白细胞介素－1受体拮抗剂的细胞内同种型的制作方法

专利名称：白细胞介素－1受体拮抗剂的细胞内同种型的制作方法
技术领域：
本发明为生物技术领域。它叙述一种对IL-1a和IL-1B两者均有活性的白细胞介素-1(IL-1)新拮抗剂，一种编码IL-1拮抗剂的新的DNA序列和以DNA重组技术获得IL-1拮抗剂的方法。它也叙述这种IL-1新拮抗剂在由于IL-1的产生而导致的病理方面的预防，治疗和诊断的用途。
背景技术：
有两种截然不同的白细胞介素-1编码基因命名为IL-1a和IL-1B，它们分别编码IL-1a蛋白质和IL-1B蛋白质。
白细胞介素IL-1a和IL-1B为多效性的细胞因子，它们虽然在序列上显示很少的相似性，但对不同的组织和对人类的许多病理，特别是在组织的免疫应答和炎症的过程产生种种相似的效用。
两种蛋白质具有的分子量约为17.5KDa，并均曾以具有分子量约为31KDa的较大的前体分子在以前合成过。
IL-1为强的炎症和致热的细胞因子，通常对组织具有有利的作用但也能有极为不良的作用。
例如它们能够参与自体免疫病理症状的发病机制，如红斑狼疮和特别是例如在风湿性关节炎中它们做为介质对组织造成损害。
IL-1的许多生理效应和那些在脓毒症过程中所观察到的相似。近来的研究表明IL-1以1至10ng/kg剂量静脉给药可引起发热、困倦、厌食、周身性肌痛，关节痛和偏头痛。
因为IL-1具有多效性的生理活性，许多生理活性对组织产生负性影响，所以IL-1的强效力必须在严格地生理控制之下。
IL-1的合成被抗炎的细胞介质、前列腺素和糖皮质激素所抑制，同时IL-1多水平抑制作用的存在对严格控制此介质是需要的。
IL-1是到现在为止所叙述过的受体多肽拮抗剂中仅有的一种细胞因子IL-1族至今第三个已知成份是IL-1受体(IL-1ra)的拮抗剂。
所有三种组分(IL-1a，IL-1B，IL-1ra)均能识别并与细胞表面上的同一受体(IL-1R)结合IL-1a和IL-1B结合在IL-1R上可传递信号而IL-1ra则不能。
有两种类型的IL-1受体，称为IL-1R I和IL-1R II。IL-1ra为一种多肽，它结合于IL-1R I而与IL-1R II的亲和力弱，没有激动活性。
IL-1ra在不同的细胞类型中，包括单核吞噬细胞，多形核细胞(PMN)和成纤维细胞，被IgG、细胞因子和细菌产物诱导产生。
至今有两种IL-1ra的分子形式已被鉴定和克隆1)分泌的IL-1ra(sIL-1ra)含有一个25个氨基酸的典型前导序列，给出一种152个氨基酸的成熟蛋白质；2)细胞内IL-1ra(icIL-1ra)缺乏一个前导序列，因此预示此蛋白质存留于细胞内。
sIL-1ra和icIL-1ra由相同的基因产生。icIL-1ra转录物从两者之一的起始点和从剪接到位于sIL-1ra的第一个外显子中的内部剪接接受位点的第一个供选择的外显子产生。因此，预计的蛋白质除它们的NH2末端外是等同的，在该末端sIL-1ra的前21个氨基酸在icIL-1ra中被四个氨基酸所替代。
sIL-1ra和icIL-1ra转录编码的表达受不同的调控。icIL-1ra的生物显著性仍不清楚。
考虑到IL-1涉及到许多疾病的病理，用于限制IL-1不良效应的可购得的药物的需要是明显的。
本发明的概要本发明的一个目的是提供对IL-1a和IL-1B及它们的组合有活性的一种IL-1拮抗剂。
本发明的进一步的目的是提供一种编码IL-1拮抗剂的DNA序列和用DNA重组技术获得这种新拮抗剂的方法。
本发明的另一个目的是提供实质上纯化形式的拮抗剂以适合用于在需要抑制IL-1病理时有活性的药物组合物。
本发明的其余目的和有利之处将在下列的叙述中表明。
附图和序列表的扼要说明

图1叙述icIL-1ra II(SEQ ID NO8和SEQ ID NO9)的DNA序列和蛋白质序列与典型的sIL-1ra(icIL-1ra ISEQ ID NO6)和sIL-1ra(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)相比较非共同的部分，它也叙述IL-1ra共同部分(SEQ ID NO13和SEQ ID NO14)的DNA序列和编码的蛋白质。
图2叙述icIL-1ra II在不同细胞类型中表达的RT-PCR分析。
图3叙述重组的icIL-1ra II Western印迹分析。
图4叙述icIL-1ra II对内皮细胞中IL-1诱导的E-选择蛋白表达的效用。
SEQ ID NO1报道用于RT-PCR中称为IRA5寡核苷酸的序列。
SEQ ID NO2报道相当于用于RT-PCR中的B-肌动蛋白cDNA69-70核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO3报道用于RT-PCR反向互补于430-449核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO4报道编码sIL-1ra非共同部分的DNA序列。
SEQ ID NO5报道sIL-1ra非共同部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO6报道编码icIL-1ra I非共同部分三个氨基酸的DNA序列。
SEQ ID NO7报道icIL-1-ra I非共同部分三个氨基酸。
SEQ ID NO8报道编码icIL-1ra II非共同部分的DNA序列。
SEQ ID NO9报道icIL-1ra II非共同部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO10报道编码IL-1ra共同部分的DNA序列。关于与序列制备的″Patentin EPO″程序有关的问题，为了容许第一个氨基酸编码为Glu并更为了避免在序列里面形成终止密码子，在序列的第一个位置上加上一个G核苷酸。
SEQ ID NO11报道IL-1ra共同部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO12报道代表icIL-1ra II与其它IL-1ra非共同片段的21个氨基酸的序列。
SEQ ID NO13报道编码完整的icIL-1ra II的DNA序列。
SEQ ID NO14报道完整的icIL-1ra II的氨基酸序列。

发明内容
为了完成本发明的目的，本发明涉及对至少一种选自白细胞介素1a和白细胞介素1B具有拮抗活性的纯化蛋白质，所述的蛋白质具有如SEQ ID NO14所述的氨基酸序列。它是经过重组DNA技术得到的。
本发明还涉及一种编码具有SEQ ID NO14所述氨基酸序列的IL-1拮抗剂的分离的DNA序列，以及一种具有SEQ ID NO13所述序列的分离的DNA序列。
另外，本发明还涉及含有编码含有SEQ ID NO14所述的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列的载体。还涉及编码所述的纯化蛋白质的DNA转染的细胞。这种细胞是哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种经过重组DNA技术得到IL-1拮抗剂的方法，包括(1)培养含有能生产所述的编码纯化蛋白质的DNA序列的宿主细胞；(2)收集和分离编码过的蛋白质。
在上述的方法中，所述的DNA序列是SEQ ID NO13。
此新的IL-1拮抗剂是在编码icIL-1ra的DNA框架中将新的63个碱基对(bp)序列嵌入icIL-1ra第一个特定的外显子与sIL-1ra的第一个外显子的内部受点之间产生的。
通过RT-PCR实验，本发明者发现此新的转录物可在活化的单核细胞和成纤维细胞中和在多形核细胞(PMN)中表达。
在COS细胞中的表达揭示此新的拮抗剂通常为细胞内的并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中具有的分子量(MW)大约为25KDa。
此新重组体拮抗剂显示IL-1的抑制活性。
为了明确和容易的原因，在本申请中，现在已知的icIL-1ra以icIL-1ra型I(icIL-1ra I)来表示，而此处叙述的和本发明目的物的新拮抗剂则限定为icIL-1ra型II(icIL-1ra II)。
依据本发明的拮抗剂可有利地用于预防、治疗或诊断用途的病理实例为风湿性关节炎、脓毒性休克、急性脊髓单核细胞白血病、器管移植抗主体的免疫反应，获得性免疫缺损综合症(AIDS)，溃疡性结肠炎和所有通常的自体免疫疾病。
本发明的一个实例为对具有感染需要IL-1抑制作用病理高危险性的人或已经显示如脓毒病理的人以药理活性量icIL-1ra II给药。
上述类型的一个实例为等候外科手术的病人。
可以应用与有效成份不相排斥的任何给药途径，但特别优选的途径是非肠道给药，因为它可在短时间内发生全身的效应。
为此，刚好在外科手术前、外科手术当中或手术后在静脉内大剂量给药是更可取的途径。icIL-1ra II给药的剂量依赖于基于病人的年龄、体重和个体反应的药物处方。
剂量可以在0.05和30mg/kg体重之间，而优选的剂量为0.1和10mg/kg体重之间。
非肠道使用的药物组合物可制备成含有有效成份和适宜载体的可注射剂型。非肠道给药的载体为本领域众所周知的，例如包括水、盐水溶液、林格溶液和葡萄糖。
载体中可含有少量的赋形剂以维持溶液的稳定性和等渗性。
上述溶液的制备可依照通常的形式进行，优选的是icIL-1ra II的含量将在1mg/ml和10mg/ml之间。
进一步的病理实例(其中依据本发明的新拮抗剂可以有利地用于预防、治疗、诊断目的)有风湿性关节炎，脓毒性休克、急性脊髓单核细胞白血病、器官移植对主体的免疫反应，获得性免疫缺损综合症(AIDS)，溃疡性结肠炎和所有通常的自体免疫疾病。
本发明以特定的实例为参考加以叙述，但说明的内容可能被本领域的熟练技术人员所做的修改和替代均不认为是超出权利要求的目的和意义的范围。
在下列的部分中将叙述一些获得本发明的方法，虽然等同的材料和方法也可以应用。因此，下列的实例是纯属于说明而不是局限此发明。
具体实施例方式
实施例1icIL-1ra II的克隆和特性材料和方法试剂下列可购得的商品试剂用于细胞的培养和分离用于临床的无热源盐水和蒸馏水RPMI 1640培养基；DMEM培养基；M199培养基；L-谷氨酰胺；珀可(Percoll)；菲可-海帕克(Ficoll-Hipaque)；无菌收集的胎牛血清；由牛脑制备的内皮细胞生长补料(ECGS)；肝素。
所有试剂含有的内毒素均少于0.125EU/ml，以鲎变形细胞裂解物试验核对。
细胞人循环PMN和单核细胞是由健康供给者的外周血液用等渗(285mOsm)珀克不连续(单核细胞为4 6％PMN为62％)梯度离心分离，如Colotta F.，Peri G.，Villa SA.，Mantovani A.，Rapid killing ofactinomycin D treatedtumour cells by human mononuclear cells.J.Immunol.132936，1984所叙述的方法。细胞在界面回收，在盐水中洗两次并在培养基中再悬浮。
PMN和单核细胞的回收率高于90％且纯度高于98％，用染色的细胞离心细胞的形态检验来评价。常规用于PMN和单核细胞的细胞培养基为含2mM L-谷氨酰胺和10％FCS的RPMI 1640。
人内皮细胞(EC)得自脐静脉并培养，如文献(Allavena P.，Paganin C.，Martin-Padura I.，Peri G.，Gaboli M.，Dejana E.，Marchisio P.C.，Mantovani A.，Molecules and Structures involvedinthe adhesion of natural killer cells to vascular endothelium，J.Exp.Med.，173439，1991)中详细描述的。
第二次至第五次传代的融合细胞常规地使用含有10％FCS并以ECGS(50μ/ml)和肝素(100μ/ml)补料的M199培养基维持。
COS细胞在含有10％FCS的DMEM培养基中培养，同时8387成纤维细胞在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中培养。
在适当的处理以后，以下述方法观察细胞的IL-1ra mRNA或IL-1ra蛋白质。
RT-PCR整体RNA用稍加修改的异硫氰酸胍方法提取。
RT-PCR按Colotta F.，Polentarutti N.，Sironi M.，MantovaniA.，J.Biol.Chem.，26718278，1992所述的方法进行。
简要地，1μ整体RNA以2.5mM随机六聚体，1mM各种三磷酸脱氧核苷酸，1单位/ml RNase抑制剂和2.5单位/ml moloney小鼠白血病病毒转录酶(Perkin ElmerCetus.Norwalk，CT)，逆转录在逆转录酶缓冲剂(5mM MgCl2，50mM KCl，10mM Tris-HCl；pH8.3)中。
样品在25℃培育10分钟随后在42℃培育45分钟。然后，将为了扩增cDNAs编码icIL-1ra I或icIL-1ra II而设计的特异引物对，和作为内控的人B-肌动蛋白加入到cDNA反应中。
扩增是以2mM MgCl2，50mM KCl，0.2M的每种三磷酸脱氧核苷酸，2.5单位/100ml Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)和4mg/ml的每种特异引物(如下)进行。扩增(30循环)是在自动加热循环器(PerkinElmer Cetus)中于95℃，55℃和72℃各进行1.5分钟。
扩增产物与分子量标准(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)一起通过1％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。
寡核苷酸以亚磷酰胺法结合成。用于选择性扩增icIL-1ra的寡核苷酸序列与Haskill S.等，Natl.Acad.，USA，883681，1991中所叙述的一致。
特别是，作者使用寡核苷酸GM397(此处以IRA1表示)和GM368(IRA4)。
对于icIL-1ra II的扩增，作者使用IRA4和IRA5(SEQ IDNO1)，其特异性地识别包括在此处叙述的icIL-1ra II序列中的超外显子。
对于B-肌动蛋白的扩增，正向寡核苷酸在SEQ ID NO2中报道，相当于B-肌动蛋白cDNA的60-79核苷酸。
反向寡核苷酸在SEQ ID NO3中报道，与430-449核苷酸互补。扩增产物用双脱氧键终止法进行亚克隆(TA Cloning System，Invitrogen，SanDiego，CA)和测序。
COS细胞中icIL-1ra产物的表达含有icIL-1ra I和icIL-1ra II的5′-非翻译区的32bp、全部的开放阅读框和3′-非翻译区的6bp(包括终止密码子)的cDNA以寡核苷酸IRA 4和IRA 5用RT-PCR以如上详述的方法得到，然后连回到pSF5表达载体中，逆转录的保真性和扩增通过测序加以证实。
以正确取向含有cDNA的质粒通过CsCl梯度纯化，然后用如Sambrook J.等Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989所叙述的钙沉淀法转染至COS细胞中。
两天后，培养上清液和超声处理的细胞裂解液用如下详述的ELISA或免疫印迹法考察，以空的质粒(未转染的)做为对照。
免疫活性IL-1ra的鉴定使用商品化ELISA测试(Amersham，Buckinamshire，UK)，其用于鉴定sIL-1ra和icIL-1ra。两只兔和一只山羊的多克隆抗血清用于Western印迹分析。
COS细胞裂解液样品和上清液在12.5％SDS-PAGE上进行电泳，然后印迹在硝基纤维素膜上(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。
原抗体和次级抗体的培育是按照标准方案进行的，原抗体为抗-IL-1ra兔多克隆抗体。
次级抗体为山羊抗-兔免疫球蛋白部分，其连接于辣根过氧化物酶(Amersham)上。免疫活性蛋白部分带按照制造者的说明用基于化学发光的操作(ECL Detection，Amersham)显示。
E-选择蛋白在EC上的IL-1-诱导的表达在96孔板(Falcon)中培养的融合的EC用一定量的转染COS细胞裂解液(见上)培育30分钟，该量相当于经特异的ELISA分析(Amersham)评价的25至100ng重组IL-1ra(为icIL-1ra I也可为icIL-1ra II)。
以等量的由模拟转染细胞得到的COS裂解液平行使用做为对照。其次，EC在0.1-1ng/ml人重组IL-1B中暴露6小时。E-选择蛋白的表达以抗-E-选择蛋白单克隆抗体BBIG-E2做为原抗体和以与辣根过氧化物酶共轭的兔抗小鼠Ig抗血清为次抗体用贴壁EC做ELISA分析来测定。样品的O.D.用分光光度计(Flow)在405波长检测孔板来测定。
结果icIL-1ra II的鉴定为了用RT-PCR得到icIL-1ra(图1)全部编码序列，设计了特异的寡核苷酸引物(如图1指明的IRA1和IRA4)。由人PMN扩增的产物被亚克隆和测序。
除以前已知icIL-1ra序列外，本发明者还分离到一些克隆，它们的序列与发表的icIL-1ra编码序列等同，但显著例外的是在icIL-1ra序列的132和133核苷酸之间有63bp的额外序列。给出所叙述的icIL-1ra外显子-内含子界线，额外序列是嵌在icIL-1ra的第一个无前导区外显子和sIL-1ra的第一个外显子的内部接受位点之间(图1)。
预测的氨基酸序列示于图1。此新的蛋白质(此后称之为icIL-1ra型II)在NH2末端的前三个氨基酸与典型的icIL-1ra(icIL-1ra型I)是共同的，跟着是一个21个氨基酸的新序列。这两个蛋白质的其余部分是等同的。
奇怪的是，与sIL-1ra的第一个外显子的内部接受位点的连接处经常产生相同的氨基酸残基，即谷氨酸(图1)，sIL-1ra和icIL-1raI两者和icIL-1ra II都是如此。
嵌入的氨基酸额外序列的最显著的特点为出现七个甘氨酸残基，其中六个是连续的。甘氨酸残基的两侧均与谷氨酸残基相接。icIL-1ra II由180个氨基酸组成。
icIL-1ra II的整体亲水性模式与icIL-1ra I相似，仍旧在NH2末端缺少疏水性前导肽。
icIL-ra II的表达用一对特殊设计的寡核苷酸(IRA 5和IRA 4，图1)，带有期望的33bp扩增产物进行RT-PCR分析来鉴定icIL-1ra II转录物。
如图2所示，编码icIL-1ra II的转录物在PMA-，IL-1-和TNF-活化的成纤维细胞中可以测出。在LPS-处理的单核细胞中明显地有一个弱的但可测出的带。
无论是未处理的还是活化(图2)的PMN也显示一个很弱的期望大小的带。
图2指明的扩增产物的特异性以亚克隆和测序确定。
重组icIL-1ra II的表达COS细胞以编码icIL-1ra II的DNA序列转染，并以编码icIL-1raI的DNA序列转染作为比较。其次，细胞裂解液和上清液用Western印迹来考察。
用于这些试验的多克隆抗血清可很好地等同识别icIL-1ra II和icIL-1ra I(图3)。大多数的(如果不是所有的)icIL-1ra II和icIL-1ra I在细胞裂解液中发现。
重组icIL-1ra I主要以22KDa带移动，而icIL-1ra II显示近似25KDa的质量。
重组icIL-1ra II对IL-1 B的抑制活性考察了重组icIL-1ra II对IL-1的抑制活性。为此目的作者选择了IL-1-诱导的E-选择蛋白在内皮细胞的表达，因为此分析方法是灵敏(可测得的诱导量在100pg/ml IL-1，或少于此数值)和快速(与IL-1培育6小时)的。
模拟转染的COS细胞的裂解液并不显著地减弱IL-1的活性。
icIL-1ra II没有激动活性。
如图4所示，重组icIL-1ra II以依赖于剂量的形式抑制IL-1的活性。
这些数据提供了icIL-1ra II的确是IL-1抑制剂的证据。
讨论本发明叙述了一种icIL-1ra新的分子形式。此新的分子是在icIL-1ra的第一个无前导外显子与sIL-1ra第一个外显子的内部接受位点之间嵌入63bp生成的。
因为形成的蛋白质除了位于NH2末端的额外21个氨基酸外与典型的icIL-1ra是部分等同的，发明人建议把这个新的形式称为IL-1ra型II，参考典型的icIL-1ra序列称为icIL-1ra型I。
RT-PCR试验表明icIL-1ra II转录物在单核细胞和成纤维细胞中是可诱导的。在COS细胞中表达的重组的icIL-1ra II具有表观大约2 5KDa的分子量和与在相同实验条件下表达的icIL-1ra I产生的作用可相比的IL-1抑制剂活性。
icIL-1ra和sIL-1ra编码转录物以相同的基因用特异(differential)剪接方法产生。icIL-1ra的产生是由另外的一个嵌在含有sIL-1ra前导序列的第一个外显子内部接受位点之中的外显子的转录起始的。
本发明者得到的结果建议一个IL-1ra基因的新结构，此结构中有一个额外的外显子位于典型icIL-1ra和sIL-1ra各自的第一个外显子之间。用这个新的外显子产生一个多肽分子，它仍旧缺乏信号肽，在N末端由于嵌入21个氨基酸而不同于icIL-1ra I，仍旧保留对IL-1抑制的能力。
另外的剪接的应用来产生不同的IL-1ra分子好像是可高度调节的。icIL-1ra II转录物在成纤维细胞中是用IL-1，TNF和佛波醇酯诱导的，在单核细胞中是用LPS诱导。在成纤维细胞中发现佛波醇酯选择性地诱导icIL-1ra转录物，而IL-1和TNF可诱导sIL-1ra和icIL-1ra mRNA两者。在单核细胞中，IL-13(其扩大sIL-1ra和icIL-1ra I的转录物)不能诱导icIL-1ra II。
最后，PMN(其中sIL-1ra和icIL-1ra可基本地表达和诱导)如RT-PCR指出的，只表达很少的转录物。总之，这些数据表明产生三种IL-1ra形式的诱导特异剪接的机制是对外部信号应答的特异调控。
此处叙述的额外序列的氨基酸序列意外的是它包含七个甘氨酸残基，其中六个是连续的。
富含甘氨酸的序列存在于不同生物活性的分子中，包括心钠清除受体，HOX11同源框基因，中间纤维角蛋白和涉及着丝粒结合或RNA剪接的核蛋白。
然而除甘氨酸残基外，这些蛋白质与icIL-1ra II在富含甘氨酸区侧旁的氨基酸序列之间没有明显的同源性。
IL-1系统显示非常程度的复杂性，含有两个激动剂，两个受体，其中之一为IL-1的抑制剂，和一个受体拮抗剂，对于拮抗剂，考虑到所得结果，至少可能存在三种不同形式的分子。
虽然IL-1ra细胞内形式的生物显著性尚未明确的确立，但此处报道的数据指出以另外的剪接，对选择的外部刺激的应答可以产生两种带有不同N末端的不同icIL-1ra形式。
IL-1控制的多种且复杂的水平的存在指出绝对需要对此细胞因子对炎症潜能的紧密生理控制。
附图的说明图1icIL-1ra II的DNA序列和预测的蛋白质序列与典型icIL-1ra(icIL-1ra I)和sIL-1ra的对比。
图1的上部显示特定地代表sIL-1ra、icIL-1ra I和icIL-1ra II的DNA和蛋白质序列。图1下部显示IL-1ra三种形式中共同的序列。
每个分子的完整序列是由各自特定部分与共同部分连接产生的。为清楚起见，icIL-1ra的DNA序列从发表的5′未翻译序列的核苷酸91开始，只报道3′未翻译序列的6bp。
共同的IL-1ra序列从位于sIL-1ra第一个外显子中的内部接受位点开始，相当于完整的icIL-1ra I序列的核苷酸133和sIL-1ra完整序列的核苷酸88。
箭头表示用于RT-PCR分析的正向(IRA 1和IRA 5)和反向(IRA4)寡核苷酸，如在内容中所叙述的那样。寡核苷酸IRA5只识别icIL-1ra II DNA。
图2不同细胞类型中icIL-1ra II表达的RT-PCR分析逆转录了从8387成纤维细胞(板A)，单核细胞(B)和PMN(C)开始的RNAs。每种DNA合成反应分成两份样品，一份样品用寡核苷酸IRA 5(正向)和IRA 4(反向)扩增，为了测定icIL-1ra II的转录物；另一份样品用B-肌动蛋白特异的寡核苷酸扩增(见材料与方法部分)。
扩增产物通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶考察。相当于B-肌动蛋白的扩增产物报道于标准的左边，相当于icIL-1ra II(在右边)的扩增产物用箭头指示。这些带的特异性经亚克隆和测序确定。
图3重组icIL-1ra II的Western印迹分析编码icIL-1ra I(2)或icIL-1ra II(3)的DNA或一种不含有DNA(1)的空载体转染的COS细胞的细胞裂解液用抗-IL-1ra兔多克隆抗体经免疫印迹法来考察。分子量的标准已经说明了。
图4icIL-1ra II对内皮细胞上IL-1-诱导的E-选择蛋白表达的影响用如材料和方法部分所详细解释的方法，内皮细胞以0.1或1ng/ml的人IL-1B处理，加入或不加入25-100ng/ml的icIL-1ra II或等量的用空载体模拟转染得到的COS细胞裂解液。
在培育6小时后，用在贴壁细胞上进行的ELISA试验考察E-选择蛋白的表达。
报道的数据为IL-1诱导的E-选择蛋白表达对照的百分数。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称应用研究系统ARS股份公司(B)街道约翰B·高斯拉韦街14号(C)城市库拉索(E)国家荷属安的列斯群岛(F)邮政编码无(G)电话599-9639300(H)传真599-9614129(ii)发明名称白细胞介素-1受体拮抗剂的细胞内同种型(iii)序列数14(iv)计算机可读形式(A)媒介类型光盘(B)计算机IBM PC可兼容的(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件发行专利#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特性(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无
(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..25(C)其他资料/注＝″RT-PCR寡核基酸，命名为IRA5″(xi)序列描述SEQ ID NO1CTGACTTGTA TGAAGAAGGA GGTGG25(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特性(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型DNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..20(D)其他资料/注＝″RT-PCR寡核苷酸相当于B-肌动蛋白的60-79″(xi)序列描述SEQ ID NO2GCGCTCGTCG TCGACAACGG20(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特性(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链单链
(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..21(D)其他资料/注＝″RT-PCR反向寡核苷酸互补于430-449″(xi)序列描述SEQ ID NO3GATAGACAAC GTACATGGCT G21(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特性(A)长度8 碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点CDS(B)位置24..86(ix)特征(A)名称/要求各种的特征(B)位置1..87(D)其他资料/注＝″sIL-1ra非共同序列″(xi)序列描述SEQ ID NO4
GAATTCCGGG CTGCAGTCAC AGA ATG GAA ATC TGC AGA GGC CTC CGC AGT50Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser1 5CAC CTA ATC ACT CTC CTC CTC TTC CTG TTC CAT TCA G87His Leu Ile Thr Leu Leu Leu Phe Leu Phe His Ser10 15 20(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特性(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(D)解剖学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu Ile Thr Leu Leu Leu1 5 10 15Phe Leu Phe His Ser20(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特性(A)长度42碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征
(A)名称/要点CDS(B)位置33..41(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..42(D)其他资料/注＝″细胞内IL-1ra型I的非共同序列″(xi)序列描述SEQ ID NO6CAGAAGACCT CCTGTCCTAT GAGGCCCTCC CC ATG GCT TTA G 42Met Ala Leu1(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特性(A)长度3个氨基酸(B)类型氨基酸(D)解剖学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Ala Leu1(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特性(A)长度105碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无
(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点CDS(B)位置33..104(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..105(C)其他资料/注＝″细胞内IL-1ra型II非共同的序列″(xi)序列描述SEQ ID NO8CAGAAGACCT CCTGTCCTAT GAGGCCCTCC CC ATG GCT TTA GCT GAC TTG TAT 53Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr1 5GAA GAA GGA GGT GGA GGA GGA GGA GAA GGT GAA GAC AAT GCT GAC TCA101Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser10 15 20AAG G 105Lys(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特性(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(D)解剖学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu1 5 10 15Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys20
(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特性(A)长度474碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点CDS(B)位置1..468(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..474(D)其他资料/注＝″IL-1ra共同序列；为了软件的缘故在第一个位置加入G，这样可使第一个密码子编码Glu并因此在序列内部可避免产生终止密码子″(xi)序列描述SEQ ID NO10GAG ACG ATC TGC CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA GCC48Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala1 5 10 15TTC AGA ATC TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC AAC96Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn20 25 30CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA GAA144Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu35 40 45
AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA ATC192Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile50 55 60CAT GGA GGG AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG ACC240His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr65 70 75 80AGA CTC CAG CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC AGA288Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg85 90 95AAG CAG GAC AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC ACC336Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr100 105 110ACC AGT TTT GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA GCG384Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala115 120 125ATG GAA GCT GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA GGC432Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly130 135 140GTC ATG GTC ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAG TAC474Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu145(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特性(A)长度156个氨基酸(B)类型氨基酸(D)解剖学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO11
Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala1 5 10 15Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn20 25 30Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu35 40 45Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile50 55 60His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr65 70 75 80Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg85 90 95Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr100 105 110Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala115 120 125Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly130 135 140Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu145 150 155(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特性(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链(D)解剖学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无
(v)片段类型N-末端(ix)特征(A)名称/要点肽(B)位置1..21(D)其他资料/注＝″细胞内IL-1 ra型II的非共同部分″(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp1 5 10 15Asn Ala Asp Ser Lys20(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特性(A)长度579碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)解剖学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/要点CDS(B)位置34..573(ix)特征(A)名称/要点各种的特征(B)位置1..579(D)其他资料/注＝″细胞内IL-1ra型II″(xi)序列描述SEQ ID NO13CAGAAGGACC TCCTGTCCTA TGAGGCCCTC CCC ATG GCT TTA GCT GAC TTG TAT54Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr1 5
GAA GAA GGA GGT GGA GGA GGA GGA GAA GGT GAA GAC AAT GCT GAC TCA102Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser10 15 20AAG GAG ACG ATC TGC CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA150Lys Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln25 30 35GCC TTC AGA ATC TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC198Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn40 45 50 55AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA246Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu60 65 70GAA AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA294Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly75 80 85ATC CAT GGA GGG AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG342Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu90 95 100ACC AGA CTC CAG CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC390Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn105 110 115AGA AAG CAG GAC AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC438Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro120 125 130 135ACC ACC AGT TTT GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA486Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr140 145 150GCG ATG GAA GCT GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA534Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu155 160 165
GGC GTC ATG GTC ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAG TAC579Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu170 175 180(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特性(A)长度180个氨基酸(B)类型氨基酸(D)解剖学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu1 5 10 15Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly20 25 30Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln35 40 45Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln50 55 60Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu65 70 75 80Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser85 90 95Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn100 105 110Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe115 120 125Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys130 135 140
Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser145 150 155 160Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe165 170 175Gln Glu Asp Glu180
权利要求
1.对至少一种选自白细胞介素1a和白细胞介素1B的物质具有拮抗活性的纯化蛋白质，其含有如SEQ ID NO12所述的氨基酸序列。
2.纯化蛋白质在制备药物组合物中的用途，所述纯化蛋白质对至少一种选自白细胞介素1a和白细胞介素1B的物质具有拮抗活性，其特征在于所述纯化蛋白质具有如SEQ ID NO14所述的氨基酸序列。
3.具有如SEQ ID NO14所述氨基酸序列的纯化蛋白质在制备对需要IL-1抑制作用的病理有活性的药物组合物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述病理选自自体免疫病理。
5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述病理选自风湿性关节炎、脓毒性休克、急性脊髓单核细胞白血病、器官移植对主体的免疫反应、获得性免疫缺损综合症AIDS和溃疡性结肠炎。
全文摘要
本发明叙述一种新的对IL－1a和IL－1B两者均有拮抗活性的白细胞介素－1，一种编码此IL－1拮抗剂的新DNA序列和用重组DNA技术获得IL－1拮抗剂的方法；也叙述了这种新IL－1拮抗剂在由于IL－1的产生而引起的病理的预防，治疗和诊断中的用途。
文档编号A61P35/00GK1679919SQ20051005399
公开日2005年10月12日 申请日期1995年10月12日 优先权日1994年10月13日
发明者弗朗切斯科·科洛塔, 马尔塔·穆齐奥, 阿尔贝托·曼托瓦尼 申请人:应用研究系统Ars股份公司