专利名称：蛋白质TolC在制备免疫制剂及疫苗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质TolC的医疗用途，具体地说涉及该蛋白质在制备免疫制剂及疫苗中的用途。
背景技术：
痢疾是全世界范围内流行的肠道传染病，在发达国家偶有爆发，而在发展中国家却是造成腹泻的主要原因。全世界每年痢疾的病例数约1.647亿，年死亡人数超过110万(Kotloff KL，Winickoff JP，Ivanoff B，et al.Global burden ofshigella infextionsimplications for vaccine development and implementation of controlstrategies.Bull World Health Organ 1999；77651)。我国流行的主要是福氏痢疾，所以对其进行深入研究意义十分重大。考虑到细菌感染与免疫的机制，寻找好的抗原以疫苗的形式进行预防性免疫是公认的一种理想的途径。以前对于痢疾杆菌抗原的寻找主要集中在多糖方面，对蛋白质则由于研究手段的局限而报道很少。
近些年来由于固相pH梯度双向电泳以及生物质谱的飞速发展，使得对于某一物种的蛋白质进行全面的研究成为可能，并由此带动了蛋白质组学的全面发展。本发明申请人在对福氏志贺氏杆菌2457T(志贺氏杆菌俗称痢疾杆菌)建立了双向电泳图谱的基础上(Liao X，Ying TY，Wang HL，et al.Atwo-dimensional proteome map of Shigella flexneri.Electrophoresis 2003；242864-2882)，建立免疫蛋白质组学研究方法，从而对其抗原进行较为全面的分析，为痢疾疫苗的研究工作打下基础。
TolC是革兰氏阴性菌中普遍存在一个的外膜蛋白。作为外膜蛋白，其分子量并不大。TolC在外膜上形成一孔道，由于其在物质运输和药物抗性方面重要作用，对其研究已经比较广泛。在大肠杆菌中，TolC突变体对去污剂、染料、疏水性抗菌素等疏水性物质具有极强的敏感性，同时表现为大肠菌素E1的输入以及大肠菌素V和溶血素的外排的缺陷。另外TolC的突变将导致大肠杆菌染色体分离的缺陷以及对某些噬菌体的抗性。因此，TolC的功能极其强大，但是其上述作用机制尚不十分明了。近几年，在大肠杆菌和沙门氏菌中，TolC还被用作疫苗载体进行研究一方面，利用TolC能与其他蛋白相互作用，能将溶血素分泌至胞外的特点，将外源抗原与溶血素相融合，然后利用TolC系统进行分泌表达；另一方面，由于TolC是外膜蛋白，所以其部分结构域暴露于胞外，所以将外源抗原表位插入至该结构域，进行抗原表面呈现。但对于该蛋白质的血清学研究，以及该蛋白质可能作为一种中和抗原，用于制备免疫制剂或疫苗研制尚未见相关报道。
发明内容
本发明公开了TolC蛋白质的医疗用途，具体地说为蛋白质TolC或其功能片段在制备用于诊断或预防由肠道菌感染引起的疾病的药物中的用途。
其中蛋白质TolC的氨基酸序列如序列表中序列2所示，编码该蛋白质的核苷酸序列如序列表中序列1所示。蛋白质TolC的功能片段为具有该蛋白质部分氨基酸序列，并与该蛋白质具有相同或相似功能的蛋白质。
本发明中所述的肠道菌为痢疾杆菌。
本发明中所述的药物可以为疫苗，或诊断试剂，或免疫治疗制剂。
本发明还公开了含有蛋白质TolC或其功能片段的一种疫苗制剂，其中的蛋白质TolC的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
本发明还公开了含有蛋白质TolC或其相应的抗体的一种诊断试剂，其中的蛋白质TolC的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
本发明通过实验，用免疫蛋白质组学技术发现TolC具有极强的血清学反应，因其位于胞外，很有可能是中和性抗原，可用作制备免疫制剂或疫苗研制的保护性抗原。其中所述的免疫制剂为预防制剂或免疫检测诊断制剂。上述制剂可以用于肠道菌感染，其中包括痢疾杆菌感染的检测诊断或治疗。蛋白质TolC也可用于疫苗的研制，作为保护性抗原，用于痢疾感染的预防。
本发明是通过如下试验进行的。
1.制备肠道菌的免疫血清将肠道菌例如志贺氏杆菌在LB培养基中培养后，转接至新鲜培养基中继续培养至稳定期早期。将培养的活菌作免疫原免疫实验动物，免疫数次后采血测定凝集效价收集血清。不同肠道菌的培养可以依不同方式进行。
2.肠道菌外膜蛋白的样品制备及双向电泳将肠道菌，例如志贺氏杆菌培养过夜，离心收集菌体，洗涤后菌体重悬，进行超声破碎，离心去除沉淀，上清用预冷Na2CO3溶解，冰浴后超离，洗涤沉淀离心，沉淀溶解于双向电泳的上样缓冲液中。使用2-D Quant Kit(Amersham Biosciences，USA)测定蛋白质浓度。取蛋白样品上样至固相pH梯度干胶条。进行第一向等电聚焦电泳，在完成等电聚焦电泳后进行第二向SDS-PAGE电泳。
3.Western Blotting将凝胶通过半干转印至硝酸纤维素膜，经过丽春红染色，水洗脱色并迅速用针头在膜上刺孔来定位蛋白点，扫描后进行Western Blotting。将考马斯亮蓝染色胶、丽春红染色以及Western Blotting显色的膜图形进行比对以确定免疫反应蛋白点。
4.胶内酶切及MALDI-TOF质谱检测从考马斯亮蓝染色胶上切取相应蛋白点，胶内酶切进行质谱检测。
5.数据库查询使用Mascot在相应数据库中进行肽质量指纹图谱检索，使用2457T株基因组本地运行Mascot检索。
6.结果显示从相应的考马斯亮蓝染色胶上取点经胶内酶切后使用MALDI-TOF质谱鉴定了多个免疫反应蛋白点，对应于不同的蛋白质。其中有3个免疫反应蛋白点对应于TolC蛋白质。
通过本发明的方法，OmpA和DnaK等高丰度且免疫原性强的蛋白都被鉴定出来，这与一些实验室对其它病原微生物的免疫蛋白质组学研究结果吻合(Haas G，Karaali G，Ebermayer K，et al.Immunoproteomics of Helicobacter pylori infectionand relation to gastric disease.Proteomics 2002；2313-324；Nilsson I，Utt M，Nilsson HO，et al.Two-dimensional electrophoretic and immunoblot analysis of cell surface proteins ofspiral-shaped and coccoid forms of Helicobacter pylori.Electrophoresis 2000；212670-2677)。上述结果也从另一方面验证了所鉴定出的TolC蛋白质具有较强免疫原性的结果。TolC属于定位在外膜上的蛋白，它是革兰氏阴性菌外膜上普遍存在的一种孔道蛋白，而孔道家族的蛋白由于在药物抗性以及致病因子分泌方面中的重要地位而日益受到关注。最典型的模型就是大肠杆菌的溶血素分泌系统以及AcrAB/TolC药物排泄泵(Andersen C.Channel-tunnelsouter membranecomponents of type I secretion systems and multidrug efflux pumps of Gram-negative bacteria.Rev Physiol Biochem Pharmacol 2003；147122-65)。其氨基酸序列以及编码氨基酸的核苷酸序列见序列表中序列2和l。
本发明首次通过实验发现了TolC蛋白质具有较强的免疫原性，可以根据该性质制备免疫制剂，用于痢疾杆菌感染的检测诊断或进行免疫治疗，或用于预防痢疾杆菌感染的疫苗的研制，具有良好的应用前景。
具体实施例方式
通过下面的实施例对本发明的技术方案进行具体描述，但并不对本发明有任何限制。
实施例一 免疫血清的制备1材料与方法福氏志贺氏杆菌2a 2457T，为国际标准菌株，市购；LB培养基按照《分子克隆实验指南》配制；大耳白兔购自军事医学科学院动物中心，动物等级为1级。
1.1菌株与培养条件在LB培养基中37℃培养过夜，按1∶100转接至新鲜培养基中，37℃250rpm培养至稳定期早期，OD600为3.3时中止培养。
1.2血清的制备细菌培养条件同上。实验用大耳白兔，耳缘静脉注射活菌免疫原，间隔5天，免疫6次，第1次5亿，第2次7.5亿，第3次10亿，第4次15亿，第5次20亿，第6次20亿。末次免疫后8天开始采血测定凝集效价，至l∶5120时收集血清。
2.结果获得目的免疫血清，血清效价达到1∶5120。
实施例二 福氏志贺氏杆菌的外膜蛋白的双向电泳及Western Blotting1材料与方法1.1所用试剂为Amrsco公司产品，分析纯。电泳仪为安马西亚公司产品，其余同实施例1。
1.2制备福氏志贺氏杆菌的外膜蛋白将福氏志贺氏杆菌2a 2457T 37℃震荡培养过夜，2000g离心15min收集菌体，用PBS洗涤三次，菌体重悬于50mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)溶液中，超声破碎，6000g离心10min去除沉淀，上清用10倍体积的预冷O.1mmol/LNa2CO3(pH11)溶解，冰浴1h，100000g超离1h，沉淀用50mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)洗涤一次，100000g离心lh，沉淀即为福氏志贺氏杆菌的外膜蛋白。
1.3福氏志贺氏杆菌的外膜蛋白的双向电泳将上面获得沉淀溶解于双向电泳的上样缓冲液(5mol/L尿素，2mol/L硫脲，2％SB 3-10，2％CHAPS，50mmol/L DTT)中。使用2-D Quant Kit(AmershamBiosciences，USA)测定蛋白质浓度。取1mg总蛋白样品上样至18cm固相pH梯度干胶条。等电聚焦条件为重泡胀6h，30V 6h，500V 1h，1000V 1h，8000V至50000伏小时，第二向SDS-PAGE胶浓度为12.5％。
1.3Western Blotting将凝胶通过半干转印至硝酸纤维素膜，丽春红染色10分钟[Ausubel FM，Brent R，Kingston RE等.精编分子生物学实验指南，北京科学出版社，1998369]，水洗脱色并迅速用针头在膜上刺孔来定位蛋白点，扫描后进行Western Blotting，实验方法参照文献(Wu M，Stockley PG，Martin II WJ.An improved Western blottingtechnique effectively reduces background.Electrophoresis 2002；232373-2376)。将考马斯亮蓝染色胶、丽春红染色以及Western Blotting显色的膜图形进行比对以确定免疫反应蛋白点。
2.结果如附
图1，附图2所示。
实施例三 胶内酶切及MALDI-TOF质谱检测1材料方法1.1质谱仪为德国Bruker的Reflex.III MALDI-TOF-MS，其余材料同上。
1.2从考马斯亮蓝染色胶上切取相应蛋白点，胶内酶切的方法参见文献[廖翔，应天翼，王恒樑等.考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶内酶切方法的改进.生物技术通讯2003；14509-511]。质谱检测在国家生物医学分析中心完成，使用Reflex.IIIMALDI-TOF-MS(Bruker，German)质谱仪。
1.3数据库查询使用Mascot(http://www.matrixscience.com)在相应数据库中进行肽质量指纹图谱检索。同时在国家生物医学分析中心使用2457T株基因组本地运行Mascot检索。
2结果如附图1，附图2所示。
图1为pH4-pH7的外膜蛋白在进行双向电泳后进行Western Blotting分析的结果。从相应的考马斯亮蓝染色胶上取点经胶内酶切后使用MALDI-TOF质谱鉴定了22个免疫反应蛋白点，对应于9种蛋白质。其中有3个免疫反应蛋白点对应于TolC蛋白质(见图2)。鉴定出的蛋白点编号标注在图中，其它信息列于表1。
表1.具免疫原性的外膜蛋白
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>蛋白质TolC在制备免疫制剂及疫苗中的用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1479<212>DNA<213>
<400>1atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc 60caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt 120aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta 180ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac 240ggcatcaact cgaacgcgac cagtgcgtcc ctgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg 300tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacatat 360cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat 420gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat 480caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc 540gcgcagtacg ataccgtgct ggcgaacgaa gtgaccgcac gtaataacct tgataacgcg 600gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggcggc gctgaatgtc 660gaaaacttta aaaccgacaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa 720cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggagcgcga gcaaattcgc 780caggcgcagg atggtcactt accgactctg gatttaacgg cttctaccgg gatttctgac 840acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat 900atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt 960aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgttggtg ccagtgagca actggaaagc1020gcacatcgta gcgtcgtgca aaccgtacgt tcctccttca acaacattaa tgcttctatc1080agtagtatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgcgc aaagctcatt agacgcaatg1140gaagcgggct actcggtcgg tacgcgtacc attgttgatg tgttggatgc gaccaccacg1200ctgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg1260aatattaagt cagccctggg tacgttgaac gagcaggatt tgctggcact gaacaatgcg1320ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgccc cgcaaacgcc ggaacagaat1380gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcacccg tcgttcagca aacatccgca1440cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaac 1479
<210>2<211>493<212>PRT<213>
<400>2Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe1 5 10 15Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala20 25 30Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala35 40 45Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu50 55 60Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn65 70 75 80Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser85 90 95Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala100 105 110Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr Leu Ile115 120 125Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val130 135 140Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp145 150 155 160Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val165 170 175Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr180 185 190Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ile Thr195 200 205Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys210 215 220Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys225 230 235 240
Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Glu Arg245 250 255Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Leu260 265 270Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Thr275 280 285Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn290 295 300Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val305 310 315 320Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ser Glu325 330 335Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg Ser Ser340 345 350Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gln355 360 365Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr370 375 380Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Thr385 390 395 400Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu405 410 415Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln420 425 430Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser Thr Asn435 440 445Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp450 455 460Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala465 470 475 480Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn485 490
权利要求
1.蛋白质TolC或其功能片段在制备用于诊断或预防由肠道菌感染引起的疾病的药物中的用途，所述蛋白质TolC的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.根据权利要求1的用途，其中所述肠道菌为痢疾杆菌。
3.根据权利要求1的用途，其中所述药物为疫苗。
4.根据权利要求1的用途，其中所述药物为诊断试剂。
5.一种疫苗制剂，含有蛋白质TolC或其功能片段，所述蛋白质TolC的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
6.一种诊断试剂，含有蛋白质TolC或其相应的抗体，所述蛋白质TolC的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
全文摘要
本发明公开了TolC蛋白质的医疗用途，具体地说为该蛋白质在制备免疫制剂及疫苗中的应用。本发明通过实验，用免疫蛋白质组学技术发现TolC具有极强的血清学反应，因其位于胞外，很可能是中和性抗原，可用作痢疾感染的检测诊断制剂或可用作保护性抗原进行疫苗研制，具有良好的应用前景。
文档编号A61P31/04GK1876180SQ20051007690
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月9日 优先权日2005年6月9日
发明者王恒樑, 黄留玉, 应天翼, 冯尔玲, 苏国富 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所