专利名称：醋酸精氨酸注射液及其制造方法
技术领域：
本发明属於含有机有效成份的医药制剂，具体涉及一种含氨基酸的医药制剂。
二 背景技术目前，在现有技术中有一件王兰周等人的发明名称为“醋酸精氨酸口服制剂及其在临床的应用”的中国发明专利申请，于2004年1月7日公开(CN1465341A)，其药效组分为醋酸精氨酸。它作为一种非特牲免疫增强药物，在临床上主要用于严重创伤、烧伤、大手术及肿瘤病人放、化疗后机体免疫功能抑制的患者，安全、方便、效果好。但它是一种口服制剂，患者必须口服后，经过胃肠道吸收才能达到治疗目的，对于不适宜口服给药的患者，如危重症病人、胃肠术后早期、急性胰腺炎、食管梗阻、短肠综合症等各种原因造成的具有口服用药禁忌的患者，或必须依赖静脉营养支持(Total ParenteralNutrition，TPN)的患者则不适用。因此，醋酸精氨酸口服制剂在临床使用上受到了一定的限制。而具有非特异性免疫增强作用的醋酸精氨酸注射液，在国内外至今还未见有公开的技术文献，也未见有产品上市销售。
三 发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种醋酸精氨酸注射液，不需经过胃肠道吸收就可直接进入人体各组织和脏器，以便满足不能口服给药的患者或需进行静脉营养支持(Total Parenteral Nutrition，TPN)的患者需求。
采用以下技术方案来实现本发明的目的。
一种醋酸精氨酸注射液，包括有药用辅料和注射用水，其特征是还含有醋酸精氨酸，在100ml注射用水中醋酸精氨酸的含量为0.5g～25g。
在上述醋酸精氨酸注射液中，所说的药用辅料包括等渗剂如氯化钠、氯化钾、氯化镁、乳酸钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇或右旋糖酐(包括大、中、小分子量的右旋糖酐)，任选其中一种；缓冲剂如稀盐酸、枸橼酸或氢氧化钠，任选其中一种。注射用水应符合中国药典标准。
上述醋酸精氨酸注射液，可以是选用不同的辅料制备的小容量注射剂和大容量注射剂。小容量注射剂、大容量注射剂按国家药品监督管理局颁布的《药品生产质量管理规范》(1998年)附录中的有关规定系指小容量注射剂单支或单瓶的体积小于50ml的注射剂；大容量注射剂单支或单瓶的体积大于或等于50ml的注射剂。
本发明的醋酸精氨酸注射液制成小容量注射剂时，其组分和配比如下醋酸精氨酸100～300g，注射用水加至1000ml，调节pH值至5.5～7.0。
本发明的醋酸精氨酸注射液制成大容量注射剂时，优选的组分和配比如下方案一醋酸精氨酸5～30g，氯化钠8.5～9.5g，注射用水加至1000ml，调节PH值至5.5～7.0。
方案二醋酸精氨酸5～30g，葡萄糖45～55g，注射用水加至1000ml，调节pH值至5.5～7.0。
本发明的醋酸精氨酸注射液的制备方法包括以下步骤(1)按照醋酸精氨酸注射液配方的配比量称取醋酸精氨酸原料、药用辅料，备用；(2)在配比量的注射用水中，加入药用辅料搅拌，使其溶解；再加入醋酸精氨酸搅拌，使其完全溶解；(3)加入占总体积的0.1％～0.3％重量的针用活性炭，搅拌，保温放置30分钟，过滤；(4)补加注射用水至全量，调pH值至5.5～7.0；(5)将药液经0.45μm微孔滤膜过滤；(6)测定中间体含量、pH值和澄明度，合格后灌封于安瓿或输液瓶(袋)中，经常规灭菌30分钟，即得。
本发明确定了醋酸精氨酸注射液稳定的关键条件即pH值范围及其制剂的制备方法，有利于对醋酸精氨酸注射液生产质量的控制，从而制定合适的生产工序，使醋酸精氨酸注射液大批量工业化生产成为可能。
以下试验例进一步的证明了本发明的醋酸精氨酸注射液的安全性供试品醋酸精氨酸注射液来源重庆北碚现代应用药物研究所制备批号040901含量(标示量)99.1％规格20ml5g
试验一 血管刺激性试验动物日本大耳白兔来源第三军医大学实验动物中心种属及品系家兔(日本大耳白) 普通级许可证号310101015动物只数5只体重2.2kg～2.4kg试验设计醋酸精氨酸注射液拟在临床应用时，一般是将注射液20ml5g加入1000ml的5％葡萄糖注射液稀释后缓慢滴注，每ml含醋酸精氨酸为5mg。按临床使用剂量，将试验设计为高、中、低三个剂量组。
动物分组本试验共用5只动物，分别低剂量组(25mg/10ml)、中剂量组(50mg/10ml)，高剂量组(75mg/10ml)，阴性组(生理盐水10ml)和正常对照组。
实验方法每日给试验家兔耳静脉注射供试品一次，每次5ml，连续3日，第4日处死动物，取耳静脉做病理切片观察。
结果对实验家兔和对照家兔血管做病理切片检查，形态学观察结果如下1、各试验组耳部组织均无严重的病理形态学改变，未发现有耳部组织的坏死、出血及严重的炎症反应等病变。
2、低剂量组、中剂量组和高剂量组动物耳部组织中的小静脉正常或轻度扩张、充血，但均无组织变性或坏死等显著刺激反应。
3、生理盐水组及正常对照组两组动物耳廓组织结构一致，其静脉形态结构正常。
小结对实验家兔和对照家兔血管做病理切片检查，本试验动物的形态学观察验证了高、中、低剂量对试验动物小静脉没有明显影响。
结论本品供试品血管刺激性试验无组织变性或坏死等显著刺激反应，可供静脉注射用。
试验二 溶血试验2％细胞混悬液的制备取兔血5ml，放入盛有玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，除去纤维蛋白素、使成脱纤血液，加约10倍量的生理盐水，摇匀，离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水如法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红血球用生理盐水配成2％的混悬液，供试验用。
试验方法取试管6只，按下表配比量一次加入2％红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，于37℃恒温箱放置半小时，然后分别加入不同量的醋酸精氨酸注射液(第6管为对照管)摇匀后，置37℃恒温箱中。开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次，一般观察4小时，如溶液呈透明红色，即表示溶血，如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，表示有红细胞凝聚作用。
按上述方法，将试管药液配好后，置37℃恒温箱中。每隔15分钟观察一次，结果如下表15分钟观察一次结果表
1小时观察一次结果表
说明-为无溶血现象。+为少许红细胞凝聚，将试管稍微震荡，均能均匀分散。++为中度红细胞凝聚，将试管震荡，均能均匀分散。
判断标准1.一般以0.3ml注射液(第3管)在2小时内不产生溶血作用者，认为可供注射用。
2、若凝聚物不被摇散或在玻璃片上不被冲散者为真凝聚，供试品不宜供临床应用。
结果本品供试品第3管(0.3ml注射剂)，在2小时内有少许红细胞凝聚，将试管稍微震荡，能均匀分散。
结论本品供试品在2小时内有少许红细胞凝聚，但振摇后能均匀分散，为假凝聚现象。因此，本品供试品可供注射用。
试验三 醋酸精氨酸注射液过敏试验试验目的本试验考察醋酸精氨酸注射液对机体免疫系统的反应，注射给药有无致过敏作用。
试验材料受试药物醋酸精氨酸注射液来源重庆北碚现代应用药物研究所制备批号040901规格20ml5g供试品配制以氯化钠注射液(0.9％)配制成每ml含醋酸精氨酸为5mg浓度供试验用(以临床静脉滴注用量配制)。
氯化钠注射液(0.9％)西南医院药剂科提供，批号成联制字(2001)BM100024号卵白蛋白上海伯奥生物科技有限公司提供，Sigma公司进口分装。以生理盐水配制成0.4％浓度供试验用。
动物白色豚鼠，由重庆市中药研究所院提供，合格证号SCXK(渝)20020004，购进后进行两周饲养。饲养条件用金属兔笼饲养，自由饮水，给予颗粒饲料，室温16～20℃，湿度60％左右。用于实验时体重300g左右，雌雄各半。
试验方法取健康豚鼠36只，按体重随机分为三组，每组12只(雌雄各半)。第一组给醋酸精氨酸注射液组，为受试药物组；第二组给氯化钠注射液，为阴性对照组、第三组给0.4％卵白蛋白，为阳性对照组。
受试动物致敏按无菌操作隔日分别腹腔注射氯化钠注射液、0.4％卵白蛋白、醋酸精氨酸注射液，0.5ml/只，共三次致敏。然后将每组动物分为2批，每批各6只。
攻击第一批于首次注射受试药后第14天，经头静脉注射醋酸精氨酸注射液、氯化钠注射液、0.4％卵白蛋白各1ml进行攻击第二批于首次给药后第21天，按以上方法进行第二次攻击。
观察指标于攻击给药后30min内，观察动物有无咳嗽、抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休克及死亡等情况。并按表1所列标准评分。
表1全身过敏性反应评分标准
结果判定评分≥2时，为过敏反应试验阳性。
试验结果试验结果表明，阳性对照组在第一次注射0.4％卵白蛋白的第14天及第21天后均发生不同程度的痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡，反应级数为4级。
醋酸精氨酸注射液组及氯化钠注射液(阴性组)，在第14天及第21天攻击后，2组动物均未见有咳嗽，抓鼻、颤抖或竖毛等现象中的2项或有连续咳嗽，伴有呼吸困难或痉挛、抽搐、大小便失禁、死亡等现象中的1项。试验结果见表2。
表2醋酸精氨酸注射液过敏试验结果
试验结论经过醋酸精氨酸注射液致敏的豚鼠再攻击后未出现全身过敏性反应。以上试验，证明了本发明的醋酸精氨酸注射液的安全性。
本发明的醋酸精氨酸注射液是一种免疫增强剂，在临床上主要用于严重创伤、烧伤、大手术及肿瘤病人放化疗后机体免疫功能受抑制的患者。
为验证本发明的醋酸精氨酸注射液的药效，第三军医大学烧伤研究所的科研人员，采用30％体表面积III度烧伤家兔模型，造成烧伤动物免疫功能大幅下降，在此基础上使用不同剂量的醋酸精氨酸，以验证其增强机体免疫功能的疗效。
材料与方法试验材料受试药物醋酸精氨酸注射液来源重庆北碚现代应用药物研究所制备批号040901规格20ml5g供试品配制以氯化钠注射液(0.9％)配制成每ml含醋酸精氨酸为5mg浓度供试验用(以临床静脉滴注用量配制)。
实验动物 日本大耳白兔来源、种属、品系及合格证普通级日本大耳白兔，由第三军医大学实验动物中心提供。
合格证书医动字第310101015号。
体重2.51±0.24kg性别雌雄不限方法动物致伤伤前禁食12小时，背部脱毛后用3％凝固汽油燃烧18秒，造成大白兔30％III度烧伤。致伤后立即给予40ml/kg林格氏液腹腔注射抗休克。伤后4h开始腹腔注射醋酸精氨酸。
动物分组52只日本大耳白兔，随机分为正常对照组，烧伤对照组，醋酸精氨酸高剂量组、中剂量组、低剂量组。
给药剂量设置高剂量组醋酸精氨酸1.6g/kg.d；中剂量组醋酸精氨0.8g/kg.d；低剂量组醋酸精氨酸0.4g/kg.d。
给药方法腹腔注射，给药次数每天剂量分2次注射，连续5天。
观察时间5天检测指标淋巴细胞转化率检测取肝素抗凝的兔血5ml，分离淋巴细胞，调节细胞浓度为106/ml，取细胞悬液0.1ml，加入96孔板，同时加入10μg/ml植物血凝素(PHA)0.1ml，5％CO237℃孵育72小时，瑞氏染色，镜下观察，计数200个淋巴细胞，淋巴细胞转化率＝淋巴母细胞数/总淋巴细胞数×100％白细胞吞噬功能检测取肝素抗凝血素5ml，用淋巴细胞分离单个核细胞，调整细胞数为106/ml，取一干净玻片，滴两滴细胞悬液，加入等量的酵母菌，混匀，37℃孵育30分钟。取出玻片轻轻冲去多余的酵母菌，自然凉干后，瑞氏染色，镜检计数吞噬酵母菌的单个核细胞。
吞噬率＝吞噬酵母菌的单个核细胞/单个核细胞总数×100％白细胞趋化性检测取淋巴细胞分离液处理后的多形核白细胞层，调节细胞数为2.5×107/ml。在琼脂糖上打三个孔，孔径2.4mm，孔距2.4mm，中间的孔滴加10μl多形核白细胞悬液，两孔分别加入10μl大肠杆菌上清液和10μl1640培养液。37℃孵育2-3小时，趋化指数以多形核白细胞向大肠杆菌培养液一侧扩散的距离与向1640液一侧扩散距离之比表示。
淋巴细胞亚群检测采用免疫组化(SAP)法检测家兔CD4、CD8及CD4/CD8比值。T细胞亚群检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。高倍镜下选取染色好的视野记数100～200个单个核细胞，细胞表面有红色标记物为阳性细胞。算出阳性率。具体方法参见试剂盒说明书。
NK细胞数量检测采用免疫组化(SAP)法检测家兔NK细胞数量，NK细胞检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。高倍镜下选取染色好的视野记数100～200个单个核细胞，细胞表面有红色标记物为阳性细胞，算出阳性率。具体操作参见试剂盒说明书。
统计学分析 实验数据以x±s表示，组间差异比较采用双侧t检验(a＝0.05)，以P＜0.05表示有显著差异，P＜0.01表示有非常显著差异。
实验结果醋酸精氨酸注射液对烧伤家兔伤后5天病死率的影响实验结果表明，30％III度烧伤大白兔病死率较高，达33.33％。醋酸精氨酸3个剂量组分别为10～20％，明显低于烧伤对照组(P＜0.01)，其中醋酸精氨酸中剂量组(0.6g/kg)的病死率最低，仅为10％，说明使用中剂量的醋酸精氨酸注射液能显著降低烧伤家兔病死率(见表1)。
表1不同剂量醋酸精氨酸注射液对烧伤家兔伤后5天病死率的影响
注**与正常组比较P＜0.01；△△与烧伤对照组比较P＜0.01醋酸精氨酸对烧伤家兔细胞功能的影响伤后后家兔细胞免疫功能明显下降，伤后5天后，淋巴细胞转化率、白细胞吞噬率及趋化指数均低正常组。在醋酸精氨酸的3个剂量组中，中高剂量组的淋转率、吞噬率和趋化指数均明显高于烧伤对照组，而低剂量组与烧伤对照组比较无显著差异(P＞0.05)。结果表明烧伤后细胞免疫功能下降，醋酸精氨酸能促进机体细胞免疫功能的恢复(见表2)。
表2醋酸精氨酸对烧伤家兔淋巴细胞转化率、白细胞吞噬率及趋化指数的影响
注**与正常组比较P＜0.01；△△与烧伤对照组比较P＜0.01醋酸精氨酸对烧伤家兔淋巴细胞亚群和NK细胞数量的影响烧伤5天后，淋巴细胞亚型数量和NK细胞数量发生明显变化，其中CD4、CD4/CD8比值及NK细胞数量均显著下降，CD8含量变化不明显。在醋酸精氨酸治疗的3个组中，中高剂量组的CD4、CD4/CD8比值及NK细胞数量明显高于烧伤对照组(P＜0.01)，而低剂量组的疗效较差，仅CD4、CD4/CD8比值高于烧伤对照组(P＜0.05)，NK细胞数量与烧伤对照组比较相差不显著(P＞0.05)。结果表明中高剂量的醋酸精氨酸能有效维护淋巴细胞亚型的稳定，增加NK细胞数量，有利于伤后免疫功能的恢复(见表3)。
表3醋酸精氨酸对烧伤家兔淋巴细胞亚型和NK细胞数量的影响
注**与正常组比较P＜0.01；△与烧伤对照组比较P＜0.05；△△与烧伤对照组比较P＜0.01醋酸精氨酸对烧伤家兔体液免疫功能的影响伤后5天，各组动物血浆免疫球蛋白IgA、IgM、IgG均有不同程度下降。使用不同剂量的醋酸精氨酸对家兔体液免疫功能的影响不尽相同，其中中高剂量组家兔的IgG和IgM水平明显高于烧伤对照组(P＜0.01)。而低剂量组与烧伤对照组相比变化不明显(P＞0.05)。结果表明每天提供0.8～1.6g/kg醋酸精氨酸能提高伤后免疫球蛋白水平，维护正常的机体免疫功能(见表4)。
表4醋酸精氨酸对烧伤家兔血浆免疫球蛋白含量的影响
注**与正常组比较P＜0.01；△△与烧伤对照组比较P＜0.01以上动物药效学试验表明，醋酸精氨酸注射液能促进免疫细胞增值和分化，提高淋巴细胞转化率，增强免疫细胞吞噬、趋化功能；提高NK细胞活性，促进抗肿瘤免疫增强体液免疫，促进免疫球蛋白合成。烧伤家免每天经腹腔注射醋酸精氨酸的最佳有效剂量为0.8g/kg，5天后其免疫功能明显增强，动物死亡率降低。
具体实施例方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1 醋酸精氨酸 250gpH调节剂 适量注射用水 加至1000ml[制法] 取醋酸精氨酸，加800ml注射用水使溶解，加0.1％的针用活性炭，搅拌15分钟，保温放置30分钟，先用布氏漏斗滤去活性炭，调pH值至6.0～7.0，再用0.45μm微孔滤膜过滤；检测含量、pH值和澄明度，合格后灌封于20ml安瓿中，在115℃下热压灭菌30分钟，得醋酸精氨酸小容量注射剂。
实施例2[原料与用量]醋酸精氨酸 10g氯化钠 9.0gpH调节剂 适量注射用水 加至1000ml[制法]取醋酸精氨酸和氯化钠，加800ml注射用水使溶解，加0.1％的针用活性炭，搅拌15分钟，保温放置30分钟，先用布氏漏斗滤去活性炭，调pH值至6.0～7.0，再用0.45μm微孔滤膜过滤；检测含量、pH值和澄明度合格后，装瓶加塞扎盖，115℃热压灭菌30分钟，得醋酸精氨酸大容量注射剂。
实施例3[原料与用量]醋酸精氨酸10g葡萄糖5gpH调节剂 适量注射用水 加至1000ml[制法]取醋酸精氨酸和葡萄糖，加800ml注射用水使溶解，加0.1％的针用活性炭，搅拌15分钟，保温放置30分钟，先用布氏漏斗滤去活性炭，调pH值至6.0～7.0，再用0.45μm微孔滤膜过滤；检测含量、pH值和澄明度合格后，装瓶加塞扎盖，115℃热压灭菌30分钟，得醋酸精氨酸大容量注射剂。
权利要求
1.一种醋酸精氨酸注射液，包括有药用辅料和注射用水，其特征是含有醋酸精氨酸，在100ml注射用水中醋酸精氨酸的含量为0.5g～25g。
2.按照权利要求1所述的醋酸精氨酸注射液，其特征是所说的醋酸精氨酸的含量制成小容量注射剂时，其组分和配比如下醋酸精氨酸100～300g，注射用水加至1000ml，pH值调节至5.5～7.0。
3.按照权利要求1所述的醋酸精氨酸注射液，其特征是所说的醋酸精氨酸的含量制成大容量注射剂时，其组分和配比如下醋酸精氨酸5～30g，氯化钠8.5～9.5g或葡萄糖45g～55g，注射用水加至1000ml，pH值调节至5.5～7.0。
4.按照权利要求1所述的醋酸精氨酸注射液，其特征在于它的医学用途是作为一种免疫增强剂，在临床上主要用于严重创伤、烧术及肿瘤病人放、化疗后机体免疫功能受抑制的患者。
5.一种醋酸精氨酸注射液的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)按照醋酸精氨酸注射液配方的配比量称取醋酸精氨酸原料、药用辅料，备用；(2)在配比量的注射用水中，加入药用辅料搅拌，使其溶解；再加入醋酸精氨酸搅拌，使其完全溶解；(3)加入占总体积的0.1％～0.3％的针用活性炭，搅拌，保温放置30分钟，过滤；(4)补加注射用水至全量，调pH值至5.5～7.0；(5)将药液经0.45μm微孔滤膜过滤；(6)测定中间体含量、pH值和澄明度，合格后灌封于安瓿或输液瓶(袋)中，经常规灭菌30分钟，即得。
全文摘要
本发明涉及含氨基酸有机有效成分的医药制剂，是一种醋酸精氨酸注射液，它含有醋酸精氨酸、药用辅料和注射用水，可制成不同规格的小容量注射剂和大容量注射剂。本发明醋酸精氨酸注射液作为一种免疫增强药物，在临床上主要用于严重创伤、烧伤、大手术及肿瘤病人放、化疗后机体免疫功能抑制的患者，特别适用于危重病人、胃肠术后早期、急性胰腺炎、食道梗阻、短肠综合症等各种原因造成的具有口服用药禁忌的患者，或必须依赖静脉营养支持的患者，使用方便，安全、有效。
文档编号A61K31/198GK1709235SQ200510057098
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者王兰周, 尤忠义, 彭曦, 江朝容 申请人:王兰周