专利名称：胸腺素β4衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质药物衍生物的产生领域。通过对天然蛋白胸腺素β4(Tβ4)的改造，得到了Tβ4的衍生物Gly-Tβ4。通过实验证明，该衍生物在受损组织的修复过程中起到非常重要的作用，进而有望被开发为一种造福于人类的新药。
二.
背景技术：
免疫系统是人体的防御系统。参与免疫反应的主要细胞有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中胸腺素β4(Tβ4)是现已结构和功能较为明确的一种主要的胸腺因子。正如用Tβ4(一种涉及正在发育的胚胎中细胞迁移和存活的蛋白)的活性所做的一项研究所表明的那样，“胸腺素—贝塔4”增强组织培养物中胚胎及出生后心肌细胞的存活能力，在大鼠冠状动脉结扎后腹膜内注射该蛋白，能成功刺激心脏修复和激活Akt“存活激酶”。这些结果说明，“胸腺素—贝塔4”对于急性冠状动脉闭塞是一个可能的治疗目标。德克萨斯州大学的研究人员发现一种在心脏发育过程中制造的蛋白质(胸腺素β-4)在心脏病发作后能够帮助心脏器官的自我修复。这些在大鼠实验中获得的发现最终可能导致新的心脏病疗法的出现并且可能改变医护人员对心脏病的处理方式。
胸腺素β-4是一种胚胎在心脏发育过程中表达的蛋白，它能促进心脏细胞的迁移并影响这些细胞的生死存亡。新研究表明这种蛋白能够在实验诱导的心脏病发作后防止细胞的死亡并限制疤痕组织形成的程度。胸腺素β-4已经被用于临床试验，以促进皮肤创伤的痊愈。研究人员相信不久的将来这种蛋白将会进入心脏病治疗的临床试验阶段。
Tβ4是Goldstein等最早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分5(TF5)中分离出来的一种多肽，含43个氨基酸，分子量4.963KD，无二硫键与糖基化。经蛋白三级结构分析，在Tβ4的N末端加上一个甘氨酸，有利于Tβ4生物功能的发挥。
三.
发明内容
本发明中Gly-Tβ4的制备方法为先以Tβ4氨基酸序列为模板选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tβ4 DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点，以GST氨基酸序列为模板选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点，再将先导肽、Tβ4以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选出一成功重组子命为PSK-Tβ4。用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本公司质粒PGM(该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本公司构建)连接，经筛选得到正确重组子命名为PGM2Tβ4。将PGM2Tβ4转化到表达宿主菌BL21中，经表达筛选出高表达工程菌PGM2Tβ4/BL21，然后在30升发酵罐中对PGM2Tβ4/BL21进行高密度发酵，经12小时发酵，最终得到目的蛋白表达量占菌体总蛋白量60％的工程菌体，，湿重约100g/L，再经离心收集菌体，高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用凝血酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98％。
在动物实验研究中，发现胸腺素Gly-Tβ4与其它两种蛋白一起，通过激活Akt/蛋白激酶B来促进心肌细胞的迁移和存活。在研究了培养的细胞活性后，首先研究了Gly-Tβ4对受损心脏组织的作用，研究人员将60只成年大鼠的冠状动脉结扎模拟心脏病发作，从而创造出大鼠模型。接着给20只大鼠局部注射胸腺素Gly-Tβ4 2ug/只，给20只大鼠局部注射胸腺素Tβ4 2ug/只，而另20只大鼠只注射盐水200uL作为空白对照。连续注射胸腺素Gly-Tβ4与Tβ4一月的大鼠的受损心脏中的细胞很少死亡，并在心脏病发后数周改善了心脏功能，而且Gly-Tβ4治疗效果比Tβ4明显。研究人员相信胸腺素Gly-Tβ4能够改变细胞的代谢并创造出更强大的心肌细胞，这些细胞能够抵抗心脏病发后的低氧状况。
接下来研究了Gly-Tβ4对受损表皮组织的作用，研究人员将30只成年大鼠的表皮划伤，从而创造出大鼠表皮损伤模型。接着给10只大鼠局部涂抹胸腺素Gly-Tβ4 5ug/50ul/只/天，给10只大鼠局部涂抹胸腺素Tβ4 5ug/50ul/只/天，而另10只大鼠只涂抹生理盐水50uL/天作为空白对照。连续涂抹胸腺素Gly-Tβ4与Tβ4 5天的大鼠的伤口长度比空白对照小50％，而且Gly-Tβ4治疗效果比Tβ4明显。
随后还研究了Gly-Tβ4对受损角膜组织的作用，研究人员将30只成年大鼠的角膜用1N烧碱烧伤，从而创造出大鼠角膜损伤模型。接着给10只大鼠眼部滴胸腺素Gly-Tβ4 5ug/5ul只，2次/天；给10只大鼠眼部滴胸腺素Tβ4 5ug/5ul只，2次/天；而另10只大鼠眼部只滴注射盐水5ul/只，2次/天。连续眼部滴胸腺素Gly-Tβ4与Tβ4 4天的大鼠的受损角膜完全恢复，而用生理盐水组的动物角膜不但没恢复，还出现了严重的炎症和充血。研究人员将会确定这种蛋白的最有效剂量、用药的最佳时间。这项研究将会为心脏病、角膜损伤、表皮损伤的治疗开辟出新的途径。如果这种蛋白对人类同样有效，那么这种蛋白将会成为一种强有力的治疗药物。
经测试，本发明的Gly-Tβ4衍生物活性高于天然Tβ4。
四.
图1是对大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠心脏壁厚度的影响结果。
图2是对大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠心脏壁纤维化程度的影响结果。
图3是对大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠表皮伤口愈合程度的影响结果。
图4是对大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠的损伤角膜表皮形成程度的影响结果。
五.
具体实施例方式
以下实例仅是对本发明的说明，而不会对本发明产生任何限制。
一)胸腺素β4衍生物的获得首先通过全基因合成扩增出胸腺素β4前体蛋白的全基因序列GGA TCC GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GAT AAG TCG AAACTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC AAA GAA ACGATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA GTC GAC以GST基因为模板，PCR扩增获得500bp左右的产物，经测序质粒克隆、基因测序，得到设计序列备用。
目的片段经BamH I、EcoR I、XhoI双酶切后分别回收小片段，质粒PGM经XhoI和EcoRI双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为PGM2Tβ4。然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LK中培养至OD600为0.6-0.8时加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为40％。经胸腺素β4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得的高效表达胸腺素Gly-Tβ4前体蛋白的工程菌命名为PGM2Tβ4/BL21。
1.发酵1)摇瓶表达含胸腺素β4前体蛋白基因的PGM2Tβ4/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素β4前体蛋白(30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。
2)发酵工艺a.培养基a)种子液培养基(LK)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化钠10克/升、卡那霉素50微克/毫升。
b)种养基(15升)磷酸氢二钠315克、磷酸二氢钾100克、 氯化钠10.05克、氯化铵50克、 胰蛋白胨90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁15克、 葡萄糖450克、 补料(500克/升)葡萄糖b.发酵过程1.种子培养从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LC中，36度、200转/分，过夜。
2.发酵过程将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36度、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。
2.层析(1)亲和层析采用GSH-Agrose层析介质(Sigma公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
(2)酶解上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。
(2)阴离子交换层析采用Source30Q层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上一步得到的样品用水稀释1倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1MNaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
3.检测得到的胸腺素β4通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于98％。
二)Gly-Tβ4体内生物学评价1.Gly-Tβ4与Tβ4对大鼠心脏缺血模型的治疗效果评价1)、病态动物模型的制作与试验方法为了评价Gly-Tβ4与Tβ4的药物有效性，建立了急性心肌梗塞的病态动物模型——大鼠冠状动脉左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠前胸壁皮肤，切断第3到第6肋骨，露出胸腔，将肺推向一侧，打开心囊，露出心脏。从冠状动脉左前降支起点到3mm处，用6-0聚丙烯(polypropylene)结扎丝与NELATON结扎血管，1小时后再灌注。确认无出血后，将切断的肋骨与胸骨缝合，再缝合皮肤。手术后肌肉注射庆大霉素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2)、利用超声心动图比较左心室前壁厚度建立大鼠心脏缺血模型后，注射阴性对照物(生理盐水)，阳性对照物(Tβ4)，试验物质(Gly-Tβ4)。注药后第14、28、56天利用心脏超声心动图(Live 3D Echo 7500)与探针(probe15-16L)，测定各组左心室前壁厚度。
基础值(第0天，给药前)，生理盐水组0.2682±0.01，Tβ4组0.2513±0.032，Gly-Tβ4组0.2499±0.0225，各组之间无显著性差异。
给药14天，生理盐水组0.1365±0.0125，Tβ4组0.1919±0.0128，Gly-Tβ4组0.2162±0.0078，Gly-Tβ4组心脏左心室前壁厚度增加(p＜0.05)。
这些结果显示，Gly-Tβ4能有效恢复心肌梗塞引起的左心室壁厚度的减少(见图1)。
4)、利用组织学图片比较在心室纤维化程度试验第56天，取心脏，以乳头状肌肉为准，横切心脏，做成切片。用1％福尔马林浸泡24小时，制造石腊组织切片及玻片，进行Masson’trichrom染色。各组之间比较采用了Image-pro PLUS ver.4.1(Media Cybernetics)方法。
心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，生理盐水组30.02±5.1％，Tβ4组23.15±2.9％(P＜0.05＝，Gly-Tβ4组15.36±2.7％(P＜0.0005＝；生理盐水组与Tβ4组、Gly-Tβ4组之间有显著性差异，尤其Gly-Tβ4组有非常显著性差异。这些结果表明Gly-Tβ4能有效减少心肌梗塞引起的心肌损伤和心肌纤维化(见图2)。
2.Gly-Tβ4与Tβ4对大鼠表皮损伤模型的治疗效果评价1)、病态动物模型的制作与试验方法为了评价Gly-Tβ4与Tβ4的药物有效性，建立了表皮损伤的病态动物模型——大鼠表皮损伤模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠后背皮肤3cm。
2)、利用电脑图像分析系统测量伤口长度建立大鼠心脏缺血模型后，注射阴性对照物(生理盐水)，阳性对照物(Tβ4)，试验物质(Gly-Tβ4)。用药后第5天利用电脑图像分析系统测量伤口长度。
基础值(第0天，给药前)，生理盐水组3.15±0.21，Tβ4组3.07±0.18，Gly-Tβ4组3.13±0.11，各组之间无显著性差异。
给药第5天生理盐水组2.37±0.18，Tβ4组1.62±0.13，Gly-Tβ4组1.14±0.12各组之间无显著性差异。
这些结果显示，Gly-Tβ4能有效促进表皮伤口愈合(见图3)。
3.Gly-Tβ4与Tβ4对大鼠角膜损伤模型的治疗效果评价1)、病态动物模型的制作与试验方法为了评价Gly-Tβ4与Tβ4的药物有效性，建立了急性角膜损伤的病态动物模型——大鼠角膜碱烧伤模型。
把直径2毫米的滤纸片浸泡到1N的烧碱中，然后将浸泡好的滤纸片放到大鼠角膜正中央，30秒以后用PBS充分冲洗。立刻用Gly-Tβ4与Tβ4治疗，4天后挖出眼球，10％甲醛固定后用石蜡包埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统采集、分析角膜上皮恢复情况。
2)、利用利用电脑图像分析系统测量角膜上皮恢复情况基础值(第0天，给药前)，生理盐水组4.82±0.12，Tβ4组4.76±0.18，Gly-Tβ4组4.85±0.16，各组之间无显著性差异。
给药第4天生理盐水组4.89±0.12，Tβ4组7.03±0.13，Gly-Tβ4组7.62±0.11，生理盐水组与Tβ4组、Gly-Tβ4组之间有显著性差异，尤其Gly-Tβ4组有非常显著性差异。这些结果表明Gly-Tβ4能有效促进角膜碱烧伤后的恢复(见图4)。
权利要求
1.一种44肽胸腺素β4衍生物，该衍生物氨基酸序列为Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。
2.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为药物组合物主要成份，用于治疗皮肤组织损伤的修复。
3.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为药物组合物主要成份，用于治疗心脏组织损伤的修复。
4.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为药物组合物主要成份，用于冠心病的治疗。
5.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为药物组合物主要成份，用于角膜损伤的修复。
6.权利要求1中所述的肽胸腺素β4衍生物是用基因重组方法得到。
7.权利要求1中所述的肽胸腺素β4衍生物是用化学合成方法得到。
全文摘要
本发明涉及一段具有高生物活性的胸腺素β4衍生物，本发明得到的胸腺素β4衍生物，可用于角膜、皮肤、心脏损伤的修复。
文档编号A61P27/02GK1935838SQ20051010329
公开日2007年3月28日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者聂李亚, 马素永, 许松山, 文美玉 申请人:北京诺思兰德生物技术有限责任公司