专利名称：生物活性材料与生物适合聚合物中的羧基按1∶1的比例结合,包括制备方法及相同的药 ...的制作方法
技术领域：
本发明是关于生物适合聚合物与生物活性分子按1∶1的摩尔比结合，包括制备方法及相同的药用成分。尤其是本发明通过特定的生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按1∶1的摩尔比结合，包括制备方法及相同的药用成分。
背景技术：
将蛋白质及肽用作医药产品通常受几个问题的限制。不如说，肽或蛋白质在活的有机体内的吸收率非常低，其原因在于二者在进入体内很短时间内就容易被蛋白酶水解或降解，同时重复操作时还会引起免疫反应。因此，大多数蛋白质或肽药品每天注射至少一次或多次，频繁的注射会导致患者的疼痛及危险，长期的注射对患者来说昂贵而且不方便。
需要尝试研制更稳定药物以解决以上问题，利用生物适合聚合物改良生物活性材料(如蛋白质、多肽)的技术已有所发展。蛋白质或药用活性分子与生物适合聚合物的结合，在将其应用于生物体内外时会体现出很多优点。生物活性分子通过共价键与生物适合聚合物结合后，其会显示出改良的表面性能及溶解性，这会提高其在水及有机溶剂中的溶解性。此外，生物适合聚合物还会使得与之连接的蛋白质或多肽在有机体内更加稳定，增加蛋白质的生物适合性并降低免疫反应，也会降低肠、胃、脾、肝等对蛋白质的清除率。
尽管生物活性材料(蛋白质或肽)与生物适合聚合物(如PEG)的结合有许多好处，但所知方法在结合中存在一些问题。
多数的结合方法是将活性PEG键合到氨基酸残基(如赖氨酸)的氨基上。当将蛋白质表面的活性部位连接到PEG上时，由于很多蛋白质的一个或更多游离的赖氨酸残基频繁接近活性部位，蛋白质-聚合物结合物的生物活性大大减低了。同时，蛋白质的赖氨酸残基与活性PEG之间容易发生反应，得到PEG-蛋白质结合物，其中两个或更多的PEG分子连接到一个蛋白质分子之上。举例来说，当超过两个的PEG分子连接到细胞因子(如干扰素、CSF及白介素)或多肽(如EGF、hGH、胰岛素)表面时，结合物的生物活性迅速降低而导致失效。同时，此类反应会随机发生，从而导致了多种PEG-蛋白质结合物，这使得所需结合物的提纯复杂且困难。如果太多的聚合物分子连接到目标蛋白质或肽上，结合物会失去全部或大部分的生物活性。此外，如果使用了表观活性连接剂或连接到目标蛋白质分子的聚合物数量不足，则结合物的治疗效果降低。
为克服以上问题，已经尝试了采用遗传工程将聚合物结合到蛋白质的特定部位，以此取代将生物适合聚合物结合到蛋白质的氨基酸残基上。然而，此方法通常改变了蛋白质的原始性能，同时遗传工程分子作为医用药物的安全性也有待改进。
也曾通过化学改良生物活性材料结合聚合物的特定部位来解决问题。美国专利第5951974及5985263号描述了将PEG分子结合到干扰素的组氨酸残基上，通过延长药物在有机体内的半衰期来提高疗效。然而，本方法仍然使用了活性氨基，并会随机在组氨酸的一些部位上产生PEG-IFN异构体，这需要采用离子交换柱进行额外的提纯步骤，将所需的1∶1结合物与PEG-IFN分离。此外，较之其他的氨基酸氨基，组氨酸结合了PEG的咪唑基容易水解，使得组氨酸容易从PEG一组氨酸结合物中脱离。
美国专利第5766897号描述了大分子与突变体的结合，其中半胱氨酸残基连接活性PEG分子。由于大多数蛋白质分子含有一个自由地二硫键，或者无剩余的半胱氨酸，所以非活性部位的氨基酸可能会通过突变转变为半胱氨酸残基而与聚合物结合。此方法将聚合物结合到了生物活性分子的特定部位，尽管具有此优点，较之氨基或羧基的结合物，本方法产品的活性大大降低。
美国专利第5985265号描述了将活性部位在G-CSF和IFN的N端与PEG分子结合。然而，此类活性聚合物的反应性较差，且反应需要较长的时间。此外，本反应的产率低且蛋白质稳定性差。如果蛋白质的活性部位特别接近N端，则在N端氨基结合会导致生物活性大大减低或消失。
美国专利第5824778号描述了通过PEG在氨基或羧基结合G-CSF。加入过量的EDAC活化蛋白质中的羧基，将大量的PEG结合到活性羧基上。得到的PEG-G-CSF确定为不均匀的混合物，其中含有大量结合的PEG分子，且结合物的生物活性大大降低。因此，如果在特定比例下，与聚合物连接后的生物活性分子其活性得以保持，并且得到同质的特定部位连接体，则此类分子的临床应用性显著提高。
发明内容
本发明按1∶1的比例制备了PEG-生物活性分子结合物，其中PEG连接到生物活性分子的羧基上。生物活性分子的羧基较之氨基反应性较低。据观察，由于本结合物比天然蛋白质(未结合)具有更长的半衰期及更高的稳定性，因此其治疗效果要高于天然蛋白质20倍。
同时1∶1比例的结合物性能要优于那些大于1∶1比例的结合物(在羧基或氨基结合)。
因此，本发明是关于生物适合聚合物与生物活性分子的结合，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按1∶1的摩尔比结合，包括制备方法及相同的药用成分。本发明的结合物保留了生物活性分子的生物活性，并增强了稳定性、生物实用性及半衰期。
图1为mPEG(5K)-H与z-G-CSF通过HPLC及SDS-PAGE的结合度。
图2为(20K)-Hz-G-CSF通过HPLC及SDS-PAGE的结合度。
图3为1∶1比例的mPEG(5K)-Hz-IFN于SDS-PAGE上。
图4为相应于EDAC添加于SDS-PAGE的量，mPEG(20K)-Hz-IFN结合物的产率。
图5为相应于EDAC的添加方法及添加于SDS-PAGE的量，mPEG(20K)-Hz-IFN结合物的反应程度。
图6为通过离子交换柱对mPEG(20K)-Hz-IFN的SDS-PAGE进行提纯。
图7为通过细胞化验比较mPEG(20K)-Hz-IFN结合物、天然G-CSF及NeulastaTM(PEG-G-CSF，Amgen研制，2002年FDA通过)的生物活性。
图8为mPEG(20K)-Hz-IFN结合物、天然G-CSF及NeulastaTM(PEG-G-CSF，Amgen研制，2002年FDA通过)的血浆半衰期比较。
图9为mPEG(20K)-Hz-IFN结合物、天然G-CSF及NeulastaTM(PEG-G-CSF，Amgen研制，2002年FDA通过)的WBC。
图10为通过细胞化验比较mPEG(12K)-Hz-IFN结合物、天然IFN及PEG-IFN(Schering-Plough研制)的生物活性。
图11为通过细胞化验比较mPEG(20K)-Hz-IFN结合物、天然IFN的生物活性。
图12为通过细胞化验比较Di-mPEG-Hz-IFN结合物、两个PEG分子连接到一个IFN分子、单向mPEG-Hz-IFN、一个PEG分子连接到一个IFN分子的生物活性。
图13为PEG(20K)-Hz-IFN结合物、天然IFN及PEG-IFN(Schering-Plough研制)的血浆半衰期比较。
图14为PEG-IGN连接体于羧基和氨基的稳定性比较。
图15为未通过生物适应聚合物改良的天然PTH的HPLC色谱图。
图16为提纯之前PTH与mPEG(20k)-Hz反应混合物(未反应的PTH，mPEG(20K)-Hz-PTH，mPEG(20K)-Hz)的HPLC色谱图。(峰1未反应的带有PEG的PTH，峰2mPEG(20k)-Hz-PTH)。
图17为PTH与mPEG(20K)-Hz结合后经提纯的mPEG(20k0)-Hz-PTH的HPLC色谱图。
图18为SDS-PAGE，以库马西蓝染色作，PTH与mPEG(20k)-Hz的反应产物(线1M标志，线2PTH，线3PTH，提纯前的PTH-mPEG(20k)-Hz结合物，线4提纯后的PTH-mPEG(20k)-Hz结合物)。
图19为PTH和PEG-PTH的有机体内生物活性。
图20为老鼠体内PTH和PEG-PTH的半衰期。
具体实施例方式
一方面，本发明是关于生物适合聚合物与生物活性分子的结合，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按1∶1的摩尔比结合。
另一方面，本发明涉及药用组成，包括具有治疗效果的以上生物适合聚合物-生物活性分子结合物，以及药用上可接受的载体。
进一步说，本发明涉及生物适合聚合物与生物活性分子的按1∶1的摩尔比结合的制备方法，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按结合，包括将生物活性材料结合到生物适合聚合物上的步骤，其在反应条件下逐步添加结合剂，生物活性材料与生物适合聚合物的摩尔比为1∶1-1∶20，与结合剂的摩尔比为1∶1-1∶50，PH值2-5。
在上述方法中，EDAC作为结合剂加入，其在水溶液中易于水解，所以应不少于5次逐步加入(最适宜的为5或6次)。
上述方法为生物适合聚合物与生物活性分子的按1∶1的摩尔比结合。换句话说，本发明通过生物适合聚合物与生物活性材料的按1∶1的摩尔比结合，进行特定部位结合。由于阻止了聚合物结合到活性部位上，所以此类结合物保持了生物活性材料的生物活性。同时，本发明通过1∶1摩尔比的结合，避免了许多活性残基的随机反应，从而不会出现各种异质的混合物。此外，此类结合物还有其他优点比如提高了有机体内稳定性、提高了生物活性、通过生物适应聚合物延长了半衰期。因此，与其他方法相比较，本发明的同质生物适合聚合物-生物活性分子结合物省时且节约成本。
WO92/16555描述了卵清蛋白于羧基或醣基处与PEG-酰肼(包含氨基酸间隔区)的反应。然而，其只描述了PEG分子的结合，没有提及按1∶1的摩尔比将生物适合聚合物与生物活性材料的结合的制备方法，也未提及结合物的生物活性。
此外，美国专利第5824779号描述了将PEG连接至G-CSF的羧基上，但按此方法制备的结合物活性很低，原因在于几个PEG分子随机地连接在G-CSF的天冬酰胺酸或谷氨酸上。
对于特定连接或者根据反应中氨基酸的Pka值的差值确定的连接聚合物的数量，控制反应条件时存在一些问题。
当在PH值7-8范围进行赖氨酸氨基反应时，组氨酸也随机反应。同时，当PH值低于6-6.5时，组氨酸较之赖氨酸更易与PEG反应(美国专利第5951974及5985263号)。根据以上方法，在PH值小于等于3、摩尔比1∶1条件下，PEG可以连接至羧基，尤其是生物活性材料的C端。
因此，本发明是涉及生物适合聚合物与生物活性分子的结合，其中活性生物适合聚合物按1∶1的摩尔比与生物活性材料中的C端结合。
另一方面，本发明涉及药用组成，包括药用上可接受的结合物数量，，其中活性生物适合聚合物按1∶1的摩尔比与生物活性材料中的C端结合，以及药用上可接受的载体。
进一步说，本发明涉及在生物活性材料的C端，将生物适合聚合物与生物活性材料按1∶1的摩尔比结合的制备方法，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按结合，包括将生物活性材料结合到生物适合聚合物上的步骤，其在反应条件下逐步添加结合剂，生物活性材料与生物适合聚合物的摩尔比为1∶1-1∶20，与结合剂的摩尔比为1∶1-1∶50，PH值2-5。
生物适合聚合物用于生物活性分子结合的结合材料一词，其意义为任意可以与生物活性分子连接的生物适合聚合物，如天然或合成的聚合物。
生物适合性是指与活体组织或系统相适合，在体内无毒、不发炎、不引起免疫反应以及无致癌作用。
生物适合聚合物与生物活性材料相结合，本发明采用的聚合物易溶于各种溶剂，分子量约为300-100000Da(更适宜的重量为2000-40000Da)，生物适合聚合物包括以下列举这些，但并不局限于此聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚对苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亚胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亚烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺、共聚物及其他非免疫原聚合物。
本发明采用的生物适合聚合物不仅包括线性聚合物，还包括以下聚合物可溶性的、非抗原性聚合物，其连接在活性功能基上，这样可通过脂肪族连接残基进行亲核取代(美国专利第5643575、5994455号)。此外还有多支臂、单功能、水解稳定性聚合物，其具有两个连接片断(中心碳原子周围具有聚合物支臂)；一个可活化的残基以连接到生物活性材料上，如蛋白质；以及支链，其可以是氢、甲基或者其他连接片断美国专利第5932462号)。本发明使用的生物适合聚合物还可以是有支臂的PEG，其中的功能基可通过带有残基的连接支臂与生物活性材料相结合(WO00/33881)。
其中，PEG是本发明中最普通的生物适合聚合物。通常，PEG是一种无毒、亲水性的聚合物，带有重复单元HO-(CH2CH2O)n-H。各种蛋白质与PEG结合后可以在血浆中延长半衰期，提高稳定性，降低免疫原性。
连接到生物活性材料(蛋白质、肽)上的PEG分子量范围约为1000-100000Da，超过1000Da的PEG的毒性很低。1000-6000Da范围的PEG分布于整个体内并于肾中清除。40000Da的支臂PEG分布于血液或器官内，包括肝脏，并于肝脏内产生代谢变化。
由于各种分子量范围的PEG都购买得到，所以其是最合适的生物适合聚合物。每一个氧乙烯基单元都具有亲水性，可以结合2-3个水分子。PEG从甲氧基聚氧乙烯(易于合成)中衍生出一端功能基，PEG不易发生抗原-抗体反应，其相关技术已得到较大发展。
生物活性材料生物活性分子是指所有可以与生物适合聚合物结合的亲核试剂，且结合之后至少会保持一定的生物活性。此处提到的生物活性不局限于生理或药用上活性。举例来说，一些含酶类的亲核试剂，其结合物可在有机溶剂中催化反应。相似地，一些包含蛋白质的聚合物结合物，如刀豆球蛋白或免疫球蛋白，可以于实验室内用作诊断之用。通常，生物活性分子可以通过重组或化学法从天然或合成的材料中分离，包括蛋白质、肽、多肽、酶、生物药剂、基因、质粒或有机残基。
包括蛋白质、肽、多肽但不仅仅局限于此血红蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、细胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干扰素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板来自生长因子(PDGF)、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲状腺激素(PTH)。其他基因生物或药用蛋白质包括胰岛素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、肿瘤坏死因子(TNF)及相关的等位基因、成长因子(如组织成长因子TGF、TGFβ和表皮成长因子)、激素类(如滤泡刺激激素、甲状腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黄体激素-释放激素及其衍生物)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、人造脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促性腺激素、纤溶酶原激活物、肽释放生长因子(GHRP)、胸腺体液因子(THF)，诸如此类。免疫球蛋白类包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片断。
当两个或更多生物适合聚合物连接到低分子量多肽(如干扰素、G-CSF)时，此结合物的生物活性相当低。此外，当相对高反应性的氨基连接两个或更多生物适合聚合物时，在1∶1化合物中分离结合物并不容易。然而，本发明提供了1∶1化合物中生物适合聚合物-IFN或生物适合聚合物-G-CSF的选择性制备，其中此类结合物生物活性高，半衰期延长，生物利用率优异。
本发明的生物活性材料还包括任意经证实具有生物活性的多肽。这包括氨基酸族，抗致敏低聚物，抗体片断，线性抗原(参阅美国专利4946778)，结合分子包括抗体或片断的融合，多株抗体，单株抗体，催化抗体，核苷酸，寡核苷酸等。
生物活性材料也包括酶类。酶类包括碳水化合物酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶及连接酶；未限定的特殊酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化岐化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶及胆红素氧化酶等；碳水化合物酶包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、牛乳糖苷酶、葡糖脑苷脂、葡萄木二糖酶等。
上述例子是本发明中适合与生物适合聚合物结合的生物活性亲核试剂。即使以上并未提到，所有带有亲核基的适宜生物活性材料均包含于本发明内。本发明所用生物活性材料要求至少有一个羧基，使得其与聚合物结合。
本发明的结合物具有生物活性，并以医药应用为目的。包含生物活性材料的聚合物结合物，其有效医用剂量可通过哺乳动物进行测试。
生物适合聚合物-生物活性材料结合物的制备为将生物适合聚合物与生物活性分子结合，聚合物的一个端基需转化成反应性功能基。此过程称为活化，其产物称作活化聚合物。举例来说，将聚乙烯(烯化氧化物，PAO)与肽或蛋白质结合，可将其一个羟基转化为反应功能基(如碳化)，由此得到室温下可溶的活化PAO。此基团包括单取代的聚乙烯(烯化氧化物)衍生物，如mPEG，或者其他合适的、含有Cl 4端基烷基取代PAO。
此处所用的反应功能基指的是活化生物适合聚合物，使之与生物活性材料相连接的基团或残基。
本发明的反应功能基，从可以与羧酸反应的功能基和反应性羰基中选择。举例来说，首选胺或者肼及酰肼功能基(如酰基酰肼、卡巴肼、氨基脲、硫卡巴腙等)。
此处提到的“羧基结合剂”(以下称为结合剂)，指的是可以将生物活性材料中的羧基与生物适合聚合物(已经过活化处理)结合的任何试剂。
本发明所用结合剂包括如下几种，但并不局限于此EDAC[N-(3-二甲基-氨丙基)-N’-乙烷基碳二亚胺氢氯]、DIC[1，3-二异丙基碳二亚胺]、DCC[双环己基碳二亚胺]及EDC[1-乙烷基-3-(3-二甲氨基丙烷基)-碳二亚胺]，最适宜的结合剂为EDAC。
本发明结合物的制备方法包括以下步骤含有亲核试剂的生物活性分子与活化的生物适合聚合物发生取代反应，并且足够的结合物至少保持一部分生物活性分子内在的生物活性。
生物活性材料与过量的生物适合聚合物反应，以此制得1∶1比例的生物活性材料-生物适合聚合物结合物。举例来说，在制备蛋白质-聚合物、肽-聚合物、酶-聚合物、抗体-聚合物以及药物-聚合物过程中，生物活性材料与生物适合聚合物比例控制在1∶1-1∶20，更适宜的比例为1∶1-1∶10。用以活化生物活性材料羧基的试剂可作如下选择，但并不局限于此。例如EDAC([N-(3-二甲基-氨丙基)-N’-乙烷基碳二亚胺氢氯])；水溶性碳二亚胺基，如3-[2-吗啉基-(4)-乙烷基]；5-异唑盐，如p-甲苯磺酸盐，伍德沃试剂K。
本发明中生物活性材料与EDAC的摩尔比控制在1∶1-1∶50，更适宜的比例为1∶1-1∶30，最适宜的比例为1∶1-1∶20。然而，当EDAC分不少于5次逐步加入(最适宜的为5或6次)加入，而不是20倍摩尔一次加入时，PEG-生物活性材料结合物的产量提高，其原因在于EDAC在水溶液中容易发生水解。
生物活性材料与活化聚合物的结合反应依赖与水溶液(起缓冲作用)的PH值。通常，蛋白质/多肽的反应缓冲PH值为2-5，更适宜的范围为2.5-4.5。本发明得到了此类物质稳定的最佳反应条件及产量结合反应的最佳温度范围为0-60℃，更适宜的范围4-30℃。溶剂的温度不应超过蛋白质或多肽的变性温度。同时，适宜的反应时间为10min-5h，制得的结合物可以通过柱层析或渗滤(或二者结合)恢复或提纯。
药用合成本发明还涉及药用合成，包括活化生物适合聚合物-生物活性材料结合物作为活性成分的有效剂量。
“药用可接受性”指的是人服用后不会导致过敏或相似的反应。
生物适合聚合物-生物活性材料结合物作为药用合成的成分可以单独，或者与药用可接受的载体复合，以此用作疾病预防及治疗。
药用可接受的载体指的是药用可接受的分子、成分或介质，如溶液、稀释液、赋形剂或溶剂等，利用其将生物活性材料在器官或组织之间传输。
本发明的药用组成可通过如下路线执行口服、局部注射、注射，其配方包括生物适合聚合物-生物活性材料结合物作为活性成分的有效剂量。本发明用于口服的配方包括药丸、药片、包衣片剂、颗粒、包药干糊片、酏剂、硬质及软质胶囊、溶液、糖浆、乳剂、悬浮液或喷雾等；注射用配方包括注射液、微胶囊及其他。
可利用静止性的无机或有机添加剂，根据已知的方法确定药用配方。举例来说，乳糖、玉米淀粉及其衍生物、滑石、硬脂酸及硬脂酸盐可用于制备药丸、药片及硬质胶囊；软质胶囊及栓剂的添加剂可以使用油、蜡、半固态或液态的多元醇、天然或固态油；溶液及糖浆剂的添加剂可使用水、蔗糖、转化酶、葡萄糖及多元醇；注射用溶液的添加剂可使用水、乙醇、甘油、多元醇、植物油等。注射用溶液可用作防腐剂、止痛剂、增溶剂及稳定剂的组合。局部用配方也可用作麻醉剂、稀释液、润滑剂及防腐剂的组合。微胶囊或移植术的添加剂可以使用共聚物、羧基乙酸或乳酸。
本发明中生物适合聚合物-生物活性材料结合物的剂量随以下因素变化，生物活性材料的吸收率、溶解度、患者年龄、性别、环境及疾病程度等。
本发明中生物适合聚合物-生物活性材料结合物的注射间隔从每天一次、两天一次至每周、两周一次递减。因此，药品的毒性及影响检测频率也相应降低。
通过以下的例子对本发明进行深入的阐述及论证。单独列出的例子用以说明而不是局限本发明，其中有很多没有背离本发明的精神及范围的变化。
1.通过生物活性材料的羧基制备生物适合聚合物-生物活性材料结合物例1制备mPEG(12000)-Hz-G-CSF结合物1mgG-CSF溶液(0.00005mmol，Dong-A Pharm.LEUCOSTIM)，以50mM的MES缓冲溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到2mg/ml。对此蛋白质溶液，加入6.6mg的mPEG(12000)-Hz(ISU Chemical，Korea，0.0005mmol)。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩尔过量)。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的G-CSF及过量的试剂，得到0.3mg以上的mPEG(12000)-Hz-G-CSF结合物。改变EDAC用量从20-200倍摩尔过量，mPEG(12000)用量从10-20倍摩尔过量，重复进行实验。当EDAC用量超过50倍摩尔过量时，可观察到两个或更多mPEG(12000)-Hz连接到G-CSF上。
例2制备mPEG(5000)-Hz-G-CSF结合物1mgG-CSF溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES缓冲溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到5mg/ml。对此蛋白质溶液，加入1.3mg的mPEG(5000)-Hz(ISU Chemical，Korea，0.00025mmol)。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H2O中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩尔过量)。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的G-CSF及过量的试剂，得到0.3mg以上的mPEG(5000)-Hz-G-CSF结合物。图1为通过SDS-PAG所制mPEGE(5000)-Hz-G-CSF结合物产品及HPLC剖面图(排阻色谱法)。
例3制备mPEG(20000)-Hz-G-CSF结合物1mgG-CSF溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES缓冲溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到5mg/ml。对此蛋白质溶液，加入5mg的mPEG(20000)-Hz(ISU Chemical，Korea，0.00025mmol)。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩尔过量)。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的G-CSF及过量的试剂，得到0.3mg以上的mPEG(20000)-Hz-G-CSF结合物。图2为通过SDS-PAGE所制mPEG(20000)-Hz-G-CSF结合物产品图(排阻色谱法)。
例4制备mPEG(5000)-Hz-IFN结合物四只试管分别盛有200ugIFN溶液(0.00001mmol，Korea Green Cross Corp.，Green Alpha)，分别以50mM的MES缓冲溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到1mg/ml。对每只试管，加入2.16mg的mPEG(5000)-Hz。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H2O中配制0.8μl EDAC溶液(0.001mmol，40倍摩尔过量)。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的IFN及过量的试剂。图3为通过SDS-PAGE所制mPEG(5000)-Hz-IFN结合物图。
例5制备mPEG(12000)-Hz-IFN结合物1mgIFN溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES缓冲溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到1mg/ml。对此蛋白质溶液，加入6.6mg的mPEG(12000)-Hz(0.0005mmol)。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H2O中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩尔过量)。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的IFN及过量的试剂，得到0.3mg以上的mPEG(12000)-Hz-IFN结合物。
例6制备mPEG(20000)-Hz-IFN结合物四只试管分别盛有200ugIFN溶液(0.00001mmol)，分别以50mM的MES缓冲溶液(PH3.0)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到2mg/ml。对每只试管，加入4.32mg的mPEG(20000)-Hz(0.0002mmol，ISU Chemical，Korea)。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制1μl(50倍摩尔过量)或4μl EDAC溶液(200倍摩尔过量)。此外，加入50倍摩尔过量得硫代NHS以加速反应并比较结果。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。每组样品的反应条件如下表所示。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的IFN及过量的试剂。每组反应的产量通过SDS-PAGE比较。
作为结果，对于200倍摩尔过量EDAC的反应，有着太多的PEG连接到IFN的羧基上，从而使得1∶1摩尔比例PEG-IFN结合物的分离不成功，而且PEG的连接数量也不好估计。对于50倍摩尔过量EDAC的反应，1∶1摩尔比例PEG-IFN结合物由于其在SDS-PAGE上过于分散而不易区别，造成此现象的原因在于EDAC用量过大。硫代NHS的加入加强了反应效率，但与不加硫代NHS(图4)在反应控制上并无区别。
此外，下表列出了反应效率与EDAC添加次数的关系
作为结果，EDAC逐步加入到反应体系中时，1∶1摩尔比例mPEG-IFN结合物的产量较高(图5)。当EDAC加入量超过50倍摩尔过量时，即使逐步加入EDAC也会有两个或更多的PEG随机连接到IFN上(如图5所示)。
例7制备mPEG(20000)-Hz-IFN结合物1mgIFN溶液(0.00005mmol，)，以50mM的MES缓冲溶液(PH2.5)透析(Centricon-10，Amicon，USA)处理，使得最终浓度达到5mg/ml。对此蛋白质溶液，加入10.8mg的mPEG(20000)-Hz(0.0005mmo，10倍摩尔过量)。接下来将2mgEDAC溶解于20μl的d-H20中配制2μl EDAC溶液(0.001mmol，20倍摩尔过量)。反应在室温(20-25℃)搅拌条件下进行1h。1h后，通过清除柱或离子交换柱除去未反应的IFN及过量的试剂，得到0.3mg以上的mPEG(20000)-Hz-IFN结合物。
例81∶1摩尔比例mPEG(20000)-Hz-IFN结合物的提纯将mPEG(20000)-Hz-IFN结合物(例6)以10mM醋酸钠缓冲溶液(PH4.4)稀释至1mg/ml，然后将mPEG(20000)-Hz-IFN反应混合物置于SP-凝胶快速流动柱(5×50mm，总容积1ml)中，此设备使用前已利用醋酸钠缓冲溶液(PH4.4)平衡处理过。用3倍柱体积的缓冲溶液清洗过后，使用含有500mM NaCl的10mM醋酸钠缓冲溶液(PH4.4)，将1∶1摩尔比例的mPEG(20000)-Hz-IFN从未反应的IFN中分离出来。以上提纯的mPEG(20000)-Hz-IFN经证实为结合物，其中一个PEG连接到了IFN的羧基上(图6)。
例9PEG-G-CSF结合物生物活性的测定，CPE化验按下列步骤进行于60mm的盘(RPMI-1640介质，10％ FBS，37℃，5％ CO2)上培养2.5×106的M-NFS-60细胞(5×105细胞/ml)。每一份天然的G-CSF及mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)均稀释至1mg/ml，然后加入到96个盘中(每个1×104细胞)，并连续稀释。盘子在37℃下培养2天，接着每一个均用50XTT装备(Roche，德国)处理，并于37℃再处理4h；利用ELISA读数器在490nm处读出盘子的O.D.值。
作为结果，本发明的mPEG(20000)-Hz-G-CSF保持了与mPEG(20000)-G-CSF结合物相似的活性，其中连接到G-CSF的氨基上(图7)。
例10PEG-G-CSF结合物半衰期的测定利用克他命/Rumpun将7周大、重220-240克的Sprague-Dawley鼠(每组5只)麻醉，并通过手术将PE管插入每只鼠的腔静脉中。待鼠恢复后，利用静脉注射将100ug/kg的mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)注入。作为对比，PBS和100μg/kg的天然G-CSF用作安慰剂及控制剂。
注射后0、0.5、1、2、4、6、12、24、48h的时间间隔内，利用插管抽取300μl的血液。通过离心过滤(13000rpm，10min，4℃)分离血清并于零下20℃贮存以做进一步的研究。
细胞在G-CSF介质培养24小时后，96盘中的每一个都添加1.5×104细胞。每一个按上述方法贮存的血清样品均稀释100次，并将50μl的稀释样品加入到每一个盘中。将这些盘在CO2气氛下于37℃培养48h，然后每一个均用50XTT装备(Roche，德国)处理，并于37℃再处理4h；利用ELESA读数器在490nm处读出盘子的O.D.值。
图8对(20000)-Hz-G-CSF(例3)与天然G-CSF及NeulastaTM(PEG连接到G-CSF的N端)的半衰期进行了比较。本发明的mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)较之天然G-CSF具有更长的半衰期，与NeulastaTM的半衰期相近。
例11PEG-G-CSF处理小鼠的白细胞(WBC)测定从查尔斯河公司(Atsugi，日本)购买7周大、重220-240克的Sprague-Dawley鼠，并将100ug/kg的mPEG(20000)-Hz-G-CSF(例3)注射到小鼠的尾部静脉中。
将相同数量的天然G-CSF及盐溶液作为控制剂，分别注入。注射后0、6、12、24、48、72、96h的时间间隔内抽取血液样本。WBC数量利用图9所示的自动血液分析仪(Cysmex K-4500)进行测量。结果显示，本发明的mPEG(20000)-Hz-G-CSF较之天然G-CSF及NeulastaTM均具有更高的WBC数量。
例12PEG-IFN结合物生物活性的测定利用血球计将MDBK细胞计算在7.5×105细胞/ml浓度内，并将其置于5％的FBS/MEM介质内。将mPEG(12000)-Hz-IFN(例5)稀释至浓度为100IU(1mg/ml＝2×108IU)。每个盘中加入100μl 5％的FBS/MEM介质以及100μl的稀释样品，并且连续稀释。然后向96个盘的每一个中均加入100μl细胞悬浮液，于37℃培养20h；向每个盘中加入100μl稀释100倍的水泡性口炎病毒(VSV，ATCC VR-158)于37℃培养20h。除去96个盘中含有VSV的培养基溶液，向每个盘中加入50μl 0.05％结晶紫染料溶液，利用ELISA读数器在550nm处读出每个盘子的O.D.值，以此来确定IFN的活性。结果显示，mPEG(12000)-Hz-IFN(例5)保持了天然IFN 40-50％的活性，与PEG-IFN(Schering-Plough，USA，PEG连接到IFN的氨基上，FDA通过)具有相近的活性。(图10)同时，经测定，mPEG(20000)-Hz-IFN(例6)的活性大约为天然IFN的40％(图11)。
此外，利用CPE化验，对Di-mPEG-Hz-IFN(两个PEG连接到一个IFN上)与单向-PEG-IFN(1∶1化合，两个PEG连接到一个IFN上)的活性进行了比较，结果单向-PEG-IFN显示出高生物活性(图12)。
例13PEG-IFN结合物半衰期的测定将MDBK细胞计算在7.5×105细胞/m浓度内，并将其置于5％的FBS/MEM介质内。向96个盘的每一个中均加入100μl细胞悬浮液；通过静脉注射将mPEG(20000)-Hz-IFN(例6)注入小鼠体内，其后得到血清并稀释50倍。向每个盘中加入稀释的血清，在CO2培养器中培养20h。
每个盘中加入稀释100倍的水泡性口炎病毒(VSV，ATCC VR-158)，继续培养20h。除去每个盘中的病毒基溶液，加入50μl 0.05％结晶紫染料溶液，利用微板块读数器读出550nm的吸光率，以此来测量IFN的半衰期。图13显示了通过羧基结合的mPEG(20000)-Hz-IFN(例6)的半衰期，并与天然FIN及PEG-IFN进行了比较。本发明的mPEG(20000)-Hz-IFN较天然FIN及PEG-IFN更长的半衰期。
例14PEG-IFN结合物的稳定性例6中制备并提纯的mPEG(20000)-Hz-IFN以及PEG-IFN的稳定性，其中带支臂的PEG(10K)2-NHS(依据文献中的方法连接在IFN的氨基上，然后利用清除柱分离单向PEG-IFN)通过观察完整IFN在SDS-PAGE上的解离而测定，测定之前将其置于PBS溶液中在4℃条件下培养。每一样品的浓度调整到1mg/ml。结果显示，大约2周以后，约有14％的完整IFN从通过氨基结合的PEG-IFN中解离，然而本发明通过羧基结合的mPEG(20000)-Hz-IFN，即使在6个月后也没有检测到IFN的解离(图14)。
例15mPEG(5000)-Hz-PTH结合物的制备将1mg人体PTH(甲状腺激素，0.00012mmol，1-84aa，Dong-Kook Pharm.，Korea)与3.0mg活化mPEG(5000)-Hz置于0.5ml的50mM缓冲溶液MES(PH4.4)中，在室温搅拌条件下反应10min；将2.5μl浓度为100ug/μl的EDAC(0.00125mmol，10倍摩尔过量)加入，进而在室温搅拌条件下反应1h。未反应的mPEG(5000)-Hz及PTH利用Centricon-10(Amicon，USA)清除，制得0.4mg的mPEG(5000)-Hz-PTH。
例16mPEG(12000)-Hz-PTH结合物的制备将1mg人体PTH(0.00012mmol)与7.14mg活化mPEG(12000)-Hz(0.0006mmol，5倍摩尔过量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM缓冲溶液MES(PH4.4)中，在室温搅拌条件下反应10min；将2.5μl浓度为100ug/μl的EDAC(0.00125mmol，10倍摩尔过量)加入，进而在室温搅拌条件下反应1h。未反应的mPEG(12000)-Hz及PTH利用Centricon-10(Amicon，USA)清除，制得0.3mg的mPEG(12000)-Hz-PTH。
例17mPEG(20000)-Hz-PTH结合物的制备将1mg人体PTH(0.00012mmol)与12mg活化mPEG(20000)-Hz(0.0006mmol，5倍摩尔过量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM缓冲溶液MES(PH4.4)中，在室温搅拌条件下反应10min；将2.5μl浓度为100ug/μl的EDAC(0.00125mmol，10倍摩尔过量)加入，进而在室温搅拌条件下反应1h。未反应的mPEG(20000)-Hz及PTH利用Centricon-30(Amicon，USA)清除，制得0.3mg的mPEG(20000)-Hz-PTH。
例18mPEG(12000)-Hz-PTH结合物的制备将1mg人体PTH(0.00012mmol)与14.4mg活化mPEG(12000)-Hz(0.0012mmol，10倍摩尔过量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM缓冲溶液MES(PH2.5)中，在室温搅拌条件下反应10min；将5μl浓度为100ug/μl的EDAC(0.0025mmol，20倍摩尔过量)加入，进而在室温搅拌条件下反应1h。未反应的mPEG(12000)-Hz及PTH利用Centricon-10(Amicon，USA)清除，制得0.2mg的mPEG(12000)-Hz-PTH。
例19mPEG(20000)-Hz-PTH结合物的制备将1mg人体PTH(0.00012mmol)与24mg活化mPEG(20000)-Hz(0.0012mmol，10倍摩尔过量，ISU Chemical，Korea)置于0.5ml的50mM缓冲溶液MES(PH2.5)中，在室温搅拌条件下反应10min；将5μl浓度为100ug/μl的EDAC(0.0025mmol，20倍摩尔过量)加入，进而在室温搅拌条件下反应1h。未反应的mPEG(20000)-Hz及PTH利用Centricon-30(Amicon，USA)清除，制得0.2mg的mPEG(20000)-Hz-PTH。
例20mPEG-Hz-PTH结合物分析上述例子中得到的PEG-PTH结合物及天然PTH采用以下HPLC条件测定HPLC洗提条件柱LiChroCART 125-4RP-8(5um)(Merck，USA)溶剂A含0.1％TFA的去离子水B含0.1％TFA的乙腈流量0.8ml/min探测器220nmUV探测器注射体积20μl
利用对于HPLC的LiChroCART 125-4RP-8(5um)，在220nm只探测到PTH及其他蛋白质，未探测到PEG。PTH的RT通过HPLC测定。未经聚合物改良的PTH在6.8min处有一个尖锐的峰，逐渐增加至18min又再次降低(图15)。
位于上表1、2之间的洗提条件范围内，按上述方法制备的mPEG-Hz-PTH在6.8min及7.3min处进行洗提处理，以分别除去未反应的PTH及PEG-PTH，位于上表1、2之间的洗提条件范围内。
结合之后，提纯之前共有3种产物(未反应的PTH、mPEG(20000)-Hz-PTH、mPEG(20000)-Hz)，在220nm只探测到未反应的PTH、mPEG(20000)-Hz-PTH，没有探测到未反应的mPEG(20000)-Hz(图16)。
图17为HPLC上最终提纯后的mPEG(20000)-Hz-PTH，图18为mPEG(20000)-Hz-PTH与PTH反应后以库马西蓝染色的SDS-PAGE。
例21mPEG-PTH结合物在生物体外生物活性的测定根据PEG的分子量，使用分子量为5000(5K)、12000(12K)及20000(20K)的活化mPEG-Hz进行生物活性测定。通过测量c-AMP的数量来比较天然PTH、mPEG(5000)-Hz-PTHmPEG、(12000)-Hz-PTH及mPEG(20000)-Hz-PTH的体外生物活性，其中c-AMP通过使用UMR-106细胞系的c-AMP kit(Amersham Pharmacia，RPN225，USA)合成。结果发现随着PEG分子量的增加，mPEG-Hz-PTH的生物活性降低。此外还发现，10-8摩尔浓度的mPEG(5000)-Hz-PTH、mPEG(12000)-Hz-PTH及mPEG(20000)-Hz-PTH分别保持40％、30％、20％的未反应PTH的活性(图19)。
例22mPEG-Hz-PTH的半衰期测定通过静脉注射，将100ug/kg的PTH及mPEG-Hz-IFN(例6)分别注入每一个雄性小鼠(重300-350g)体内。注射后0、5、10、15、30、60及120min的时间间隔内，利用插管抽取血液。通过离心过滤(13000rpm，10min，4℃)分离血清，mPEG-Hz-PTH的半衰期通过计算保留的PTH浓度而直接测量，其中浓度通过通过使用c-AMP kit(Amersham Pharmacia，RPN 225，USA)测量血浆中c-AMP的浓度得到。
结果显示，15min后未探测到未反应的PTH和mPEG(5000)-Hz-PTHmPEG，但1h、2h后分别探测到了mPEG(12000)-Hz-PTH及mPEG(20000)-Hz-PTH(图20)。
已论述了本发明的首选设备，在不违背本发明精神情况下，熟练操作者也可以采用其他设备，还包括在此处声明的真正范围内对本发明的改良及变动。以上例子深入描述、论证了本发明范围内的具体装置。单独给出的例子是为了说明而不是限制本发明，在不违背本发明精神情况下可进行很多变化。
本发明是提供了一种1∶1摩尔比的生物适合聚合物-生物活性材料结合物，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基结合，如蛋白质或多肽；同时还包括制备方法。本结合物增强了生物实用性，延长了半衰期，体内稳定性增强，这使得其作为医用药物时可以降低使用频率。
权利要求
1.一种生物适合聚合物-生物活性材料的结合物，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按1∶1的摩尔比结合。
2.如权利要求1所述结合物，其特征为生物适合聚合物可做如下选择聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚对苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亚胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亚烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺及其他共聚物。
3.如权利要求1所述结合物，其特征为生物活性材料可做如下选择血红蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、细胞活素、α-、(β-γ-干扰素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板来自生长因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲状腺激素(PTH)。其他基因生物或药用蛋白质包括胰岛素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、肿瘤坏死因子(TNF)及相关的等位基因、成长因子(如组织成长因子TGFec、TGFβ和表皮成长因子)、激素类(如滤泡刺激激素、甲状腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黄体激素-释放激素及其衍生物)、降钙素、降钙素基因相关肽、人造脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促性腺激素、纤溶酶原激活物、肽释放生长因子、胸腺体液因子。
4.如权利要求1所述结合物，其特征为生物活性材料可选择干扰素、G-CSF或甲状腺激素。
5.药用合成包括药用可接受数量的结合物(依据声明1)及药用可接受的载体。
6.一种生物适合聚合物与生物活性材料的按1∶1的摩尔比结合的制备方法，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基结合，包括将生物活性材料结合到生物适合聚合物上的步骤，其在反应条件下逐步添加结合剂，生物活性材料与生物适合聚合物的摩尔比为1∶1-1∶20，与结合剂的摩尔比为1∶1-1∶50，PH值2-5。
7.如权利要求6所述的方法，其特征为生物适合聚合物需经可以与羧酸和反应性羰基反应的功能基活化，可以与羧酸和反应性羰基反应。
8.如权利要求6所述的方法，其特征为生物适合聚合物可做如下选择聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚对苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亚胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亚烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺及其他共聚物。
9.如权利要求6所述的方法，其特征为生物活性材料可做如下选择血红蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、细胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干扰素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板来自生长因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲状腺激素(PTH)。其他基因生物或药用蛋白质包括胰岛素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、肿瘤坏死因子(TNF)及相关的等位基因、成长因子(如组织成长因子TGFec、TGFβ和表皮成长因子)、激素类(如滤泡刺激激素、甲状腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黄体激素-释放激素及其衍生物)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、人造脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促性腺激素、纤溶酶原激活物、肽释放生长因子、胸腺体液因子。
10.依据权利要求6制备的生物适合聚合物-生物活性材料结合物，其二者的摩尔比为1∶1。
11.生物适合聚合物-生物活性材料结合物，其中生物适合聚合物按1∶1的比例连接在生物活性材料的C端。
12.如权利要求11所述的结合物，其特征为生物适合聚合物可做如下选择聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚对苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亚胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亚烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺，及其他共聚物。
13.如权利要求11所述的结合物，其特征为生物活性材料可做如下选择血红蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、细胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干扰素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板来自生长因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲状腺激素(PTH)。其他基因生物或药用蛋白质包括胰岛素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、肿瘤坏死因子(TNF)及相关的等位基因、成长因子(如组织成长因子TGFec、TGFβ和表皮成长因子)、激素类(如滤泡刺激激素、甲状腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黄体激素-释放激素及其衍生物)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、人造脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促性腺激素、纤溶酶原激活物、肽释放生长因子、胸腺体液因子。
14.如权利要求13所述的结合物，其特征为生物活性材料可选择干扰素、G-CSF或甲状腺激素。
15.药用合成包括药用可接受数量的结合物(依据11)及药用可接受的载体。
16.一种生物适合聚合物与生物活性材料的按1∶1的摩尔比在生物活性材料的C端结合的制备方法，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基结合，包括将生物活性材料结合到生物适合聚合物上的步骤，其在反应条件下逐步添加结合剂，生物活性材料与生物适合聚合物的摩尔比为1∶1-1∶20，与结合剂的摩尔比为1∶1-1∶50，PH值2-5。
17.如权利要求16所述的方法，生物适合聚合物需经可以与羧酸和反应性羰基反应的功能基活化，可以与羧酸和反应性羰基反应。
18.依据权利要求16的结合物，生物适合聚合物可做如下选择聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚对苯二酚乙二醇、聚交酯酸及其衍生物、聚丙稀酸及其衍生物、聚氨酸、聚乙烯醇、聚亚胺酯、多磷酯、聚乙烯、聚亚烷基氧化物(PAO)、多聚糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯啉、聚丙烯酰胺及其他共聚物。
19.依照权利要求16的结合物，生物活性材料可做如下选择血红蛋白、血清蛋白(如含有因子VII、VIII及IX的血液因子)、免疫球蛋白、细胞活素(如白介素)、α-、(β-γ-干扰素、集落刺激因子包括G-CSF和GM-CSF、血小板来自生长因子、磷脂酶激活蛋白(PLAP)，以及甲状腺激素(PTH)。其他基因生物或药用蛋白质包括胰岛素、植物蛋白(如凝集素及蓖麻毒蛋白)、肿瘤坏死因子(TNF)及相关的等位基因、成长因子(如组织成长因子TGFec、TGFβ和表皮成长因子)、激素类(如滤泡刺激激素、甲状腺刺激激素、抗利尿激素、色素激素、黄体激素-释放激素及其衍生物)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、人造脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促性腺激素、纤溶酶原激活物、肽释放生长因子、胸腺体液因子。
20.依据权利要求16制备的生物适合聚合物-生物活性材料结合物，其中生物适合聚合物连接到生物活性材料C端的摩尔比为1∶1。
全文摘要
本发明是关于生物适合聚合物与生物活性分子的结合，其中活性生物适合聚合物与生物活性材料中的羧基按1∶1的摩尔比结合，包括制备方法及相同的药用成分。
文档编号A61K47/48GK1767858SQ200480008483
公开日2006年5月3日 申请日期2004年3月27日 优先权日2003年3月28日
发明者朴明玉 申请人:百聚生物有限公司