素的强度和特异性可变。根据所用的宿主/载体体系。在表达载体中可使用任何数量的合适的转录和转译成分，这包括构成性的和可诱导的启动子。例如，当在细菌体系中克隆时，可使用可诱导的启动子，如噬菌体λ、plac、ptrp、ptac、(ptrp-lac杂种启动子)等的PL；当在昆虫细胞体系中克隆时，可使用诸如杆状病毒、多面体启动子等启动子；当在植物细胞体系中克隆时可使用由植物细胞基因组得到的启动子(例如，热休克启动子；RUBISCO小亚单位启动子；叶绿素a/b结合蛋白启动子)或由植物病毒得到的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV外壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞得到的启动子(例如，金属硫因启动子)或由哺乳动物病毒得到的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛豆病毒7.5K启动子)；当产生含有多次复制的Flk-1 DNA的细胞系时，可使用具有合适的可选择标志的SV40-、BPV-和EBV-基的载体。
在细菌体系中根据被表达的Flk-1的用途可优先选择一系列表达载体。例如，当欲制备大量Flk-1以产生抗体或筛选肽库时，导致高度表达易于提纯的融合蛋白产物的载体是所希望的。这些载体包括，但不是限于，大肠杆菌(E.coli)表达载体PUR278(Ruther et al，1983，EMB O J.21791)(其中Flk-1编码序列可在具有lac Z编码区的构架中配合成该载体，以产生杂种AS-lac Z蛋白)；PIN载体(Inouye，& Inouye1985，Nucleic acids Res.133101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)；等等。也可使用PGEX载体表达作为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的异种多肽。通常，这些融合蛋白是可溶的并可通过吸附在谷胱甘肽-琼脂糖珠上随后在有游离谷胱甘肽存在时洗脱而易于从溶解的细胞中提纯。PGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶分裂位点，以使有意义的被克隆的多肽可由GST部分释放出来。
在酶母中，可使用一系列含有组成性或可诱导启动子的载体。为了评论，参见Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，1988，Ed，Ausubel et al.，Greene Publish，Assoc.&Wiley Interscience，Ch.13；Grant et al.，1987.Expression andSecretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，Eds.WU & Grossman，1987，Acad，Press，N.Y.，Vol.153，PP.516-544；Glover，1986，DBA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3；and Bitter，1987，Heterotogous Gene Expression inyeast，Methods in Enzymology，Eds，Berger & Kimmel，Acad，Press，N.Y.，Vol.152，PP.673-684；and Fhe Molecular，Biology of the Yeast Saccharmyces，1982，Eds，Strathern et al.，Cold Spring Harbor Press，Vols，I and II。
在使用植物表达载体的场合下，Flk-1编码序列的表达可由任何的启动子引发。例如，可使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19SRNA启动子(Brisson et al.，1984，Nature310511-514)，或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.6307-311)；另一方面，可以使用植物启动子，如RUBISCO的小亚单位(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie et al.，1984，Science 224838-843)；或热休克启动子，例如大豆hsp 17.5-E或hsp 17.3-B(Gurley etal.，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。可利用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等将这些构件引入植物细胞中。为了评述这些技术，例如参见Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，NY.Section VIII.pp.421-463；andGyierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。
可用于表达Flk-1的供选择的表达体系是昆虫体系。在一种这样的体系中，使用Autographa Californica核多汗症病毒(AcNPV)作为表达异种基因的载体。这种病毒在Spodoptera frugiperda细胞中生长。可将Flk-1编码序列克隆入病毒的非本质区(例如多面体基因)并置一种AcNPV启动子(例如多面体启动子)控制下。Flk-1编码序列的顺利插入会导致多面体基因的失活及产生非密闭的重组体病毒(即缺少被多面体基因编码的蛋白质外壳的病毒)。然后利用这些重组体病毒感染Spodoptera frugiperda细胞，在其中该插入的基因被表达了(例如参见Smith et al.，1983，J.Viol.46584；Smith，U.S.Patent NO.4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用一系病毒基的表达体系。在使用腺病毒作为表达载体的场合下，Flk-1编码序列可连接到腺病毒转录/转译对照复合体上，例如后期启动子和三分前导序列。然后这一嵌合基因可通过离体或体内重组被插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非本质区(例如E1和E3区)会形成活的和在感染的宿主中所表达Flk-1的重组体病毒(例如，参见Logan & Shenk，1984，Proc，Natl，Acad.Sci.(USA)813655-3659另一方面，可以使用牛痘7.5K启动子(例如参见Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)797415-7419；Mackett et al.，1984，J.Virol.49857-864；Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.794927-4931)。
也可能需要特定的起始信号以有效地进行插入的Flk-1编码序列转译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在完全Flk-1基因，包括其自己的起始密码子和相邻序列被插入合适的表达载体中的场合下，则不需要任何附加的转译对比信号。然而，在仅有一部分Flk-1编码序列被插入的场合下，则必须提供包括ATG起始密码的外源转译对比信号。此外，该起始密码子必须与Flk-1编码序列的开放读码同相，以保证全体插入物的转译。这些外源转译对比信号和起始密码子可以是多种来源的，天然的和合成的。表达的效率可通过包含合适的转录增强因子成分、转录终止区等而得到增强(参见Bittner et al.，1987，Methods in Enzymol.153516-544)。
此外，可以特定的所需的方式选择调节插入序列的表达或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这类修饰(例如糖基化)和处理(例如分裂)对蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主细胞对蛋白的转译后处理和修饰具有特征性的和专门的机理。可选择合适的细胞系或宿主体系以保证被表达异种蛋白的正确的修饰和处理。为此，可使用具有对基因产物的初级转录、糖基化和磷酸化进行适当处理的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括，但不限于，CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、2P3、W138等等。
对于长期、高产率产生重组体蛋白而言，较佳的是稳定表达。例如，可设计稳定表达Flk-1的细胞系。宁可用由合适的表达控制成分(例如，启动子、增强因子序列、转录终止区、多聚腺苷酸化位点等)所控制的Flk-1 DNA，和选择标记转化宿主细胞，而不使用含有病毒复制源的表达载体。在引入异种DNA后，可使所设计的细胞在加浓的培养基中生长1-2天，然后转换入选择性培养基中。重组体质粒中的选择标记具有抗选择性能并可使细胞稳定地将质粒整合入其染色体中并生长以形成可依次克隆入和扩展成细胞系的病灶。这一方法可有利地用于设计在该细胞表面表达Flk-1，并且应答VEGF传递的信号转导的细胞系。这样设计的细胞系对筛选VEGF类似物特别有用。
可使用一系列选择体系，这些体系包括，但不限于分别在tk-，hgprt-或aprt-细胞中使用的疱疹单式病毒胸苷激酶(Wigler，et al.，1977，Cell 11223)，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska & SzYbalaki，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)，和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy，et al.，1980，cell 22817)的基因。还有，可利用抗代谢物的抗性作为选择具有氨甲嘌呤抗性的dhfr(Wigler，et al.，1980，Natel.Acad.Sci.USA 773567；O’Hare，et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci USA 781527)；具有霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；具有氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin，et al.，1981，J.Mol.Biol.1501)；和具有潮霉素抗性的hygro Santerre，et al.，1984，Gene30147)基因的基础。最近，已公开了另外的选择基因，如使细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；可使细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的his D(Hartman & Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047；)以及具有抗乌氨酸胱羧酶抑制物，2-(二氟甲基)-DL-乌氨酸、DFMO抗性的ODC(乌氨酸胱羧酶)(Meconlogue L，1987，InCurrentCommunications in Molecular Biolgy，Cold Spring Harborlaboratory ed.)。
(2)表达Flk-1的转染子或转化体的鉴别至少可通过四种常用方法对含有编码序列和表达生理活性的基因产物的宿主细胞进行鉴别(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b)存在或没有“标记”基因功能；(c)评价由表达宿主细胞中Flk-1 mRNA转录本所测得的转录水平(d)检测由免疫测定或由其生物活性所测得的基因产物。
在第一种方法中，可通过使用含有分别与Flk-1编码序列或其蛋白或其衍生物同源的核苷酸序列探针的DNA-DNA或DNA-RNA杂交检测在表达载体中所插入的Flk-1编码序列的存在。
在第二种方法中，可根据有或没有某些“标记”基因功能(例如，胸苷激酶活性、对抗生素的抗性、对氨甲喋呤的抗性、转化表型、在杆状病毒中吸留体的形成等等)鉴别和选择重组体表达载体/宿主体系。例如，如果Flk-1编码序列被插入载体的标记基因序列范围内，则可由不存在标记基因功能而鉴别含有Flk-1编码序列的重组体。另一方面，标记基因可在用的相同或不同启动子控制下放置在与Flk-1序列串联的位置以控制Flk-1编码序列的表达。根据诱导或选择，标记的表达表明了Flk-1编码序列的表达。
在第三种方法中，可通过杂交试验测定Flk-1编码区的转录活性。例如，可通过使用与Flk-1编码序列或其特定的部位同源的探针的Northern印迹分离和分析RNA。为与这些探针杂交，可提取和测试宿主细胞的总核酸。
在第四种方法中，例如可通过Western印迹、免疫测定、如放射免疫沉淀、酶连接免疫测定等等从免疫学上评价Flk-1蛋白产物的表达。然而，对该表达体系的成功的最终试验涉及检测生物活性的Flk-1基因产物。可使用多种试验检测受体活性，包括，但不限于，使用设计的细胞系作为试验基质的VEGF结合测定VEGF生物测定。
3.Flk-1受体和设计的细胞系的用途血管形成，新毛细血管的生长需要一系列生理过程，其范围自伤口愈合、组织和器官再生、妊娠后胎盘形成直至胎盘发育。血管的异常增生是多种疾病，如风湿性关节炎、视网膜病，和牛皮癣的重要因素。血管形成也是依赖于血管形成的固体肿瘤生长和复代活性的重要因素。从而，医疗学上可使用血管形成的抑制物以治疗由于或伴随血管异常生长引起的疾病和治疗涉及固体肿瘤的生长和扩散的恶性肿瘤。
在本发明的一个实施方案中，可使用Flk-1受体的和/或表达Flk-1受体的细胞系来筛选用作由Flk-1受体传递的血管形成或维管形成的拮抗剂或拮抗物的抗体、肽、或其它配体。例如，可使用能中和VEGF活性的抗Flk-1抗体以抑制Flk-1功能。此外，可选择与VEGF活性极为相似的抗Flk-1抗体用于伤口愈合。另一方面，以重组体表达的可溶性Flk-1蛋白或表达Flk-1蛋白的细胞系筛选肽库对于通过抑制Flk-1的生物活性鉴别起那种作用的治疗分子是有效的。
在本发明的一个实施方案中，可使用表达完整Flk-1编码区或其配体结合区域的设计的细胞系筛选和鉴别VEGF拮抗物和拮抗剂。可用一系列方法筛选合成化合物、天然产物和其它潜在的生物活性材料来源。可使用如在下文实施例1.(9)中所述的那些标准受体结合技术测定试验化合物对抑制VEGF与Flk-1结合的能力。试剂预防或模仿的能力，在Flk-1表达细胞上VEGF结合对信号转导反应的效果可被测定。例如，可以监控诸如Flk-1激酶活性激活、细胞代谢中的二次信使产生或变化的调节这类应答。这些测定可利用为这些目的而开发的常规技术进行。
(1)以Flk-1蛋白或设计的细胞系筛选肽库可使用由连接在固相载体上的氨基酸全部可能组合所组成的随机肽库鉴别能与给定的受体或其它受体的功能区域，如激酶区的配体结合位点结合的肽(Lam，K.S.et al.，1991，Nature 35482-84)。筛选肽库可能脂在发现通过它们与给定的受体相互作用而起抑制受体生物活性作用的药剂方面具有医疗上的价值。
鉴别能在Flk-1结合的分子可通过以重组体可溶性Flk-1蛋白筛选肽库而完成。在上文2.(1)中描述了表达和提纯Flk-1的方法，该法可根据感兴趣的功能区域用来表达重组体全长Flk-1或Flk-1的片段。例如，Flk-1的激酶和胞外配体结合区可单独被表达并用于筛选肽库。
为了鉴别和分离相互作用并形成含Flk-1的复合体的肽/固相载体，必须示踪或“标记”Flk-1分子。可将Flk-1蛋白与酶，如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶或与其它试剂，如荧光标记物相连接，这些标记物可包括异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或若丹明。可利用现有技术中常规技术进行任何给定标记物与Flk-1的连接。另一方面，可将Flk-1表达载体设计来表达含有对市场可购得抗体而言是存在的抗原决定基的嵌合Flk-1蛋白。可使用现有技术中公知的方法标记该抗原决定基特定抗体，这包括用酶、荧光染料或染色的或磁性的珠标记。
用随机肽库将“标记的”Flk-1结合体在22℃培育30分至1小时以使在Flk-1和库内的肽种类之间形成复合体。然后将该库洗涤以除去任何未结合的Flk-1蛋白。如果Flk-1已与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶结合。则将整个库倾入含有碱性磷酸酶或过氧化物酶的基质，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基(indoyl)-磷酸酯或3，3’，4，4”-二氨基联苯胺(diamnobenzidine)(DAB)的培养皿中。在培育几分钟后，肽/固相-Flk-1复合体改变颜色，并可易于被鉴别以及在带有显微操作器的解剖显微镜下物理分离。如果使用了荧光标记的Flk-1分子，则可通过荧光激活分类分离该复合体。如果使用了表达异源抗原决定基的嵌合Flk-1蛋白，则可通过使用标记的抗原决定基特定抗体完成肽/Flk-1复合体的检测。一旦分离后，可通过肽定序测定连接在固相载体上的肽的同一性。
除了使用可溶性Flk-1分子外，在另一实施方案中，可使用整体细胞检测与细胞表面受体结合的肽。对于以多亚单位和不稳定的受体或以在需要起功能作用的细胞膜的脂质区的受体的应用而言，较佳的是使用完整细胞。在上文2.(1)和2.(2)中已描述了产生表达Flk-1的细胞系的方法。在这一技术中所用的细胞既可是活的也可是固定细胞。这些细胞将用随机肽库培育并将与该库中的某些肽结合以在靶细胞和相关固相载体/肽之间形成“玫瑰花结”。然后该玫瑰花结可通过差速离心法分离或在解剖显微镜下以物理方法去除。
作为完全细胞测定的替代方法，就膜结合的受体或需要起功能作用的细胞膜脂质区的受体而言，可将受体分子重建成能连接示踪或“标记”的脂质体。
(2)抗体产生和筛选现有技术中已知的各种方法都可用于产生抗经重组产生的Flk-1受体的抗原决定基的抗体。这些抗体包括，但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和由一个Fab表达库产生的片段。例如，争夺受体VEGF结合位点的那些中和抗体对诊断和治疗为优选。
可将结合Flk-1的单克隆抗体进行放射性标记以使人们可追踪其在体内注射后的位置和分布。可使用放射性标记的抗体作为重新描绘与一系列疾病有关的血管形成的非侵入诊断工具，这些疾病包括风湿性关节炎、视网膜退化、肿瘤的形成和转移。
也可将针对细胞毒素剂的免疫毒素设在体内的特定位置。例如，可将高亲和性特定单克隆抗体与细菌或植物毒素，如diptheria毒素、相思豆毒素或蓖麻毒共价络合。制备抗体/杂种分子的通用方法可包括使用巯基交联剂，如SPDP，该交联剂将主要氨基团附着在抗体上并通过二硫化物交换将毒素附着在抗体上。可使用杂种抗体专门消除表达内皮细胞的Flk-1。
为了产生抗体，可通过注射Flk-1蛋白使各种宿主动物作免疫接种，这些动物包括，但不限于兔子、小鼠、大鼠等等。可根据宿主种类使用各种佐剂以增强免疫应答，这些佐剂包括，但不限于Freud’s(完全和不完全的)、无机凝胶、如氢氧化铝、表面活性物质，如溶血卵磷脂、环氧乙烷-环氧丙烷多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔嘁血兰蛋白、二硝基苯酚，以及潜在对人体有用的佐剂，如BCG(卡介苗)和Corynebaterium parvum。
抗Flk-1单克隆抗体可通过使用由培养物中传代细胞提供产生抗体分子的任何技术制备。这些技术包括，但不限于Kohler and Milstein最早公开的杂种瘤(hybridoma)技术(Nature，1975，256495-497)、人体细胞杂种瘤技术(Kosboret al.，1983，Immunology Today，472；Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.，802026-2030)和EBV杂种瘤技术(Cole et al，，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。此外，可使用通过将来自合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自合适生物活性的人体抗体分子的基因连接产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger et al.，Nature，312604-608；Takeda et al.，1985，Nature，314452-454)。另一方面，为产生单链抗体所述的技术(美国专利4,946,778)可适于产生Flk-1特定单链抗体。
通过已知技术可产生含有特定Flk-1结合位点的抗体片段。例如，这些片段包括，但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab’)2片段和可通过减少F(ab’)2片段的二硫化物桥而产生的Fab片段。另一方面，可构建Fab表达库以快速并方便地鉴别具有对Flk-1所需特异性的单克隆Fab片段。
4.Flk-1编码序列的用途可将Flk-1编码序列用于检测Flk-1表达的诊断目的。在本发明的范围中包含的是低核苷酸序列，它们包括反义RNA和DNA分子及有抑制Flk-1转录功能的核酶。此外，可在目标细胞种群中表达具有显性阴性效应的Flk-1的突变型以抑制内源表达的野生型Flk-1的活性。
(1)Flk-1编码序列在诊断和治疗中的用途
Flk-1 DNA对诊断由于Flk-1异常表达造成的疾病可能具有一些用途。例如，Flk-1 DNA序列可用于活体解剖或尸体解剖的杂交测定中以诊断Flk-1表达的异常例如，Southern或Northern分析，这包括原位杂交测定。
Flk-1 DNA可用作探针检测Flk-1 mRNA的表达。在本文所述的一个特别实施例中，分析了在不同发育阶段小鼠胚胎中的Flk-1 mRNA表达。Northern印迹分析表明了在9.5天和18.5天之间大量5.5kb mRNA多量表达，而接近姓娠结束明显衰退(图2A)。在出生后4-8天脑毛细管中，与总脑RNA相比，发现Flk-1 mRNA高度富集(图2B)，暗示了Flk-1对内皮细胞增生的作用。
为了得到有关在胚胎发育期间和血管发育的早期阶段中Flk-1表达的更详细的情报，按下面实施例部分1.4(4)中所述，进行了原位杂交试验，原位杂交证实了胚胎鼠发育期间体内Flk-1的表达基本上被限于内皮细胞及其前体(图3和图4)。如Bar所述(1980)，Flk-1在以胚胎脑中所发现的内皮细胞增生和时间以及空间表达模式与神经系统的发充密切相关为特征的生理过程期间，在内皮细胞中被表达。在围神经丛中产生的血管芽径向地生长成神经外层和从此分枝而且发现这些芽表达大量Flk-1 mRNA(图5)。在出生后早期阶段，内皮细胞增生仍很明显并且Flk-1被表达，而在成年生物体中，血管形成完成后，内皮细胞增生的衰退相应于Flk-1表达的降低。
包括起抑制Flk-1 mRNA转译作用的反义RNA和DNA分子以及核酶的低核苷酸序列也在本发明的范围之内。反义RNA和DNA分子通过与目标mRNA结合并防止蛋白转译直接起阻断mRNA转译的作用。就反义DNA来说，较佳的是由转译起始位点，例如Flk-1核苷酸序列的-10和+10区之间得到的低脱氧核苷酸。
核酶为能催化RNA特殊分裂的酶RNA分子。核酶作用的机理包括核1酶分子与补充靶RNA的序列特定杂交，随后细胞核内溶解分裂。特定和有效地催化Flk-1-RNA序列细胞核内溶解分裂的锤头状特色的核酶分子设计在本发明的范围之内。
在任意潜在的RNA靶内的特殊核分裂位点最初通过观测靶分子的，包括如下序列，GUA、GUU和GUC的核1酶分裂位点而得到鉴别。一旦被鉴别后，可评价相应于含该位点靶基因区的15和20核苷酸之间短DNA序列的预期结构特色，如可使核苷酸序列变得不适宜的二次结构。选择物靶的适合性也可通过使用核糖核酸酶保护测定来检测其与补充低核苷酸杂交的可达性而得到评价。
本发明的反义RNA和DNA分子以及核酶都可通过现有技术中已知的合成RNA分子的方法制备。这些方法包括现有技术中公知的化学合成低脱氧核苷酸的技术，例如固相氨基磷酸酯化学合成。另一方面，RNA分子可以通过离体和体内转录将反义RNA分子编码的DNA序列而产生。这些DNA序列也可被掺入结合有合适的RNA聚合酶启动子，如T7或SP6聚合酶启动子的种类广泛的载体。另一方面，取决于所用启动子的结构上或总体上合成反义RNA的反义cDNA构件可被稳定地引入细胞系。
可引入各种对DNA分子的修饰作为提高稳定性和半存留期的手段。可能的修饰包括，但不限于将核苷酸或脱氧核苷酸的侧面序列加入分子的5’和/或3’-末端或使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是低脱氧核苷酸主链内的磷酸二酯酶键。
(2)显性阴性Flk-1突变体于基因治疗中的用途由配体诱导的受体二聚化作用被认为是提供了一种对偶合配体起结合激酶活性刺激作用的变构调节信号。缺陷性受体可通过由无效果的杂二聚物的形成而抑制正常受体活化和响应起了显性阴性突变作用。从而，缺陷性受体可被设计成重组体病毒载体并用于不适当地表达Flk-1的个体中的基因治疗。
在本发明的一个实施方案中，可通过在被选择的细胞中表达来鉴别具有显性阴性效果的突变体形式的Flk-1分子。保持形成具有野生型Flk-1蛋白，但不能在信号转导中起作用的二聚物的能力的Flk-1缺失或错义突变体可用于抑制内源野生型Flk-1的生物活性。例如，Flk-1的细胞激酶区可缺失，结果形成仍能经受与内源野生型受体的二聚化作用，但不能转换信号的平截Flk-1分子。
血管的异常增生是多种致病紊乱，如风湿性关节炎、视网膜病和牛皮癣的一个重要因素。无控制的血管形成也是固体肿瘤的生长和转移中的一个重要因素。重组体病毒可被设计来表达可用于抑制野生型内源Flk-1活性的显示阴性形式的Flk-1。医疗上可将这些病毒用于治疗由Flk-1异常表达或活性所造成的疾病。
由病毒，如逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒群、疱疹病毒、或牛乳头瘤病毒得到的表达载体，可用于将重组体Flk-1传递至靶细胞种群中。可使用现有技术中普通技术人员公知的方法构建含有Flk-1编码序列的重组体病毒载体。例如参见于“Mamiatis et al，，1989，Molecular Cloning A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.N.Y.and Ausubel etal.，1989，Current Protocols in Molecular Biology.GrenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.中所述的技术。另一方面，可将重组体Flk-1分子重建或传送至靶细胞的脂质体。
在本发明的一个特定实施方案中，将Flk-1受体的缺失突变体设计成重组体及转录病毒载体。被称为pLXSN Flk-1TMc1.1和pLXSN Flk-1 TMc1.3的两种克隆分离物含有缺少561 COOH端氨基酸的平截的Flk-1受体。为了得到产生细胞系的病毒，用重组体载体转染PA37细胞，随后使用含有病毒的条件培养基感染GPE细胞。
为了试验信号缺陷的突变体的表达是否抑制内源Flk-1受体活性，将C6大鼠恶性胶质瘤细胞(肿瘤细胞)和产生反转录病毒的小鼠细胞混合并皮下注射入裸鼠中。通常，肿瘤细胞注射入裸鼠会导致肿瘤细胞的增生和所形成的肿块的血管形成。由于Flk-1被认为是形成血管的本质原因所以通过平截受体表达的阻断Flk-1活性可能起抑制发育中的肿瘤的血管形成，借此抑制其生长。如图13和14所说明的，协同注射产生细胞病毒的以表达平截Flk-1受体与仅接受肿瘤细胞的对比物相比显著抑制肿瘤的生长。
5.Flk-1受体或配体的用途
Flk-1和VEGF之间受体/配体的相互作用被认为在维管形成的血管形成期间的信号系统中起重要作用。血管的异常增生是一系列疾病的重要因素。
Flk-1 RNA的表达与脑的发育和与内皮细胞增生相关，这表示了Flk-1可能是一种与在血管形成过程的信号情况调整有关的受体。VEGF已被表明是一种已知专门作用在内皮细胞上的有丝分裂生长因子(Ferrara.N.And Henael，W.J.，1989，Biochem.Boiphys.Res.Comm 161851-858)。按下文实施例1.(9)和1.(10)中所述进行了交联和配体结合试验以确定VEGS是否是一种Flk-1的配体而结果表明，Flk-1是一种可靠的高亲和性VEGF受体(图9)。
在本发明的一个实施方案中，可将Flk-1配体、Flk-1受体本身，或含有其VEGF结合位点的片段体内施用以调节血管形成和/或维管形成。例如，施用Flk-1受体或含有该VEGF结合位点的片段可竞争性地与VEGF的结合并在体内抑制其与天然Flk-1受体的相互作用从而抑制血管形成和/或维管形成。另一方面，Flk-1的配体，包括抗Flk-1抗体或其片段可用于调节血管形成和/或维管形成。VEGF活性的拮抗剂可用于促进伤口愈合。而VEGF活性的拮抗物可用于抑制肿瘤生长。
可根据所治疗的特定情况，配制这些药剂并作系统或局部施用。可在“Remington’s Phaymaceutical Sciences，”(MackPublishing Co.，Easton，PA，)最后一版中可找到配制和施用的技术。合适的方法可包括口服、直肠、跨粘膜、或肠内施药；亲代传送，包括肌肉、皮下、髓内注射、以及膜内、直接心室内、静脉、腹膜内、鼻内，或眼内注射，以上仅列出了很少数。为了注射，本发明的药剂可配制成含水溶液，较佳的是在生理上相容的缓冲剂中，如Hanks溶液、Ringer溶液，或生理盐水缓冲剂。对于跨粘膜施药而言，在配方中可使用适于渗入障碍物的渗透剂。这些渗透剂通常在现有技术中是已知的。
实施例Flk-1高亲和性VEGF受体的克隆和表达模式，以下部分描述和Flk-1 cDNA克隆的克隆和特征。Northern印迹和原位杂交分析表明Flk-1在内皮细胞中被表达。交联和配体结合试验进一步指出了Flk-1是一种高亲和性VEGF受体。
1.材料和方法(1)Flk-1的cDNA克隆使用由8.5天小鼠胚胎的λgt10 cDNA库中提取的DNA(Fahrner et al，，1987，EMBO.J.61497-1508)作为聚合酶链反应的模板(PCR；Saiki，R.K.et al.，1985 Science 2301350-1354)。在一个独立的方法中，将已由出生后4-8天小鼠脑中分离的毛细管内皮细胞的cDNA用于扩增(Risau，W.，1990 Indevelopment of the Vascular System.Issues Biomed.Basel Karger 58-68 and Schnurch et al.，未出版)。根据在由全部RTK共有的激酶区内高度的氨基酸同一性设计退化的引物(Wilks.A.F.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.861603-1607)。
使用32P-标记的(Feinberg，A.P.and Vogelstein，B.1983Anal.Biochem.1326-13)210-bp PCR片段将全长Flk-1的cDNA克隆与由按照OKayama and Berg(1983)的方法制得的另一8.5天小鼠胚胎脑cDNA库，以及11.5天小鼠胚胎λgt11库(Clonetech)分离。
(2)小鼠胚胎将Balb/c小鼠交配过夜并早晨阴道检测被确定为妊娠1/2天。以5M胍基硫氰酸酯将冷冻胚胎均质化以进行Northern印迹分析并按(Ullrich，A.et al.，1985，Nature 313756-761)所述分离RNA。并在使用前保存在-70℃，该胚胎在Tissue-TeK(Miles)中埋置，在液氮表面冷冻以进行原位杂交。
(3)探针的制备将受体cDNA的5’位上的2619bp在pGem 3区域体中(Promega)克隆作为EcoR1/BamH1片段。通过用由随机六核苷酸引发α-32pdATP(Amersham)标记cDNA片段制备Northern印迹杂交的探针(Boehringer；Feinberg，A.P.andVogelstein，B.，1983 Anal.Biochem.1326-13)。
为进行原位杂交，按Schnuch和Risau(Development，1991 1111143-54)所述制备单链反义DNA探针。在cDNA的3’端使质粒直线化并使用SP6RNA聚合酶合成有意义转录本(Boehringer)。使用DNA酶降解DNA(RNAase freepreparation，Boehriger Mannheim)。通过用MMLV逆转录酶(BRL)的逆转录，用该转录本进行α-32S dATP(Amersham)与随机引发的cDNA合成。为得到适于原位骠交的平均约100bp的小cDNA片段，使用大过量的引物。随后在100mMNaOH中于70℃将RNA转录本部分杂交20分钟，并且相同量的HCl中和此探针，用Sephadex C50柱提纯。在乙醇沉淀后，以最终活性为5/105cpm将此探针溶解。用相同方法制备有意义探针以进行对比杂交。
(4)RNA提取和Northern分析按照Chromczynski and Sacchi(1987)的酸酚法分离全部胞质RNA。在1.2％琼脂糖甲醛(Sambrook，J.et al.，1989Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.Cold SpringHabor laboratory Press)凝胶中将Poly(A+)RNA等分试样电泳并转移至硝化纤维素膜(Schleicher & Schuell)上，在50％甲酰胺、5×SSC(750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠)、5×Denhardt’s(0.1％Ficoll 400、0.1％聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpryollidone)、0.1％BSA)和0.5％SDS中于42℃用1-3×106cpm-ml-132p-随机引发的DNA探针进行杂交，随后在0.2×SSC、0.5％SDS中于50℃高强度洗涤。将过滤物暴露4-8天。
(5)原位杂交基本上按照Hogan等人(1986)的方法进行亚克隆的后固定和杂交。在Leitz恒温箱中于-18℃切割10μm厚的切片。对预杂交处理而言不进行用0.2M HCl进行的去除基本蛋白的培育。在含有50％甲酰胺、300mM NuCl、10mM Tris-HCl、10mM NaPo4(pH6.8)、5mM EDTA、0.02％Ficoll 400、0.01％聚乙烯吡咯烷酮(polVinylprolidone)、0.02％BSA、10m/ml酶母RNA、10％葡聚糖硫酸盐、以及10mM NaCl、10mMTris-Hcl，10mM NaPo4(PH6.8)，5mM DETA，10mM DTT的缓冲剂中于52℃用35S-cDNA探针培育这些切割的部分。用Kodak NTB2胶片乳剂涂覆截波片并暴光8天以进行放射自显影照相。显影后，用甲苯胺蓝或May-Crinwald将这些切片复染。
(6)抗血清的制备将包含Flk-1的128c末端氨基酸的3’引发的EcoRV/HindII片段亚克隆在融合蛋白表达载体pGEx3x中(Smith，D.B.And Johnson，K.S.，1990 Gene.6731-40；phamacia)。按所述方法提纯此融合蛋白并用于使兔免疫。如为使兔免疫所用和所述的方法提纯此融合蛋白。在二次增强后，将兔抽血并将抗血清用于免疫沉淀。
(7)Flk-1在COS-1细胞中的过渡表达基本上按Chem和Okayama(1987 Mol.Cell.Biol.72745-2752)和Gorman等人(1989 Virology 171377-385)所述的方法进行COS-1细胞的转染。概括地说，将这些细胞接种至密度为1.0×106/10-cm皿并在含有10％胎牛犊血清(Gibco)的DMEM中培育过夜。将20μg被克隆入细胞肥大病毒启动子驱动的表达载体中的受体cDNA混合在0,5ml的0.25McaCa2、0.5ml的2×BBS(280mMnaCl，1.5mMNa3HPO4、50mMBES、pH6.96)中并于室温培育30分钟。然后将此磷酸钙/DNA溶液加入该细胞中，轻微回荡，并在3％CO2下于37℃培育18小时。将细胞由平板上分离出并按下述方法处理以进行配体结合试验。
为得到VEGF条件培养基，将细胞转染在15cm培养皿中。48小时后收集培养基并通过使用肝素High trap TM柱(pharmacia)的亲和性色谱分析部分提纯VEGF以及通过超滤离心分离(Ferrara，N.And Henzel，W.J.1989Biochem.Biophys.Res，Comm.161851-858)使之浓缩。通过用牛主动脉内皮细胞进行的配体竞争试验测定VEGF的浓度。
为了进行自磷酸化测定，将细胞接种在6井培养皿(2/105细胞/每井)，如上所述地进行转染，并在含有0.5％胎牛犊血清的DMEM中使之饥饿24小时。然后在37℃用500PMVEGF将这些细胞处理10分钟或留下不处理然后用Kvis等人(1985)所述的方法溶解。用兔中得到的抗受体末端的抗血清将Flk-1免疫沉淀。在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离该免疫沉淀物，转移至硝化纤维上，并用针对磷酪氨酸的小鼠单克隆抗体培育(5E2；Fendly，B.M.et al.，1990CancerResearch 501550-1558)。使用辣根过氧化物酶偶合的山羊抗小鼠抗体和ECLtm(Amersham)检测系统观测蛋白带。
(8)VEGF的放射性碘化将重组体人体VEGF(5μg；由Dr、H、Weich慷慨提供)溶于110μl pH7.6的磷酸钠缓冲液中并用Hunter和Greenwood(1962)的方法碘化。将反应产物通过用含有0.7％牛血清蛋白(BSA)的磷酸钠缓冲盐水(PBS)预平衡的交联葡萄糖G50柱与该标记蛋白分离，并在用20％三氯乙酸沉淀之前和之后将所收集馏分的等分试样计数。如由凝胶电泳所测定的，该碘化产物的纯度被计算为超过90％，而比活度为77000cpm/ng。通过使用由Clauss，M.et al.，(1990J.Exp.Med.1721535-1545)所述的组织因子引入测定通过与天然VEGF的生物活性比较，证实碘化VEGF的生物活性。
(9)VEGF与Flk-1的交联在4℃用200PM125I-VEGF将暂时表达Flk-1的COS-1细胞和未转染的COS-1细胞培育过夜，然后用PBS洗涤二次并在4℃暴露在于PBS中的0.5mM二琥珀酰亚胺基基质(DSS)经1小时。将这些细胞溶解，Flk-1免疫沉淀，并通过在7％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后放射自显影照相分析。
(10)VEGF结合按上面所述(Schumacher，R.et al.，1991，J.Biol.Chem.26619288-19295)的方法进行了配体结合试验，转染后将COS-1细胞在15cm培养皿中的DMEM中生长48小时。然后用PBS仔细洗涤细胞并用含5ml的25mMEDTA的PBS培育10分钟。然后从平板上分离细胞，用结合缓冲剂(DMEM，25mMHEPES，pH7.5，0.15％白明胶)洗涤一次并重新悬浮在5ml缓冲剂中以测定细胞数。在15℃用10PM125I-VEGF以500ml总体积将这一细胞悬浮液培育90分钟，并提高未标记配体的浓度(由0-7/10-9)，由暂时表达表达VEGF的COS-1细胞的条件培养基中部分将它们提纯(164氨基酸形式；Breieret al.，1992)。培育后，用冷的0.1％PBS洗涤这些细胞。通过重复离心分离和重新悬浮在结合缓冲剂中将游离配体去除。最后，用γ计数器(Riastar)测定与该细胞结合的125I上的放射性。以Munson，P.J.和Rodbard，D.的方法(1980Anal.Biochem.107220-235)分析所得数据。
(11)将Flk-1转显性阴性突变体编码的逆转录病毒载体将重组体逆转录病毒载体构建成含有Flk-1受体1-806氨基酸的编码区(pLX Flk-1 c1.1和c1.3，图12)。使用含有平截的c-fms受体突变体(pNTK cfmsTM c1.7)的重组体病毒作为对照。为得到产生细胞的病毒，用已为重组体逆转录病毒的DNA转染的PA317细胞的两性(amphotrophic)含病毒条件培养基感染小鼠GPE细胞。或是单独将C6恶性胶质瘤肿瘤细胞植入或是产生细胞的病毒一起共同植入裸鼠中。以下指出了两组试验注射的细胞数。在首次肿瘤出现时开始，每2-3天测量肿瘤体积以得到生长曲线。
试验NO.1
试验NO.2
2.结果(1)Flk-1的分离鉴别在小鼠发育期间被表达的RTK，进行了使用两种根据RTK激酶区内高度保守的序列而设计的简并低核苷酸引物库的PCR测定(Hanks，S.K.et al.，1988，Science 24142-52)。使用从处于许多分化过程开始的小鼠发育阶段8.5天小鼠胚胎的λgt10 cDNA所提取的DNA(Fahrner，K.et al.，1987，EMBO.J.，61497-1508)作为PCR测定中的模板。为了鉴别调节血管形成的RTK，以类似的方法使用类似的引物以增强来自毛细管内皮细胞的RTK cDNA序列，该细胞是从出生后4-8天小鼠脑中在脑内皮细胞增生最大的时刻分离出来的(Robertson，P.L.et al.，1985，Devel.Brain Res.23219-223)。两种方法都产生将最近述及的胎肝脏RTK，Flk-1编码的cDNA序列(图11.SEQ ID NO.)(Matthews，W.et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.889026-9030)。根据氨基酸同源性，这一受体是RTKIII型亚纲中的一员(Ullrich，A.and Schlessinger，J.1990，Cell 61203-212)并与人体flt密切相关，它在其细胞外区域中还含有七种免疫球蛋白类复制物，与之照的那一亚族的其它RTK仅含5种这类复制结构(Mattews，W.et al.，1991，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.889026-9030)。Flk-1与KDR(Terman，B.I.et al.，1991，Oncogene 61677-1683)和TKr-C(Sarzani，R.etal.，1992，Biochem.Biophys.Res.Comm.186706-714)比较，表明这些分别是Flk-1的人和大鼠同源物(图1)。
(2)在胚胎发育期间Flk-1mRNA的表达作为阐明Flk-1生物功能的第一步，在不同发育阶段的小鼠胚胎中分析Flk-1mRNA的表达。Northern印迹杂交试验指出了在9.5天和18.5天之间主要5.5KbmRNA的多量表达，而在接近妊娠结束时显著下降(图2A)。在出生后4-8天的脑毛细管中发现与总的脑mRNA相比Flk-1mRNA高度富集(图2B)。
进行原位杂交以获得有关在不同胚胎阶段中Flk-1表达的更为详细的情报。使用一种含有Flk-1胞外区域的单链反义，261P核苷酸长的DNA探针作为探针，因为它产生最特殊的杂交信号。作为一个例子，图3中示出了14.5天胚胎的平行矢形部分。在心室、肺和脑膜测出高水平的杂交；其他组织，如脑、肝和上颚中显现含有较少的表达Flk-1mRNA细胞。在椎骨的节间区以及在心房和主动脉的内表面处也观察到了Flk-1表达细链。较高倍放大显示了Flk-1的表达似乎被限于毛细管。例如，更接近的心膜检查表明仅在心室毛细管和内皮衬中有阳性信号(图4A)。在肺中，在外围支气管毛细管中测到Flk-1表达，但在支气管毛细管中未测到(图4D)。主动脉显示出在内皮细胞中，而不在肌层中有强烈杂交(图4D)。
(3)在器官血管形成期间Flk-1的表达11.5天小鼠胚胎端脑中的神经外层是一种大维管；第一次维管抽芽开始则径向地侵入由外围神经维管丛形成的器官(Bar，J.，1980，Adv.Anat.Embryol.Cell，Biol.591-62，Risou，W.and lemon.V.1988，Dev.Biol.125441-450)。如图5A中所示，在这一阶段，围神经丛中及在侵入的维管芽中Flk-1表达是高的。这些原位杂交分析指明了血管芽的增生中的内皮细胞表达了Flk-1mRNA血管芽的增生中的内皮细胞。在神经外层已高度血管化的14.5天，神经内丛的一系列径向管以及分枝管则含有大量Flk-1mRNA(图5B)。在当抽芽和内皮细胞增生达到最高时的出生后4天，在内皮细胞中观察到Flk-1mRNA的强烈表达(图5C)。相反地，在血管形成已停止的成年脑中，Flk-1表达非常低(图5D)并显示主要被限于脉络丛(图6)，在此脉络丛中，内血管层中的细胞表达Flk-mRNA，而内皮细胞不表达(图6A、B)。
胚胎肾通过血管形成过程而维管化(Ekblom，P.et al，，1982，Cell.Diff.11.35-39)。肾小球和维管毛细管与上皮形态发生同步发育。在出生后4天的肾中，除了其它毛细管外，在预定的肾小球毛细管中观察到显著的Flk-1表达(图7A)。这一表达继续在成年肾中存在(图7C)而且与出生后初期的肾比较似乎证实了于肾小球中的这一表达。
(4)内皮细胞先祖中的Flk-1的表达为了探查血管发育早期阶段中Flk-1的可能参与，进行了在血岛形成期间不同阶段的胚胎分析。在8.5天胚胎蜕膜的矢形部分，在蜕膜中的母体血管中。Flk表达在卵黄囊中和滋养外胚层中被测到了。在尿囊中和胚胎内也发现了Flk-1mRNA，主要位于发现间质的部分(图8A)。在母体蜕膜的高倍放大时，在由内皮细胞组成的血管内衬中发现了高度的Flk-1mRNA表达(图8B)。在卵黄囊中，杂交信号仅被限于或血管细胞在其中分化的中胚层(图8C)。图8D显示了高倍放大的血岛，其中周边或血管细胞表达了高水平的Flk-1mRNA。
(5)Flk-1是一种对VEGF高亲和性受体原位杂交结果的详细测定及与最近由Breier，G.等人(1992，Development 114521-532)报导的关于VEGF那些杂交的结果相比显示了表达模式的显著相似性。此外，在肾小球内层中的Flk-1的表达和在围绕的上皮细胞中的VEGF(Breier，G.et al.，1992，Development 114521-532)造成在这些细胞类型之间分泌关系的可能性并从而分别表示了VEGF和Flk-1的配体-受体关系。为了试验这一假设，将全长Flk-1cDNA克隆入含有人体细胞肥大病毒的转录对比要素的哺乳动物表达载体pCMV中(Gorman，C.M.et al，，1989，Virology 171377-385)。为了该受体的短暂表达，则将Flk-1表达质粒转染入COS-1或纤维细胞。
通过交联和竞争结合试验测定了VEGF与Flk-RTK的特定结合。用以pCMV-Flk-1表达载体转染的COS-1细胞培育提纯的125I标记的VEGF。与DSS的交联及随后的免疫沉淀、PAGE、和放射性自显影照相分析显示出在用未转染的COS-1细胞的对比试验中未测得的约220KD带，并可能是代表VEGF/Flk-1受体的复合体(图9A)。此外，VEGF与125I-VEGF争夺而与表达COS-1细胞的Flk-1的结合(图9B)，而未转染的COS-1细胞不结合125I-VEGF。VEGF与在转染细胞上的受体的相互作用是特定的，如PDGF-BB不与125I-VEGF的结合竞争。结合数据分析显示了约为10-10M Kd。这表示Flk-1是一种VEGF的高亲和性受体。这一发现，与Flk-1和VEGF原位杂交结果强烈地表示了Flk-1是一种对VEGF的生理上相关的受体。
进行了自动磷酸化测定以证实VEGF与Flk-1受体结合的生物相关性。在含有0.5％胎牛犊血清的DMEM中使短暂表达Flk-1的COS-1细胞饥饿24小时，用0.5mMVEGF刺激，并溶解。用Flk-1特定多克隆抗体CT128使该受体免疫沉淀，然后通过SDS-DAGE分析并随后使用抗磷酪氨酸抗体5E2进行免疫印迹(Fendly，B.M.et al.，1990，CancerResearch 501550-1558)。图10中示出的是，Flk-1表达细胞的VEGF刺激导致显著诱导了180KD Flk-1受体的酪氨酸磷酸化。
(6)通过Flk-1转显性-阴性抑制来抑制肿瘤细胞Flk-1受体被认为在维管形成和血管形成中起主要作用。因而，抑制Flk-1的活性可抑制发育中的肿瘤的血管形成并抑制其生长。为了试验这一假设，将肿瘤细胞(C6大鼠恶性胶质瘤)和产生将平截Flk-1受体编码的重组体逆转录病毒的小鼠细胞混合并皮下植入裸鼠中。值入的C6细胞分泌会结合并激活在小鼠内皮细胞表面上表达的Flk-1受体的VEGF。在没有任何血管形成的抑制物时，该内皮细胞会增生并向肿瘤细胞转移。另一方面，如果在注射时，肿瘤细胞与产生将显性-阴性Flk-1编码的重组体逆转录病毒协同注射，则向植入的肿瘤细胞生长的内皮细胞会变得被重组体逆转录病毒所感染，这可能导致显性-阴性Flk-1突变体表达并抑制内源Flk-1信号。内皮细胞增生和迁移的抑制会导致被植入细胞变为血管化的失败。这将导致抑制肿瘤生长。如图12和13所示，在接受产生平截Flk-1细胞移植的小鼠中，肿瘤生长显著地被抑制，这表明了平截Flk-1的表达可以显性-阴性的方式起到抑制内源野生型Flk-1活性的作用。
本发明不限于例证性实施方案的范围，它们旨在说明本发明单个方面，而在功能上等同的任何克隆、DNA或氨基酸序列均在本发明的范围之内。事实上，除了本文已述之外，本发明的各种变更，根据上述陈述及附图对现有技术的普通技术人员将是显而易见的。这些变更将纳入待批的权利要求的范围之内。
也要理解到的是，对核苷酸所给出的所有碱基对大小均为近似值并用于说明目的。
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1.编码多肽的多核苷酸在制备用于治疗与VEGF和/或FlK-1介导的哺乳动物血管增殖有关的疾病的药物中的应用，其中该多肽，(i)包含有功能的FlK-1的细胞外区和跨膜区域，(ii)缺乏细胞质区域，且(iii)是信号无效的，使得内源性野生型FlK-1对于VEGF不应答。
2.权利要求1的应用，其中所述疾病选自类风湿关节炎，视网膜病和实体瘤。
3.编码多肽的多核苷酸在制备用于抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖的药物中的应用，其中该多肽，(i)包含有功能的FlK-1的细胞外区和跨膜区域，(ii)缺乏细胞质区域，且(iii)是信号无效的，使得内源性野生型FlK-1对于VEGF不应答。
4.编码多肽的多核苷酸在制备用于在受治者体内FlK-1信号传导的药物中的应用，其中该多肽，(i)包含有功能的FlK-1的细胞外区和跨膜区域，(ii)缺乏细胞质区域，且(iii)是信号无效的，使得内源性野生型FlK-1对于VEGF不应答。
5.编码多肽的多核苷酸在制备用于抑制血管形成和/或维管形成的药物中的应用，其中该多肽，(i)包含有功能的FlK-1的细胞外区和跨膜区域，(ii)缺乏细胞质区域，且(iii)是信号无效的，使得内源性野生型FlK-1对于VEGF不应答。
6.编码多肽的多核苷酸在制备用于治疗与VEGF和/或FlK-1介导的哺乳动物血管增殖有关的疾病的药物中的应用，其中该多肽包含SEQID NO2的1-806位氨基酸但是不含有SEQ ID NO2的807-1367位氨基酸。
7.权利要求6的应用，其中所述疾病选自类风湿关节炎，视网膜病和实体瘤。
8.编码多肽的多核苷酸在制备用于抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖的药物中的应用，其中该多肽包含SEQ ID NO2的1-806位氨基酸但是不含有SEQ ID NO2的807-1367位氨基酸。
9.编码多肽的多核苷酸在制备用于在受治者体内FlK-1信号传导的药物中的应用，其中该多肽包含SEQ ID NO2的1-806位氨基酸但是不含有SEQ ID NO2的807-1367位氨基酸。
10.编码多肽的多核苷酸在制备用于抑制血管形成和/或维管形成的药物中的应用，其中该多肽包含SEQ ID NO2的1-806位氨基酸但是不含有SEQ ID NO2的807-1367位氨基酸。
11.一种重组载体，含有编码截断的FlK-1的核苷酸序列，其中的FlK-1缺乏功能性FlK-1细胞质区域，但是含有有功能的FlK-1细胞外区域和跨膜区域，而且抑制VEGF结合的细胞效应。
12.权利要求11的重组载体，其中该载体选自逆转录病毒载体，腺病毒载体或疱疹病毒载体。
13.权利要求11的重组载体，它包含编码SEQ ID NO2的1-806位氨基酸的核苷酸。
14.权利要求11的重组载体，它由编码SEQ ID NO2的1-806位氨基酸的核苷酸组成。
全文摘要
本发明涉及使用Flk－1受体的配体以调节血管形成和维管形成。本发明部分是以基于Flk－1酪氨酸激酶受体表达与内皮细胞相关的证实并及血管内皮生长因子(VEGF)作为Flk－1的高亲和性配体的鉴定为基础的。这些结果指明了在维管形成和血管形成期间在信号系统中Flk－1的主要作用。公开了因表达Flk－1的宿主细胞的基因工程设计以及被表达的Flk－1对评价和筛选与通过激动剂或是拮抗剂活性的Flk－1调节相关的VEGF药物和类似物的用途。本发明也涉及Flk－1配体，包括VEGF激动剂和拮抗剂，在通过调节维管形成和血管形成治疗疾病，包括癌症上的用途。
文档编号A61K31/535GK1701814SQ20041007897
公开日2005年11月30日 申请日期1993年11月13日 优先权日1992年11月13日
发明者阿克塞尔·乌尔里希, 维尔纳·里绍, 比吉特·米劳尔 申请人:马克斯普朗克科学促进协会