注射用通脉冻干粉针剂及其制备方法

专利名称：：注射用通脉冻干粉针剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于含有原料或其与不明结构之反应产物的医用配制品
技术领域：
，具体涉及到来源于植物的材料。
背景技术：
：目前在临床上用于治疗冠心病心绞痛和脑梗塞的药物有冠脉通片、康尔心胶囊、脑心通胶囊等，这些药品大多服用量大，起效缓慢，疗程长，疗效不够确切，有些药患者要服几个月的药，甚至在服药半年以后才感到起效，给患者造成很大的经济负担，延误了疫病的治疗。注射剂型，药物可直接进入血液循环，相对口服可明显提高其生物利用度，使作用迅速可靠，更有利于对冠心病心绞痛及脑梗塞等急症的治疗。中药注射剂的传统制法是将所用的原料药采用煎煮醇沉的制备方法，许多原料药放在一块煎煮，它们的有效成分之间很容易起反映，影响到注射剂的纯度以及药物的治疗效果。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服上述药物的缺点，提供一种见效快、疗效显著的治疗治疗冠心病心绞的注射剂。本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种注射用通脉冻干粉针剂的制备方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是100支(1.4g/支)冻干粉针剂由以下述重量配比的中药原料和辅料制成丹参333.3g川芎333.3g葛根333.3g甘露90g亚硫酸氢钠2g其制备方法如下1、将丹参药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加10倍量浓度为4.3％的氢氧化钠溶液煎煮三次，每次煮1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶1.5(相对密度1.10～1.15，50～60℃)，调节pH至4.0，加入乙醇使醇浓度达65％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水调整至1∶1；用氢氧化钙溶液调节pH11～12，搅匀，静置30分钟，调节pH6.0～6.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶3(相对密度1.20～1.25，50～60℃)，调节pH至4.0，加乙醇使醇浓度达80％，搅匀，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，调节pH至6.0，加注射用水调整至1∶1，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，测定含量，得丹参提取物。2、将川芎药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加7倍量水煎煮三次，煎煮1.0小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶2(相对密度1.15～1.25，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达70％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水至1∶2；调pH11～12，搅匀，静置30分钟，调pH5.0～5.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶4(相对密度1.20～1.30，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达80％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入约6倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，测定含量，得川芎提取物。3、将葛根药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加8倍量水煎煮三次，煎煮1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶2(相对密度1.10～1.20，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达50％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶4(相对密度1.25～1.30，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达80％，调节pH至8.0～8.2，搅匀，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入5倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液浓缩至1∶2，测定含量，得葛根提取物。4、取丹参提取物、葛根提取物和川芎提取物，混匀，加入浓度为0.4％的亚硫酸氢钠，溶解，混合均匀，调节pH6.8～7.2，加入浓度为18％甘露醇溶解后，按制剂学制备注射剂的常规配比加入浓度为0.4％的活性炭，煮沸20分钟，滤过，滤液加注射用水调整至原体积，微孔滤膜精滤，滤液分装入输液瓶中，115℃、30分钟热压灭菌。无菌条件下微孔滤膜精滤，分装入10ml西林瓶中，每支装5ml，冷冻干燥，扎盖，质检，即得本发明冻干粉针剂。用法用量一日一次，每次1-2支，加入5％葡萄糖注射液250mL或0.9％生理盐水250mL中，静脉滴注。采用本发明制备方法制备的冻干粉针剂经药效试验，证明本发明药物可以明显改善血瘀症大鼠红细胞变形能力及其聚集性，降低红细胞压积及全血与血浆粘度，明显抑制血小板的粘附功能和ADP诱导的血小板聚集功能，减轻大鼠体内静脉血栓与家兔心血体外血栓的干、湿重量及血栓长度，明显延长出血和凝血时间，具有明显的活血化瘀、抗血栓形成及抗血小板聚集的作用；本发明药物可显著拮抗垂体后叶素所致的离体豚鼠心脏冠脉流量的减少，明显缩小犬结扎LAD所致的心肌梗塞范围，缓解心肌缺血所致的ECGST段的抬高，在沙土鼠脑缺血模型上，本发明药物具有抗脑缺血再灌注所致的脑组织中Na+、Ca2+潴留，降低脂质过氧化物代谢物(MDA)含量，抗脑水肿及促进脑电活动恢复的作用，可明显增加麻醉猫的脑血流量，同时降低其脑血流阻力；本发明能显著增强整体动物耐受常压缺氧的能力及延长异丙肾上腺素提高心肌耗氧量后小鼠缺氧的死亡时间，对体外心肌细胞在缺氧缺糖条件下培养所致的损伤有明显的保护作用，还能明显降低毛细血管的通透性；本发明药物能显著延长凝血时间，但对凝血酶原时间无影响，说明其抗凝血作用主要影响内源性的凝血系统；本发明药物分别能显著和明显减少犬大脑中动脉结扎后的脑组织缺血区重量，能显著降低犬大脑中动脉结扎后血清CK升高的作用；本发明药物能明显促进家兔血浆纤维蛋白降解产物(FDP)形成，能显著和明显缩短家兔血浆优球蛋白溶解时间，能明显缩短家兔全血浆凝块的溶解时间；本发明药物能明显延长电刺激所致大鼠颈动脉血栓形成的时间，明显抑制家兔心血体外血栓的形成，明显抑制大鼠体内静脉血栓形成的作(P＜0.001和P＜0.05)；本发明药物能明显促进电刺激形成的大鼠颈动脉血栓的溶解，缩短血流恢复时间，大鼠动静脉血流旁路法血栓形成后，本发明药物能显著和明显减少血栓的湿重(P＜0.01和P＜0.05)，溶栓率分别为17.26％和11.75％，本发明药物对下腔静脉血栓亦有明显溶解作用。具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1以生产本发明药物注射剂100支(1.4g/支)为例所用的原料药和辅料及其重量配比为丹参333.3g川芎333.3g葛根333.3g甘露90g亚硫酸氢钠2g其制备方法如下1、将丹参药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加10倍量浓度为4.3％的氢氧化钠溶液煎煮三次，每次煮1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶1.5(相对密度1.10～1.15，50～60℃)，调节pH至4.0，加入乙醇使醇浓度达65％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水调整至1∶1；用氢氧化钙溶液调节pH11～12，搅匀，静置30分钟，调节pH6.0～6.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶3(相对密度1.20～1.25，50～60℃)，调节pH至4.0，加乙醇使醇浓度达80％，搅匀，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，调节pH至6.0，加注射用水调整至1∶1，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，测定含量，得丹参提取物。2、将川芎药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加7倍量水煎煮三次，煎煮1.0小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶2(相对密度1.15～1.25，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达70％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水至1∶2；调pH11～12，搅匀，静置30分钟，调pH5.0～5.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶4(相对密度1.20～1.30，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达80％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入约6倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，测定含量，得川芎提取物。3、将葛根药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加8倍量水煎煮三次，煎煮1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶2(相对密度1.10～1.20，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达50％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶4(相对密度1.25～1.30，50～60℃)，加乙醇使醇浓度达80％，调节pH至8.0～8.2，搅匀，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入5倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液浓缩至1∶2，测定含量，得葛根提取物。4、取丹参提取物、葛根提取物和川芎提取物，混匀，加入浓度为0.4％的亚硫酸氢钠，溶解，混合均匀，调节pH6.8～7.2，加入浓度为18％甘露醇溶解后，按制剂学制备注射剂的常规配比加入浓度为0.4％的活性炭，煮沸20分钟，滤过，滤液加注射用水调整至原体积，微孔滤膜精滤，滤液分装入输液瓶中，115℃、30分钟热压灭菌。无菌条件下微孔滤膜精滤，分装入10ml西林瓶中，每支装5ml，冷冻干燥，扎盖，质检，即得本发明冻干粉针剂。用法用量一日一次，每次1～2支，加入5％葡萄糖注射液250mL或0.9％生理盐水250mL中，静脉滴注。为了确定本发明的最佳的工艺步骤，发明人进行了大量的研究试验，各种试验情况如下1、提取方式确定实验称取1/50处方量药材，分别按表1～表3进行三味药材的全面配伍提取实验，以提取液中各有效成分的含量和固体物收率为评价指标，考察药材提取方式对提取效果的影响，并以单味药材为100％，计算配伍样品的相对百分误差(括号中值)，结果见表1～表3。表1提取方式对丹参提取效果的影响结果表表2提取方式对葛根提取效果的影响结果表表3提取方式对川芎提取效果的影响结果表由以上实验结果可以看出，固体物收率作指标难以评价提取方式对提取效果的实质性影响。单一成分定量评价指标表明，三药混煎阿魏酸含量降低18.0％；丹参与川芎配伍，丹参素与阿魏酸含量分别降低6.2％和36.77％；葛根与丹参或川芎配伍，葛根素含量分别降低3.3％和4.1％，葛根总黄酮分别降低15.0％和15.2％。可见，本发明中药原料混合提取难以兼顾不同有效成分的提取效率，药材配伍不利于有效成分的提取；为满足注射剂对精制纯化的要求，药材分提有利于精制纯化方法的选择与应用，确定本发明中药原料提取方式为三味药材分别提取。(1)丹参提取工艺针对丹参中水溶性有效成分多元酚类化合物的性质，要达到合理的浸出，溶剂确定后，提取温度B、溶剂用量A、提取次数D以及提取时间C是影响浸出的关键因素。拟用均匀设计优选合理的浸出工艺条件，据均匀设计因素、水平数设计原则，使用U9(98)均匀设计表，设立因素水平表第1、2、3、5列。安排实验如表4。实验方法与结果分别称取丹参50克，按表6安排实验，得提取液后，混合，过滤，量出总体积，取适量测定固体物收率、提取液紫外吸收和丹参素含量。每一实验重复3次，得三次实验均值。试验结果见表5。表4丹参浸出因素实验结果表<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="790">水平溶剂用量A(倍)提取温度B(℃)提取时间C(小时)提取次数D(次)12345678935789101112125060707580859097(煮沸)97(煮沸)0.51.01.52.02.02.52.53.03.0122222334</table></tables>表5丹参浸出实验结果表<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="822">实验号实验条件固体物收率(％)紫外吸收A283.8丹参素含量(％)ABCD12345678935789101112126075859750708090972.03.01.52.51.02.50.52.03.032213222428.92(+2.58)32.90(+0.93)31.53(-2.35)31.19(-2.15)37.87(-1.37)40.11(-1.41)36.33(-0.32)54.23(+4.28)62.69(-0.77)0.380(+3.72)0.443(-1.53)0.418(-1.47)0.463(-0.61)0.465(+0.13)0.556(-2.09)0.451(-3.65)0.687(+5.51)0.990(-0.89)0.352(+33.58)0.298(-35.13)0.473(-6.57)0.644(+3.76)0.160(+10.61)0.364(-15.06)0.325(-40.56)1.060(+23.03)1.290(-4.08)</table></tables>各因素的水平值经规格化处理后，在计算机上用多元线性回归程序处理，其回归方程如下，经F检验，回归方程皆成立。回归方程计算值与实测值及其相对百分误差(见表5括号内值，以固体物收率为指标，回归方程为y1＝10.4230+18.7192A+4.6797B+10.9444C+19.2018DS＝1.2902；R＝0.9962；F＝132.488F＞F0.01，4，4＝16.0，回归方程成立。以提取液紫外吸收值为指标，回归方程为y2＝0.0082+0.3084A+0.1255B+0.2414C+0.3154DS＝0.0235；R＝0.9962；F＝132.1763F＞F0.01，4，4＝16.0；回归方程成立。以丹参素含量为指标，回归方程为y3＝-3.8734+2.3230A+7.3517B+2.1404C+5.0966DS＝1.5640；R＝0.9515；F＝9.5668F＞F0.05，4，4＝6.39，回归方程成立。结果分析与结论由上述回归方程可见，各因素的系数皆为正，表明在因素的水平取值范围内，水平值越大，各指标值也越大；以固体物收率和紫外吸收为指标的两个回归方程中，各因素的系数绝对值大小顺序一致，皆为D＞A＞C＞B，说明提取次数对指标的影响最大，而提取温度的影响最小。以丹参素含量为指标计算回归方程，相对误差较大，回归方程可信度降低，但从实验数据中可看出，丹参素含量高温时明显高于低温。因此，确定出提取温度为97℃，提取次数为3次，溶剂用量为10倍，提取时间为1.5小时。(2)葛根提取工艺葛根为茎类药材，在浸出过程中存在是否浸泡问题。在预试与有关文献资料基础上，设立因素水平表如表9，选用均匀实验设计表U9(98)第1、2、3、5列安排实验如表6。表6葛根提取因素实验结果表实验方法与结果分别称取葛根50克，按表6安排实验，得提取液后，混合，过滤，量出总体积，取适量测定固体物收率、总黄酮含量和葛根素含量。每一实验重复3次，得三次实验均值，试验结果见表7。表7葛根提取实验结果表各因素的水平值经规格化处理后，在计算机上用多元线性回归程序处理，其回归方程如下，经F检验，回归方程皆成立。回归方程计算值与实测值相对百分误差见表7括号内值。以固体物收率为指标，回归方程为y1＝17.2791+1.6669A-1.0686B+7.2704C+6.9382DS＝2.3979；R＝0.9180；F＝5.3952F＞F0.10，4，4＝4.11，回归方程成立。以总黄酮含量为指标，回归方程为y2＝0.3043-0.0562A+0.1108B+0.1169C+0.2960DS＝0.0493；R＝0.9609；F＝13.8984F＞F0.05，4，4＝6.39，回归方程成立。以葛根素含量为指标，回归方程为y3＝2.0424+0.2243A+0.2557B+1.1559C+1.6295DS＝0.3437；R＝0.9550；F＝10.3575F＞F0.05，4，4＝6.39，回归方程成立。结果分析与结论由上述回归方程可见，以总黄酮和葛根素为指标，各因素影响规律一致，皆为D＞C＞B＞A，固体物收率也基本一致，因素D对各指标的影响较显著，皆为正相关，宜选用除水平9以外的最大水平值D8；因素C、B对有效成分的影响成正相关，宜选用较大水平值C7、B5；因素A对有效成分的影响最小，对固体物的影响也为次最小，可选取水平值A1。据此，并根据生产实际耗时耗能情况，拟定葛根浸出优化条件为A1B5C7D8。(3)川芎提取工艺川芎药材中除含有挥发类油类成分外，还含有生物碱类和有机酸类有效成分，各类成分性质各异，宜采用相应的方法和溶剂。设立因素水平表如表13，选用均匀实验设计表U9(98)第1、2、3、5列安排实验，实验结果见表8。表8川芎提取因素实验结果表实验方法与结果分别称取川芎50克，按表9安排实验，得提取液后，混合，过滤，量出总体积，取适量测定固体物收率、提取液紫外吸收和阿魏酸含量。每一实验重复3次，得三次实验均值，结果见表9。表9川芎提取实验结果表各因素的水平值经规格化处理后，在计算机上用多元线性回归程序处理，其回归方程如下，经F检验，回归方程均成立，回归方程计算值与实测值相对百分误差见表9(括号内值)。以固体物收率为指标，回归方程为y1＝18.6614+3.9969A-1.5674B+7.1176C+9.9319DS＝1.2774；R＝0.9875；F＝39.1508F＞F0.01，4，4＝16.0，回归方程成立。以提取液紫外吸收值为指标，回归方程为y2＝0.1702+0.0397A+0.0671B+0.0889C+0.2239DS＝0.0314；R＝0.9764；F＝20.4775F＞F0.01，4，4＝16.0，回归方程成立。以阿魏酸含量为指标，回归方程为y3＝0.0998-0.1750A+0.5987B+0.0466C+0.7045DS＝0.0643；R＝0.9810；F＝25.5509F＞F0.01，4，4＝16.0，回归方程成立。结果分析与结论由上述回归方程可见，各因素对三个指标的影响规律不全一致，但因素D对各指标的影响皆为最大，且都为正相关，应选取最大值“3次”；因素C对固体物收率、紫外吸收指标为次主要因素，且也都为正相关，宜选用较大值“1.0小时”；因素B对有效成分指标为正相关，对固体物收率指标为负相关，但影响程度较小，可选用较大值7倍；因素A影响最小，从生产实际考虑，选取“不浸泡”。经综合考虑，拟定川芎提取优化条件为A1B7C6D7。2、提取物纯化方法(1)丹参提取物纯化方法水醇法丹参提取液浓缩至1∶1，60％醇沉；回收乙醇，浓缩至1∶2，80％醇沉，回收乙醇，调整至1∶2，得水醇法纯化液。石硫醇法丹参提取液浓缩至8∶1，加入氢氧化钙溶液调节pH12，加入硫酸溶液调pH6.0～6.5，静置，过滤，浓缩至1∶1；再如法处理一次，浓缩至1∶2；80％醇沉，回收乙醇，调节至1∶2，得石硫醇法纯化液。澄清剂纯化法丹参提取液中加入15％的101澄清剂溶液，液温80℃，静置，过滤，滤液浓缩至1∶1，再如法处理一次，浓缩至1∶2，得101澄清剂法纯化液；丹参提取液浓缩至1∶10，加入10％的1+1澄清剂溶液，80℃保温20分钟，过滤，滤液浓缩至2∶1，再如法处理一次，浓缩至1∶2，即得1+1澄清剂法纯化液。树脂吸附法取已处理好的大孔吸附树脂，湿法装柱，排除气泡后，丹参提取液上柱，同时收集流出液，到吸附终点时停止上柱，水洗脱，再用50％乙醇洗脱至洗脱液用FeCl3试液检查为阴性，收集50％乙醇洗脱液，浓缩至1∶2，得树脂吸附法纯化液。取上述各纯化液，分别测定其固体物收率和丹参素含量，同时以提取液纯化前各指标为100％计算保留率(括号内值)，并作澄明度、外观性状的对比观察，结果见表10表10丹参不同纯化方法指标成分含量和外观性状比较表结果分析与结论澄清剂法不能显著降低固体物收率，纯化液外观性状差；树脂吸附法对丹参素的损失率太大；石硫醇法与水醇法纯化效果相似，但水醇法纯化液稳定性较差，若样品固体物收率较高，不预先除去部分，则采用石硫醇法操作繁琐。可见，单一纯化方法不能达到注射剂纯化要求。因此，选择水醇法与石硫醇法结合的方法进行纯化，即先醇沉，除去部分杂质后，再用石硫醇法纯化。首次醇沉浓度的筛选取丹参药材适量，按优化条件提取得提取液，浓缩至1∶1.5，然后均分为6份，分别加入95％乙醇使醇浓度为50％、60％、70％、80％、85％，充分搅拌，冰箱静置过夜，过滤，滤液回收乙醇，加水调整至1∶1，取适量分别测定其中丹参素的含量，计算保留率＝醇沉后含量/醇沉前含量×100％，结果见表11。可见，醇沉浓度对丹参有效成分的保留有显著影响，随着醇沉浓度的增加，保留率降低，考虑到实际操作情况及醇沉后固液分离的难易，选择65％的浓度作第一次醇沉处理。首次醇沉中pH值的确定醇沉操作中pH值对有效成分的影响显著。取药材提取浓缩液，测pH值为原液pH，调节pH，加入95％乙醇使醇浓度为65％，静置使沉淀完全，过滤，滤液回收乙醇，加水调整至一定浓度，测定丹参素的含量，并以醇沉前含量为100％计算保留率，结果见表12。表11醇沉浓度对丹参有效成分的影响表表12丹参醇沉中pH值对丹参素的影响表可见，醇沉中调低pH值有利于丹参素的保留，调高pH值则保留率降低，因此确定醇沉前调节pH4.0。石硫醇法工艺筛选丹参水溶性成分中含有有效成分酚酸类化合物和鞣质、树脂等杂质，其中酚酸类化合物与鞣质结构相似，用一般方法难以分离，通过优化石硫醇法工艺条件，能够达到尽可能保留有效成分、去除杂质的目的，其中硫酸回调pH值与二次醇沉浓度是影响石硫醇法纯化效果的主要因素，故予以实验筛选。硫酸回调pH值选择取经第一次醇沉并浓缩至1∶2的丹参提取液适量，加入石灰乳调节pH12，搅匀，静置，续用硫酸溶液调节pH值，离心，取上清液测定紫外吸收，以提取液有效成分为100％计算保留率。结果见表13。表13丹参石硫醇法回调pH值对有效成分的影响表可见，回调pH值为6.0～6.5时，丹参有效成分的保留率较好，因此确定回调pH值为6.0～6.5。二次醇沉浓度的选择药液经石硫法处理后，残留有多糖、淀粉和钙盐，需进一步醇沉以除去。取石硫法处理后药液，浓缩至1∶3，分别加入乙醇使醇浓度达70％、80％、85％，充分搅拌、静置，过滤，回收乙醇，加入水至醇沉前药液浓度，分别测定醇沉前后药液中钙盐残留量。结果见表14。表14醇沉浓度钙盐去除的影响表可见醇沉处理可降低药液中钙盐残留量，随醇沉浓度升高而作用更显著。综合考虑到醇沉浓度对丹参素保留率的影响，确定二次醇沉浓度为80％。结论经过以上工艺条件筛选，丹参纯化方法确定为丹参提取液浓缩至1∶1.5，调节pH至4.0，65％醇沉，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，加注射用水调整至1∶1；用氢氧化钙溶液调节pH11～12，静置30分钟，再用硫酸溶液调节pH6.0～6.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶3(相对密度1.20～1.25，50～60℃)，调节pH至4.0，80％醇沉，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇，调节pH至6.0，加注射用水调整至(1∶1)，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，即得丹参纯化液。按此纯化工艺制备丹参纯化液，其中4批次投料统计，丹参素含量4.54±1.64mg/ml，pH5～6，未检出鞣质，钙离子、硫酸根离子检查合格，溶液棕红色澄明，说明该提取纯化工艺可行。(2)葛根提取物纯化方法水醇法葛根提取液浓缩至1∶1，50％醇沉；回收乙醇，浓缩至1∶2，80％醇沉，用10％氢氧化钠溶液调节pH7.5～8.0；回收乙醇，调整至1∶2，得水醇法纯化液。醋酸铅沉淀法葛根提取液浓缩至1∶1，50％醇沉；回收乙醇，加水稀释至1∶1，加入醋酸铅沉淀，滤液再加入碱式醋酸铅沉淀，沉淀悬浮于70％乙醇中，脱铅，上清液备用；沉淀于70％乙醇中回流2小时，回流液与上清液合并，回收乙醇，调整至1∶2，得醋酸铅沉淀法纯化液。石硫醇法葛根提取液浓缩至1∶1，加入氢氧化钙溶液调节pH12，上清液备用；沉淀悬浮于70％乙醇中，加硫酸溶液调节pH4.0，离心，上清液备用；沉淀于70％乙醇中回流2小时；回流液与前两种上清液合并，调节pH7，回收乙醇，浓缩至1∶2；80％醇沉，回收乙醇，调节至1∶2，得石硫醇法纯化液。澄清剂纯化法葛根提取液中加入20％的101澄清剂溶液，液温80℃，静置，过滤，滤液浓缩至1∶1，再如法处理一次，浓缩至1∶2，得101澄清剂法纯化液；葛根提取液浓缩至12∶1，加入8％的1+1澄清剂溶液，80℃保温20分钟，过滤，滤液浓缩至2∶1，再如法处理一次，浓缩至1∶2，即得1+1澄清剂法纯化液。树脂吸附法取已处理好的大孔吸附树脂，湿法装柱，排除气泡后，葛根提取液上柱，同时收集流出液，到吸附终点时停止上柱，水洗脱，再用50％乙醇洗脱至洗脱液颜色变浅，收集50％乙醇洗脱液，浓缩至1∶2，得树脂吸附法纯化液。取上述各纯化液，分别测定其固体物收率、总黄酮含量和葛根素含量，同时以提取液纯化前各指标为100％计算保留率(括号内值)，并作外观性状的对比观察，结果见表15表15葛根不同纯化方法指标成分含量和外观性状比较表结果分析与结论石硫醇法、醋酸铅沉淀法与澄清剂法均不能显著降低固体物收率；醋酸铅沉淀法还使总黄酮损失率增大；澄清剂法对葛根药液澄清状况的改善作用也不明显；树脂吸附法虽然总黄酮的保留率高，纯度也提高，是值得考虑的方法，但药液外观性状差，且在实际生产中，此法用于注射剂还有一些问题一时难以解决；而水醇法对各方面指标皆较好。因此，经综合考虑选择水醇法纯化葛根药液。醇沉浓度对有效成分的影响取葛根提取液，浓缩至1∶2，加入乙醇分别使醇浓度为50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％，静置过夜，离心，上清液回收乙醇，加水配成1∶2浓度，测定其中葛根总黄酮含量，并作外观观察，结果见表16表16醇沉浓度对葛根有效成分的影响表醇沉浓度在80％以下对葛根总黄酮保留影响不大，首次选择50％醇沉浓度就足以沉淀淀粉等杂质，有效保留有效成分。葛根二次醇沉pH值筛选经50％醇沉后，淀粉等杂质大部分被除去，但不完全，有必要再进行一次高浓度醇沉[21]。取葛根提取液，经50％醇沉后，回收乙醇，浓缩至1∶4，80％醇沉，分别调节pH7.6、8.2、9.0，静置过夜，测定其中葛根素含量、总黄酮含量与固体物含量，并以不调pH醇沉结果为100％计算保留率，结果见表17。表17葛根醇沉(80％)后调pH值对有效成分的影响表葛根二次醇沉中调节pH值对葛根有效成分影响不大，调高pH值，药液颜色加深，但可进一步降低固体物含量，除去杂质。因此，确定二次醇沉中调节pH值8.0～8.2。结论经过以上工艺条件筛选，葛根纯化方法确定为葛根提取液浓缩至1∶2，50％醇沉，静置过夜，滤过，滤液浓缩至1∶4；80％醇沉，用10％氢氧化钠溶液调节pH8.0～8.2，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇，加入约5倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液浓缩至1∶2，得葛根纯化液。按此纯化工艺制备葛根纯化液，其中4批次投料统计，葛根素含量46.6±9.32mg/ml，总黄酮含量117.66±23.54mg/ml，pH7～8，溶液棕红色澄明，说明该提取纯化工艺可行。(3)川芎提取物纯化方法水醇法川芎提取液浓缩至1∶1，60％醇沉；回收乙醇，浓缩至1∶2，80％醇沉；回收乙醇，调整至1∶2，得水醇法纯化液。石硫醇法川芎提取液浓缩至10∶1，加入氢氧化钙溶液调节pH12，再加入硫酸溶液调节pH4.5～5.0，静置，过滤，浓缩至1∶1；再如法处理一次，浓缩至1∶2；70％醇沉，回收乙醇，调节至1∶2，得石硫醇法纯化液。澄清剂纯化法川芎提取液加入10％的101澄清剂溶液，液温80℃，静置，过滤，过滤液浓缩至1∶1，再如法处理一次，浓缩至1∶2，得101澄清剂法纯化液；川芎提取液浓缩至12∶1，加入8％的1+1澄清剂溶液，80℃保温20分钟，过滤，滤液浓缩至1∶2，得1+1澄清剂法纯化液。树脂吸附法取已处理好的大孔吸附树脂，湿法装柱，排除气泡后，川芎提取液上柱，同时收集流出液，到吸附终点时停止上柱，水洗脱，再用50％乙醇洗脱至洗脱液颜色变浅，收集50％乙醇洗脱液，浓缩至1∶2，得树脂吸附法纯化液。取上述各纯化液，分别测定其固体物收率和阿魏酸含量，同时以纯化前含量为100％计算保留率，并作外观性状的对比观察，结果见表18。表18川芎不同纯化方法指标成分含量和外观性状比较表结果分析与结论对降低固体物收率，澄清剂法效果差，而树脂吸附法是一有效方法；对于阿魏酸的保留，澄清剂法与树脂吸附法都较好，但是其纯化液的外观性状太差，不能达到注射剂的要求。水醇法易于操作，但放置后有沉淀产生；石硫醇法处理稳定性较好，放置后虽有沉淀，但不粘壁。故权衡各法利弊，结合生产实际，选择水醇法与石硫醇法结合的方法纯化川芎提取物。醇沉浓度对有效成分的影响取川芎提取液，浓缩至1∶2，加入乙醇分别使醇浓度为50％、60％、70％、80％、85％，静置过夜，离心，上清液回收乙醇，加水配成1∶2药液，测定纯化液紫外吸收，并作外观观察，结果见表19。表19醇沉浓度对川芎有效成分的影响表醇沉浓度对川芎有效成分有不同程度的影响，80％以下的浓度可以保留有效成分80％以上，从实际操作考虑，选择70％醇沉浓度。硫酸回调pH值选择取上述醇沉液回收乙醇，浓缩至1∶2，加入氢氧化钙溶液调节pH12，续用硫酸溶液调节pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.4、pH4.9，分别测定上清液紫外吸收，结果见表20。表20川芎石硫醇法回调pH值对有效成分的影响表选择硫酸回调pH5～5.5。二次醇沉放置时间对有效成分的影响石硫醇法中醇沉的目的是除去残留的钙盐等杂质，如前80％浓度有较好效果，但醇沉放置时间对有效成分阿魏酸含量有无影响，有待考察。取川芎浓缩液，加乙醇使达80％浓度，放置12、24、48小时，分别取样50ml，回收乙醇，加水至1∶1，测定含量，结果见表21。表21川芎醇沉放置时间对有效成分的影响醇溶液放置时间增加，有效成分阿魏酸有降低趋势。结合生产实际，醇沉放置时间以24小时内为宜。结论经过以上工艺条件筛选，川芎纯化方法确定为川芎提取液浓缩至1∶2，70％醇沉，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，注射用水至1∶2；用氢氧化钙溶液调节pH11～12，静置30分钟，续用硫酸溶液调节pH5.0～5.5，静置滤过，滤液浓缩至1∶4；80％醇沉，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，加注射用水至规定浓度，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，即得川芎纯化液。按此纯化工艺制备川芎纯化液，其中4批次投料统计，阿魏酸含量0.494±0.16mg/ml，pH4.5～5.5，钙离子、硫酸根离子检查合格，溶液黄色澄明，说明该提取纯化工艺可行。为了验证本发明的有益效果，采用本发明制备方法制备的本发明注射剂(试验时名称为通脉注射液)经四川大学华西医学基础与法医学院和昆明医学院药学系药理教研室进行了主要药效学试验，各种试验情况如下1、本发明药物抗小动物脑缺血试验实验材料本发明药物，华西医科大学药学院制剂研究室提供，批号971106，规格10ml/支，1g生药/ml；复方丹参注射液，南方制药厂出品，批号970411，规格10ml/支，2g生药/ml；LPO测定试剂盒，南京建成生物工程研究所出品，批号971102。试验动物家猫，体重2.5～3.5kg，雌雄不拘，(雌者无孕)，由昆明医学院动物科提供；沙土鼠，体重60～90g，雌雄兼有，由云南省天然药物药理重点实验室提供，合格证号为云卫动管第A12号。试验仪器RM-6000型多道生理仪，日本光电公司产品；光电VC-II型记忆示波器、RF-5000型荧光分光光度计、光电QC-IIIJ叠加直方分析仪，日本产。(1)本发明药物对沙土鼠脑缺血及其再灌注损伤的保护作用选择健康成年沙土鼠双侧颈动脉夹闭10分钟后再灌注5天，造成脑缺血再灌注损伤模型。再灌期间每天静脉注射一次表22所列药物剂量。然后分别观察测定下列各项指标来综合评价本发明药物对脑缺血及再灌注损伤的影响。①本发明药物对沙土鼠脑缺血再灌注损伤后脑电图(EEG)的影响用针形电极插入沙土鼠前脑皮下，参比电极置于枕部皮下，另一端接日本光电VC-II型记忆示波器，记录缺血前、iv5分钟、缺血10分钟、再灌10分、30分和60分钟的EEG，并将脑电信号输入日本光电QC-IIIJ叠加直方分析仪，记录其直方图，以X轴的uv数作为EEG电位幅度，按缺血前EEG为100％，以下式计算EEG电位幅度％，结果见表22。EEG电位幅度％＝缺血或再灌后幅度÷缺血前幅度×100％由表22可见，在关闭沙土鼠双侧颈总动脉10分钟(即脑缺血10分钟)，EEG幅度立即产生明显的持续低平的改变，本发明药物和复方丹参注射液均不能拮抗上述变化。但再灌期60分钟EEG电位幅度缓慢恢复接近给药后水平，NS组仅达给药后水平的41.3％，说明其对再灌注损伤所致EEG的影响不大，反之本发明药物随剂量增加促进再灌注损伤EEG电位幅度的恢复，本发明药物高剂量组10、30、60分与NS组同时间点比较均有显著差异。说明其不但作用显著，而且促进再灌注损伤EEG改变恢复的速度也明显先于对照组。本发明药物高、低剂量和复方丹参注射液促进大脑细胞缺氧再注损伤EEG电位幅度的恢复率分别为96.4％、47.4％和84.7％。表22本发明药物对沙土鼠脑缺血再灌注损伤后脑电图电位幅度的影响(x±SD)注☆与给药后5分钟自身对照T检验☆P＜0.05*与NS组对照T检验*P＜0.05，**P＜0.01；△高、低剂量本发明药物显著性检验△P＜0.05②本发明药物对脑缺血及再灌注损伤后大脑皮层组织Ca2+、Na+和含水量的影响参照Young法取颞叶皮质，用滤纸吸去血迹，置预先称重的石英烧杯中，精确称取湿重后，置100℃烤箱烘烤4小时，再称取干重，按湿重一干重/湿重×100％计算脑组织的含水量，然后经消化、灰化、稀释处理，用原子吸收分光光度计测定Ca2+、Na+含量，结果见表23。表23本发明药物对沙土鼠缺血在灌注损伤大脑皮层水、Ca2+、Na+含量的影响(x±SD)注①各给药组与NS对照组相比T检验*P＜0.05，**P＜0.01；②各给药组与丹参相比▲P＜0.05，与本发明药物低剂量相比★P＜0.05由表23可见，本发明药物低剂量组能明显降低沙土鼠脑缺血再灌注大脑皮层Na+和水含量(P＜0.05)，高剂量组更显著降低Na+和水含量(P＜0.01)，呈量效关系，并能使Ca2+量明显下降，而复方丹参组仅显示水量下降，不能使Na+和Ca2+量下降，与本发明药物高剂量组比较有统计学差异(P＜0.05)，说明在减轻脑缺血再灌注所致脑水肿，拮抗Na+和Ca2+的升高方面本发明药物优于复方丹参注射液。③本发明药物对沙土鼠脑缺血再灌注损伤后大脑脂质过氧化物(LPO)的影响脂质过氧化物(LPO)测定动物断颈处死，取左侧前脑，采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定脑组织中的LPO。TBA反应产物用RF-5000型荧光分光光度计测定，1，1，3，3，一四甲氧基丙烷用作外标准，LPO水平以其代谢物丙二醛(MDA)湿重表示(见表24)。表24本发明药物对沙土鼠脑缺血再灌注损伤大脑脂质过氧化物的影响表注①各给药组与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；②▲各给药组与丹参相比＜0.05。由表24可见，复方丹参注射液与等剂量的本发明药物均能显著降低缺血再灌注损伤后大脑皮层脂质过氧化物含量，有利于脑细胞功能的恢复。在降低MDA的水平上复方丹参注射液明显优于本发明药物。(2)本发明药物对麻醉猫脑血流量和脑血管阻力(NA所致血管阻力增加)的影响健康家猫，体重2.5～3.5kg，雌雄不拘，3％戊巴比妥钠30mg/kgip.麻醉，仰卧固定于手术台，正中切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉并结扎其颅外分支，套上直径2mm的电磁流量计探头，以此描记脑血流量(CBF)。分离左侧颈总动脉，插入充以肝素(500u/ml)生理盐水的插管，接压力换能器测定动脉血压(Bp)。采用模拟乘除器将Bp除以CBF即得衍生指标脑血管阻力(R)，同时描记双侧大脑体表EEG和ECG，以上各项指标均同步记录于RM-6000型多道生理记录仪。分离一侧股静脉备作给药，等各项指标稳定后，描记一段正常对照曲线，继而随机分4组分别恒速(1ml/min)ivNS2ml/kg(对照组)，本发明药物1.0g/kg，本发明药物2g/kg以及复方丹参注射液2g/kg(丹参组)。5min后描计各项指标，再恒速iv去甲肾上腺素(NA)1.0ug/kg/min，观察各指标改变情况，并于给NA后0，5，10，25，30min各描记一段曲线，各级数据前后自身对照采用配对T检验；各级数据之间比较采用成组T检验(显著性水准a＝0.05)结果见表25、表26。①本发明药物对麻醉猫血压变化的影响(见表25)由表25可见，本发明药物和复方丹参注射液对麻醉猫的收缩压和舒张压读数给药前后均无明显差异，说明其对正常血压无显著影响。在本试验条件下，两药均不能对抗NA所致的血压升高。②本发明药物对麻醉猫脑血流量及脑血流阻力的影响试验结果见表26。由表26可见，从给药前后脑血流量及脑血流阻力自身对照的比较，本发明药物及复方丹参注射液高、低剂量均有显著的增加脑血流量和同步降低脑血流阻力的作用，且三组间作用强度无显著性差异。对NA所致的脑血流阻力的增高，本发明药物低剂量组及复方丹参注射液均未显示拮抗作用，但本发明药物高剂量组脑血流阻力因NA所致的增加幅度较小，与同期NS组比较有显著性意义。2、本发明药物对实验性犬缺血的影响药物本发明药物，华西医科大学药学院制剂研究室提供；批号000501，规格10g生药/10ml/支；用法用量成人每次10ml本发明药物加入生理盐水100ml静脉滴注，每日1次，即成人日用量为10g生药/10ml×10ml/1次/日，试验时用0.9％氯化钠注射液配制成所需浓度药液备用。试剂戊巴比妥钠，由佛山市化工实验厂进口分装，25g装，批号990901；龙胆紫沈阳试剂三厂生产，批号980501；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(酶速率法)北京中生公司产品，批号000315。磷酸肌酸激酶(CK)试剂盒(酶速率法)北京中生公司产品，批号00301。仪器BeckMan700型全自动生化分析仪，美国贝克曼仪器公司制造；JA-5003型电子天平，上海天平仪器厂制造；Model-820型组织切片机，美国AO公司生产；OLYMPUSPM-10AD摄影显微镜，日本生产。试验方法草犬48只，随机分成6组，每组8只，腹腔注射2.5％戊巴比妥钠1.0ml/kg(25mg/kg)麻醉，固定犬于手术台上，分离左侧股静脉供取血用，然后于犬右外眼角与右耳根部1/2处(中点)，用电刀切开皮肤，分离肌肉，用手术专用颅骨钻钻开颅骨，以咬骨钳扩大颅骨孔，切开硬脑膜，找到大脑中动脉后，先由股静脉抽取约3.0ml血液作大脑中动脉结扎前的酶学测定血清ALP和CK。取血后即将大脑中动脉结扎使造成脑缺血，此时立即由前肢静脉推注药物给药1次，给药剂量及分组见表27。表27本发明药物犬局灶性缺血试验给药方案大脑中动脉结扎即给受试物约6小时后，再次由股静脉取血3.0ml作酶学测定，并分离双侧颈总动脉并夹闭之，即刻从右侧颈总动脉夹闭处的离心端灌注20ml龙胆紫饱和溶液对脑组织进行染色，然后处死动物，开颅取出脑组织，称全脑重，遂切下未染色的脑组织(即缺血区脑组织)称重，求出其占全脑重量的百分率，并进行病理组织学检查(按常规取脑组织，10％甲醛固定1周，H.E染色，石腊包埋切片，光学显微镜下观察)，判断其是否属于脑缺血性损伤(见表28)。血清酶学测定在Beckman700型全自动生化分析仪上进行。结果见表28～表30。表28本发明药物对实验性犬脑缺血的影响(x±SD)注①基质液组与0.9％氯化钠注射液组比较P＞0.05②各给药组与基质液组比较*P＜0.05**P＜0.01表28显示，2和1g/kg剂量本发明药物分别能显著和明显减少犬大脑中动脉结扎后的脑组织缺血区重量(P＜0.01和P＜0.05)。表29本发明药物对实验性脑缺血犬血清ALP活性的影响注①基质液组与0.9％氯化钠注射液组比较P＞0.05②各给药组与基质液组比较P＞0.05表8显示，2-0.5g/kg剂量本发明药物有降低犬大脑中动脉结扎后血清ALP升高的趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。表30本发明药物对实验性脑缺血犬血清CK活性的影响注①基质液组与0.9％氯化钠注射液组比较P＞0.05②各给药组与基质液组比较*P＜0.01**P＜0.01表30显示，2g/kg剂量本发明药物能显著降低犬大脑中动脉结扎后血清CK升高的作用(P＜0.01)。3、本发明药物抗心肌缺血试验药物本发明药物，华西医科大学药学院制剂研究室提供。批号971106，规格10ml/支，1g生药/ml；复方丹参注射液，南方制药厂出品，批号970411，规格10ml/支，2g生药/ml；生脉注射液华西医科大学制药厂出品，批号980202、980601，规格10ml/支，0.568g生药/ml；噻吗心安滴眼液天津市中央制药厂生产，批号971108，5ml/支，5mg/ml；造型药物垂体后叶素注射液，上海生物化学制药厂生产，批号971102，1ml/支，10u/ml。试剂LDH和CPK试剂盒北京中生生物工程高技术公司产品，批号980201；小牛血清，成都华西生物研究所出品，批号980606；M199培养基，GIBCO，批号21200-076；DulbeccosPBSGIBCO，批号21600-010；胰蛋白酶(Tripsin1∶250)，GIBCO，批号27250-042；精氮规格99.9％，由华西医大附一院氧气组提供。动物中国草种犬(杂种犬)体重8.5～15kg，雌雄兼有(雌者无孕)由昆明医学院动物科提供；豚鼠体重300～400g，雌雄兼有，由昆明医学院动物科提；昆明种小鼠体重18～20g，一级动物，雌雄各半，由华西医科大学实验动物中心提供，一级实验动物，合格证号川实动管第67号；SD种大鼠雌雄兼有，体重160～200g，由华医科大学实验动物中心提供，一级实验动物，各格证号川实动管字第70号。仪器RM-6000型多道生理仪日本光电公司产品；Gould3400S/DASA4600型多导生理记录仪，美国产；岛津U-135平衡记录仪；BeckmanC×7型全自动生化仪，美国产。(1)本发明药物对麻醉犬心肌缺血试验(结扎冠状动脉前降支法)健康犬28只，雌雄兼用，经用戊巴比妥纳30mg/kg静脉麻醉后气管插管(备作开胸时人工呼吸用)，分离左侧股动脉和颈动脉，分别插入适当口径的聚乙稀管(内充满肝素生理盐水)至股动脉和左心室内，连接压力换能器测定外周股动脉血压(AP)和左室内压(LVP)，左心室舒张未期压(LVEDP)及左心室内压最大上升速率(LVdp/dt)；开胸分离深主动脉根部，套上合适内径探头经MF-27电磁流量计测定血流量作为心输出量(CO)，同时测定心电图&lt;ECG(II)&gt;，心外膜心电图。除直接测取上述参数外，交按文献方法求得分钟张力-时间指数(TTIXHRO以间接测定心肌耗氧指数。以上八项指标均同步记录于RM-6000型多道生理仪上，等各项指标稳定后，经静脉恒速分别给予生理盐水(NS)、复方丹参注射液和本发明药物高、低剂量，注射容量均为2ml/kg，于10分钟注完，注射前、注射完半量和全量3个时间点，均记录上述各项参数一次。然后于左冠状动脉前降支(LAD1/2处，供应心室前壁及心尖部的第一级血管分支起始部)双重结扎，结扎后5、10、15、60和120分钟分别开机记录上述各项参数。并在结扎LAD前和结扎后3小时，取静脉血测定乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)含量；最后迅速放血摘取心脏，NBT染色法称重测定左心室梗塞范围，用T检验对结扎LAD前后及各试验组间差异进行显著性比较，结果见表31。①本发明药物对心肌缺血酶学指标及左室梗塞范围的影响表31本发明药物对麻醉犬结扎LAD心肌缺血酶学指标及左心室梗塞范围的影响(x±SD，N＝7)注※※与NS对照组T显著性检验P＜0.01。由表31可见，本发明药物和等剂量的复方丹参注射液静脉给药后，均可使犬结扎冠状动脉前降支缺血所致的左心室梗塞范围显著缩小，说明其均具有明显的改善心肌缺血作用。但对于心肌细胞由于缺血所引起的LDH和CPK释放量的增加，在本试验条件下，本发明药物和复方丹参注射液均未能显示抑制或改善作用。②本发明药物对离体豚鼠心脏心率、心肌收缩力的影响试验结果见表32。表32本发明药物对离体豚鼠心脏心率、心肌收缩力的影响(x±SD，n＝10)由表32可见，本发明药物和复方丹参注射液对离体豚鼠心脏的心率和心肌收缩力两项指标给药前后自身比较均未见明显差异，说明其对离体正常心脏的基本活动无直接的明显的影响。(2)本发明药物对心肌氧耗量供需平衡的影响①本发明药物对麻醉犬心肌耗氧指数的影响通过麻醉犬心肌缺血试验用RM-6000型多道生理仪直接测得HR、ECG、MAP、CO、LVP、LVdp/dt、LVEDP等参数后，按文献[1]法可求得心肌耗氧指数(TT1×HR)，结果见表33。表33本发明药物对麻醉犬心肌耗氧指数(TT1×HR)的影响注各给药组与生理盐水组比较P＞0.05由表33可见，给药前后各试验组心肌耗氧指数均无显著性差异，从而间接提示本发明药物对麻醉犬心肌的耗氧量无明显影响。②本发明药物对垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血的影响健康SD大鼠，体重200±20g，雌雄各半，按性别均等的原则分为5组，每组12只。按表29所列药物剂量，每日尾静脉注射各组药物一次(注射容积均为0.5ml/100g)，连续6天，末次给药后1小时，用10％乌拉坦0.5g/kgip麻醉，背位固定后用Gould3400s/DASA4600型多导生理记录仪记录一段正常II导联ECG，然后iv垂体后叶素lu/kg，在给药后15s、30s、1min、2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min分别记录II导联ECG，并以其中任何一时间的T波或ST段升高0.1mv或下降0.05mv作为心肌缺血阳性动物数，实验结果用x2检验进行组间显著性差异比较。结果见表34。表34本发明药物对大鼠由垂体后叶素诱发急性心肌缺血的影响注△与低剂量组比较p＜0.05由表34可见，本发明药物各剂量组的阴性动物数均显著高于生理盐水组，说明其对由垂体后叶素所致的冠状动脉痉挛而引起的急性心肌缺血有明显的对抗作用，在本发明药物高、低剂量组存在明显的量效规律性。结果提示本发明药物通过改善缺血心肌血氧的供应而促进心肌细胞对氧需求的平衡。③本发明药物对小鼠缺氧耐受的影响A.本发明药物对小鼠常压缺氧试验的影响体重18-20g的昆明种小鼠80只，按体重均等的原则分为4组后，分别腹腔注射下表列药物及剂量，连续5日，末次注射药物后30分钟，将每一只小鼠置于1个500ml磨口玻瓶内(每瓶底盛有10g钠石灰)密闭，观察其缺氧死亡时间，进行组间的显著性比较，结果见表35。表35本发明药物对小鼠常压缺氧死亡时间的影响注※※※与NS组显著性检验p＜0.001△本发明药物高、低剂量组显著性检验p＜0.05由表35可见，本发明药物及阳性对照药氯丙嗪均能显著延长小鼠耐常压缺氧的死亡时间，提示其有增强机体特别是脑、心器官对缺氧的耐受能力，且其增强作用在高、低剂量组间存在明显的量效规律。B.本发明药物对异丙肾上腺素诱发小鼠耐常压缺氧试验的影响体重18-20g的昆明种小鼠80只，按体重均等的原则分为4组后，分别腹腔注射下表列药物及剂量，连续5日，末次注射药物后30分钟，给每只小鼠皮下注射异丙肾上腺素，20分钟后将小鼠置于500ml磨口玻瓶(瓶底盛有10g钠石灰)内，观察记录其缺氧死亡时间，进行组间差异的T检验比较，结果见表36。由表36可见，β受体阻断剂噻吗心安及本发明药物均能显著延长注射异丙肾上腺素提高心肌耗氧水平后的小鼠常压缺氧死亡时间，提示其似能降低心肌氧耗，对心肌缺氧有一定的保护作用。表36本发明药物对异丙肾上腺素诱发小鼠常压缺氧死亡时间的影响注※※※与NS组显著性检验p＜0.001△△△本发明药物高、低剂量组显著性检验p＜0.001④本发明药物对体外心肌细胞培养缺氧缺糖损伤的保护试验选用Wistar大鼠乳鼠，在无菌操作下取心室肌剪碎至1mm3，Hanks液冲洗后用胰蛋白酶多次消化、离心，沉淀用15％小牛血清悬浮、计数，调整浓度为2×106/培养瓶，37℃5％CO2孵箱培养4-6天，铺满呈单层细胞后备用。试验分为七组①DPBS缓冲液正常对照组；②充氮缺氧缺糖模型对照组；③生脉注射液阳性药对照组；④β一受体阻断剂——噻吗心安对照组；⑤-⑦分别为本发明药物高、中、低三个剂量实验组。除①外，余各组每一个细胞培养瓶内加3ml充氮药液并充氮30秒，旋紧瓶盖，封闭培养6小时，取上清液用BeckmanC×7型全自动生化仪在340nm波长经分光光度法测定其中的乳酸脱氢酶(LDH)含量，并用T检验比较组间差异。结果见表37。表37本发明药物对培养心肌细胞缺氧缺糖损伤的影响注※与缺氧缺糖模型组比较※P＞0.05；※※P＜0.05；※※※P＜0.01△缺氧缺糖模型组与正常对照组比较△△△P＜0.01由表37可见，缺氧缺糖模型心肌细胞培养液中LDH含量非常明显的高于正常心肌细胞培养组，而生脉注射液及噻吗心安及本发明药物高、中剂量组均能明显降低心肌细胞损伤释放至培养液中的LDH含量，表明本发明药物对体外心肌细胞缺氧缺糖损伤有明显的直接保护作用。本发明的功能活血通脉。本发明的主治用于治疗冠心病心绞痛。本发明的规格1.4g/支。本发明的用法用量一日一次，每次1～2支，加入5％葡萄糖注射液250mL或0.9％生理盐水250mL中，静脉滴注。表25本发明药物对麻醉家猫血压(mmHg)变化的影响(x±SD)注*与给药前对照P＜0.05，各组间对照无显著性差异表26本发明药物对麻醉家猫脑血流量(ml/min)及脑血流阻力(ml/min/mmHg)变化的影响(x±SD)注*与给药前对照P＜0.05；#与NS组对照P＜0.0权利要求1.一种注射用通脉冻干粉针剂，其特征在于它是在每支分装1.4g的100支冻干粉针剂由下述重量配比的中药原料和辅料制成丹参333.3g川芎333.3g葛根333.3g甘露90g亚硫酸氢钠2g2.一种注射用通脉冻干粉针剂的制备方法，其特征在于它包括下属步骤(1)将丹参333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加10倍量浓度为4.3％的氢氧化钠溶液煎煮三次，每次煮1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶1.5，相对密度1.10～1.15，50～60℃，调节pH至4.0，加入乙醇使醇浓度达65％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水调整至1∶1；用氢氧化钙溶液调节pH11～12，搅匀，静置30分钟，调节pH6.0～6.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶3，相对密度1.20～1.25，50～60℃，调节pH至4.0，加乙醇使醇浓度达80％，搅匀，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，调节pH至6.0，加注射用水调整至1∶1，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，测定含量，得丹参提取物；(2)将川芎药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加7倍量水煎煮三次，煎煮1.0小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶2，相对密度1.15～1.25，50～60℃，加乙醇使醇浓度达70％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水至1∶2；调pH11～12，搅匀，静置30分钟，调pH5.0～5.5，静置，滤过，滤液浓缩至1∶4，相对密度1.20～1.30，50～60℃，加乙醇使醇浓度达80％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入约6倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液减压浓缩至1∶2，测定含量，得川芎提取物；(3)将葛根药材333.3g净制，粉碎成粗颗粒，每次加8倍量水煎煮三次，煎煮1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至1∶2，相对密度1.10～1.20，50～60℃，加乙醇使醇浓度达50％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶4，相对密度1.25～1.30，50～60℃，加乙醇使醇浓度达80％，调节pH至8.0～8.2，搅匀，静置40小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入5倍量的注射用水，煮沸30分钟，放冷，0～5℃静置40小时，滤过，滤液浓缩至1∶2，测定含量，得葛根提取物；(4)取丹参提取物、葛根提取物和川芎提取物，混匀，加入浓度为0.4％的亚硫酸氢钠，溶解，混合均匀，调节pH6.8～7.2，加入浓度为18％甘露醇溶解后，按制剂学制备注射剂的常规配比加入浓度为0.4％的活性炭，煮沸20分钟，滤过，滤液加注射用水调整至原体积，微孔滤膜精滤，滤液分装入输液瓶中，115℃、30分钟热压灭菌，无菌条件下微孔滤膜精滤，分装入10ml西林瓶中，每支装5ml，冷冻干燥，扎盖，质检，得本发明冻干粉针剂。全文摘要一种注射用通脉冻干粉针剂，在每支分装5mL的100支冻干粉针剂由丹参333.3g、川芎333.3g、葛根333.3g、甘露90g、亚硫酸氢钠2g原料制成。制备方法为将丹参、川芎、葛根分别进行煎煮，减压浓缩、醇沉，得三种药材提取物，将三种药材提取物混合，加入亚硫酸氢钠、甘露，按注射剂的常规制备方法制备成注射剂。该注射剂，经药效试验证明本发明药物改善血瘀症大鼠红细胞变形能力及其聚集性，降低红细胞压积及全血与血浆粘度，抑制血小板的粘附功能和ADP诱导的血小板聚集功能，减轻大鼠体内静脉血栓。可用于治疗冠心病心绞痛及脑梗塞疾病。文档编号A61P9/10GK1726957SQ20051004298公开日2006年2月1日申请日期2005年7月25日优先权日2005年7月25日发明者陈秋林,郑方晔,刘护鱼申请人:西安万隆制药有限责任公司