专利名称：六棱菊属植物提取物抑制单纯疱疹病毒及乙肝病毒的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及含有六棱菊属植物中的咖啡酰奎尼酸类化合物的提取物可期待具有作为治疗1型和2型单纯疱疹病毒及乙型肝炎病毒感染引起的各种病症药物的医药用途。
背景技术：
病毒感染性疾病是威胁人类疾病的大敌，研究表明，有60％的疾病是由病毒感染引起的，而病毒感染性病症已成为我国人口死亡的主要原因之一。新型病毒的不断出现，如人类免疫缺陷病毒，非典型性肺炎病毒等，则对抗病毒药物的开发提出更高的要求。对病毒感染性疾病的治疗至今仍缺乏专属性强的药物，目前临床上使用的药物主要有如下几类抑制病毒复制的抗病毒药物；增强机体免疫功能的免疫调节剂；针对临床症状的止咳、镇痛、解热和消炎等治疗药；防止继发感染的抗感染药；预防病毒感染的疫苗及阻断病毒传播的消毒药等。目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞，另外这些抗病毒药物还存在毒副作用大，易引起病毒基因突变，停药后易反跳等缺点，因此开发新型抗病毒药是当今药物研发领域的当务之急。
人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)。HSV-1病毒主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。HSV-2病毒主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV被激活而发病。临床上治疗人类单纯疱疹病毒的感染的最主要药物有核苷类药物如阿昔洛韦，更昔洛韦等，它们虽然能有效地控制病情，但长期使用可出现谵妄、震颤、皮疹、血尿及血清转氨酶暂时升高等不良反应，甚至会出现肾功能损害。
乙型病毒型肝炎(Hepatitis B)是中国多发和常见重型传染性疾病，其病原体是乙型肝炎病毒(HBV)。全国6亿人曾感染过HBV，约1.2亿携带HBV，每年死于原发性肝癌的15万人中，绝大多数与乙型肝炎有关。临床上治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物最早是阿昔洛韦其对乙肝表面抗原(HBsAg)无阴转作用，对乙肝e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)阴转率分别为25.0％和27.6％，近期发展了许多新的核苷类用药，包括拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)等，它们虽然能有效地控制病情，但一则售价昂贵，二则长期使用均可出现耐药性，以及不同程度的反跳。三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的众所周知的不良作用。所以从民族民间长期使用的药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂有着很大的意义。主要的判断指标在于该类新颖的非核苷类药物必须具有对HBVDNA和/或HBeAg的抑制活性。
六棱菊属(Laggera genus)是菊科中的一个属，全球约有20种，主要分布在非洲中部及亚洲东南部。可作为药用的在我国仅发现六棱菊(Laggera pterodonta)和四棱锋(Laggera alata)两种，主要分布在长江以南及西南地区。六棱菊属植物作为云南民族用药对风热邪毒、痈疽、疮疖、疥癣、血风癣疮等病症有疗效，《云南思茅中草药选》记载了六棱菊具有清热解毒、消肿拔脓的功效，对咽喉炎、口腔炎、支气管炎、疟疾、跌打损伤、烫烧伤、疮疖肿毒、蛇咬伤等症有独特疗效。
本发明人近几年针对多种炎症模型对六棱菊属植物六棱菊和四棱锋的提取物进行了系统的化学成分和药理活性研究。经体外实验和动物实验表明，这些含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物具有显著的抗炎、体内外抗甲型流感病毒IVA、抗菌作用，能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，对角叉菜所致大鼠足趾肿胀、角叉菜所致大鼠胸膜炎具有明显的抑制作用。以上研究成果和发现已经申报国家发明专利(受理号CN200510077457.3)。在此现有技术的基础上，本发明人又进一步研究了其对几种常见并危害严重的病毒复制的抑制作用，发现这些含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物具有很强的抑制单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)，及乙型肝炎病毒(HBV)复制的作用，并且能降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达，从而预期可以成为抗1型和2型单纯疱疹病毒及治疗乙型肝炎病毒的药物。经文献查阅，到目前为止，尚没有有关含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物治疗单纯疱疹病毒(HSV-1和/或HSV-2)及乙型肝炎病毒(HBV)感染性疾病和制备抗该类病毒药物的报道。本发现具有新颖性和创造性，故而完成本发明。
发明内容
因此，本发明的目的是提供了一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物抑制单纯疱诊病毒-1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)及乙型肝炎病毒(HBV)复制并且能降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达的活性；本发明的另一目的是提供了将含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于抑制单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)及乙型肝炎病毒(HBV)复制并且能降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达的用途；本发明的另一目的是提供了一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于抑制HSV-1、HSV-2及HBV复制并且能降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达的药物组合物；本发明中的六棱菊属植物中咖啡酰奎尼酸类化合物提取物按比色法测定含酚性化合物含量在30％以上。
早期的研究多集中于六棱菊属植物中的低极性和中极性部位，并且得出结论认为该属植物富含黄酮类化合物和倍半萜类化合物(文献1.李顺林等，云南植物研究，1994，16(4)434-436。2.李顺林等，云南植物研究，1996，18(3)349-352。3.赵昱等，(美国)天然产物杂志(Journal of Natural Products)，1997，60，545-549。4.赵昱等，(英国)植物化学(Phytochemistry)，1997，44，459-464。5.赵昱等，云南植物研究，1997，19(2)207-210。6.赵昱等，中国化学快报，2003，14(4)，393-396。7.赵昱等，(美国)天然产物杂志(Journal of NaturalProducts)，2003，66(8)，1078-1081。8.赵昱等，(英国)植物化学(Phytochemistry)，2003，63(7)835-839。9.赵昱等，(意大利)植物治疗杂志(Fitoterapia)，2003，74(5)459-463。10.赵昱等，浙江大学学报(医学版)，2002，31(6)406-409。)。然而根据本发明人后期更深入的研究，发现其抗病毒活性成分集中在植物提取物的大极性部位，且此大极性有效部位主要有效成分为不同取代数量和不同取代位置的咖啡酰基奎尼酸类化合物。近代药理学试验研究表明此类咖啡酰基奎尼酸类化合物具有多种重要生理活性，主要表现在抑制乙肝病毒和艾滋病毒等抗病毒疾病。
本发明人进行的药效学实验结果表明，含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物在实验浓度下对Vero细胞的生长无明显抑制作用，TD50＞1000μg/mL。实验结果表明，含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物有显著的抑制HSV-1的作用，其对HSV-1的半数抑制浓度为88.64μg/mL，治疗指数为大于11.28，这说明含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物能显著抑制HSV-1的复制，且没有明显的毒性。含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对HSV-2的半数抑制浓度为90.05μg/mL，治疗指数大于11.10，这说明含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物能显著抑制HSV-2的复制，且没有明显的毒性。实验结果还显示出，含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对HepG 2.2.15细胞生长的半数抑制浓度大于1000μg/mL，而对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制的半数抑制浓度为66.58μg/mL，治疗指数大于15.02；这说明含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物能显著抑制HBV的复制，且没有明显的毒性。此外，本发明人还发现这种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物可以降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达在第八天和第十二天时对HepG 2.2.15细胞分泌的HBeAg在药物浓度为100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL时抑制率分别超过30％、15％和10％。
根据本发明人的上述研究，本发明得到的含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物具有抑制单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)及乙型肝炎病毒(HBV)复制并且能降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达功能；可以用于治疗相关的病毒感染性疾病。从而可能开发出抗病毒药物组合物。这种药物组合物可以用制药领域中的常规技术制成，可以制成各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等。这些药物组合物可以用于预防和治疗病毒感染疾病等用途。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明的实质，下面分别用实施例的形式将化合物对单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)复制的抑制活性、对乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的抑制试验、对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制试验的药理实验结果，说明其在制药领域中的新用途。药理实施例给出了含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物部分活性数据。同样必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。
实施例1含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对HSV-1的抑制作用试验1.1细胞培养和病毒传代将vero细胞培养于含10％灭活小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/mL的RPMI1640培养基中，置37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。将HSV-1加入长有的Vero的细胞瓶中，置37℃，5％CO2，100％相对温度的培养箱中培养，收集培养上清，置低温下保存。
1.2实验方法采用MTT法测定含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对Vero细胞生长的抑制作用取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1×105/mL，接种于96孔细胞培奍板，每孔100μL，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的六棱菊属植物提取物，浓度分别为1000μg/mL，200μg/mL，40μg/mL和8μg/mL，置于培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入5mg/mg MTT试剂10μL，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMSO 200μL，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD。以只加培养基的培奍孔为对照孔。抑制率(％)＝对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。实验重复三次。根据不同浓度下对细胞生长的抑制率，计算对细胞生长的半数抑制浓度(TD50)。
微量细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1×105/mL，接种于96孔细胞培养板，37℃，5％CO2，100％相对湿度培养24小时，加入100 TCID50的病毒100μL，倾出病毒，分别加入不同浓度的六棱菊属植物提取物，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37℃，5％CO2，100％相对湿度培养48小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变的标准“-”指细胞无变化，分值为8分；“+”指25％以下细胞出现病变，分值为6分；“++”指25％～50％细胞出现病变，分值为4分；“+++”指50％～75％细胞出现病变，分值为2分；“++++”指75％以上细胞出现病变，分值为0分。计算半数抑制浓度(IC50)。
同时用阿昔洛韦作为阳性对照药。计算样品治疗指数TI＝半数中毒浓度/半数抑制浓度。
1.3实验结果结果如表一显示，含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物能显著抑制HSV-1的复制，其对HSV-1的半数抑制浓度为88.64μg/mL，治疗指数为11.28。
表一.含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物作用
注TD50样品对细胞生长的半数抑制浓度(μg/mL)；IC50样品对病毒复制的半数抑制浓度(μg/mL)；TI治疗指数，TI＝TD50/IC50。
实施例2含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对HSV-2的抑制作用试验2.1细胞培养和病毒传代同实施例一。
2.2实验方法采用MTT法，同实施一的方法计算对细胞生长的半数抑制浓度(TD50)、对病毒生长抑制作用(IC50)，以及样品治疗指数(TI)。
2.3实验结果结果如表一显示，含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物能显著抑制HSV-2的复制。其对HSV-2的半数抑制浓度为90.05μg/mL，治疗指数为11.10。
实施例3含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制作用试验3.1仪器与试剂PE7700自动荧光PCR仪，美国Perkin Elmer公司生产；HBVDNA荧光定量检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均购自Gibco公司。
3.2体外细胞模型HepG 2.2.15细胞株由由浙江大学中药与天然药物研究室培养提供，将HepG 2.2.15细胞接种于DMEM培养液(含10％胎牛血清，380ug/mL G418)，置5％CO237℃培养箱中培养。
3.3药物作用HepG 2.2.15细胞用胰蛋白酶消化液消化，稀释成8×104/mL悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔200uL，24小时后，换含药培养液，含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物药物浓度分别为0.5mg/mL，0.05mg/mL，0.005mg/mL，继续培养24小时，留取培养上清于-20℃冻存待检。以同样条件下不含药物的培养液培养的细胞作为对照，以拉米呋啶作为阳性对照，用同样的方法测定其对HBV的抑制作用。
3.4HBVDNA定量采用常规碱裂解法从培养上清中提取HBVDNA。按试剂说明书操作，50uL反应体积中含30uL反应缓冲液，5uLMgCl2，5uL引物和探针，7uL样品处理上清液和3uL Taq酶。各反应管放入PCR仪中，按下列条件扩增92℃2分钟预变性，然后按93℃45秒-55℃120秒，共40个循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出结果。
3.5试验结果含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制试验结果如表二所示表二.含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物第八、十二天对HepG2.2.15脱氧核糖核酸(HBVDNA)的百分抑制率以及第12天对细胞生长的抑制率
试验结果说明第四天、第八天和第十二天含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对HBVDNA均显示出一定的抑制活性，但是比阳性对照药品拉米呋啶对HBVDNA的抑制活性要弱，属于有一定活性的HBVDNA抑制剂。
结论含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物能显著抑制HBVDNA的复制，其对HBVDNA的半数抑制浓度为66.58μg/mL，治疗指数大于15.02。
实施例4含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物对乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的抑制作用试验4.1材料与方法用ELISA法(标准HBeAg诊断试剂盒)检测样品对HBeAg的抑制作用。
4.2标准试剂盒检测方法加入药物孵育5，7，14天后的细胞培养上清液，吸出少许，用ELISA法测定，在450nm检测OD值。测定HBeAg，结果以P/N值表示。以同样条件用不含样品的培养基培养的细胞作为对照。将6个平行孔的P/N比取平均值后，计算抑制率。阳性药物对照拉米呋啶(3-TC)。
抑制率＝(对照孔P/N值-实验孔P/N值)÷(对照孔P/N值-2.1)4.3检测结果药理实施例4中测试对HBeAg抑制率的试验结果见表三。表三.含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物第四天、第八天和第十二天对HepG 2.2.15分泌的乙肝e抗原的百分抑制率
试验结果说明乙型肝炎e抗原与抗体(HBeAg与抗-HBe)是判断乙型肝炎病毒感染重要标志，抑制HBeAg并使HBeAg转阴反应是治疗乙型肝炎中的直接目的之一。第四天、第八天和第十二天含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物在高浓度时对乙肝e抗原HBeAg均显示出较强的抑制活性，且比阳性对照药品拉米呋啶对乙肝e抗原的抑制活性强，许多倍。
结论含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物属于有较高活性的乙肝e抗原HBeAg抑制剂。
权利要求
1.一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物抑制乙肝病毒表面抗原和乙肝病毒e抗原以及抑制乙肝病毒脱氧核糖核酸复制活性。
2.一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于抑制单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)复制的用途，其特征是该六棱菊属植物提取物对非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞)生长的半数抑制浓度大于1000μg/mL，对单纯疱疹病毒-1型复制的半数抑制浓度为88.64μg/mL，治疗指数大于11.28。
3.一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于抑制单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)复制的用途，其特征是六棱菊属植物提取物对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)生长的半数抑制浓度大于1000μg/mL，对单纯疱疹病毒-2型复制的半数抑制浓度为90.05μg/mL，治疗指数大于11.10。
4.一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的用途；其特征是六棱菊属植物提取物对HepG 2.2.15细胞生长的半数抑制浓度大于1000μg/mL，对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制的半数抑制浓度为66.58μg/mL，治疗指数大于15.02。
5.一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达的用途；其特征是六棱菊属植物提取物在第八天和第十二天时对HepG 2.2.15细胞分泌的HBeAg在药物浓度为100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL时抑制率分别超过30％、15％和10％。
6.一种含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物用于抑制HSV-1、HSV-2及HBV复制并且能降低乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达的药物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1～5所述之六棱菊提取物或其可药用盐或溶剂化物或者它们的混合物和可药用辅料。
7.根据权利要求6的药物组合物，其是外用搽剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、口服液或软膏剂，还可以果用现代制药界所公知的控释或缓释剂型。
8.根据权利要求1～7的内容，本发明中的含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物按比色法测定含酚性化合物含量在30％以上。
全文摘要
本发明涉及六棱菊属植物提取物作为治疗单纯疱疹病毒(1型和/或2型)、乙型肝炎病毒感染引起的各种病症药物的新用途。本发明的六棱菊属植物提取物由六棱菊属植物鲜品或干品经醇水提取、柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，提取物中咖啡酰奎尼酸类化合物含量在30％以上。本发明得到的六棱菊属植物提取物具有明显地抑制单纯疱疹病毒－1型(HSV－1)、单纯疱疹病毒－2型(HSV－2)及乙型肝炎病毒(HBV)复制的作用，并且能降低HepG 2.2.15细胞株中乙肝病毒e抗原(HBeAg)功效，可以用于治疗上述相关病毒感染引起的各种病症。
文档编号A61K9/00GK1989989SQ200510132508
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月26日 优先权日2005年12月26日
发明者赵昱, 周长新, 李海波, 于荣敏, 巫秀美 申请人:浙江海正天华新药研发有限公司