专利名称：鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗及其研制方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用生物制品及其研制方法，特别是涉及一种鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗及其研制方法。
背景技术：
鸡志贺氏菌病是由鸡志贺氏菌引起的鸡的一种新发急性传染病。该病主要特征为拉稀、痢疾和明显的肠道病变。早期调查显示在同一个养鸡场发病率可高达100％，死亡率达3.84～33.5％。耐过鸡表现消瘦，生长发育缓慢。由于该病是鸡的一种新发传染病，人们对其知之甚少，常常被误诊为鸡白痢或鸡球虫病等，给该病防治工作造成很大困难，结果导致了严重的经济损失。本发明人除首次发现鸡志贺氏菌病，近年还利用发明的鸡志贺氏菌诊断液和微量平板凝集试验快速检测方法，对我国河南、山东等不同地区35家鸡场具有拉稀病史的670只鸡血清灭活样品进行了检测。通过检测对鸡志贺氏菌病的发病率、流行地区、品种、日龄及有无混合感染等进行了血清流行病学调查。调查结果表明目前我国部分地区存在有鸡志贺氏菌感染，其血清抗体阳性率较高，达28.3～33.7％，已远远超过鸡白痢。
目前国内外教科书均指出志贺氏菌具有高度的传染性，可引起人的肠炎痢疾，并以1～4岁儿童发病率和死亡率较高。国内外多篇报道指出志贺氏菌可感染猴子，还可感染犊牛、仔猪、家兔、小白鼠、豚鼠等。所有痢疾杆菌均能产生内毒素、细胞毒素、肠毒素(外毒素)。痢疾杆菌对肠道的致病作用主要依靠菌毛对粘膜上皮细胞的粘附，继而穿入粘膜上皮细胞内及粘膜固有层内繁殖而引起炎症。为了有效预防鸡志贺氏菌的感染，降低该病的发病率和死亡率，防止人禽交叉感染，减少因该病造成的环境污染，本发明人了开展鸡志贺氏菌灭活疫苗的研制，这对提高养殖业的经济和社会效益具有重要的意义和价值。
由查新报告得知，以前鸡志贺氏菌病在国内外均未见有报道，2003年初该病由本发明人首次发现，并于2003年和2005年在国内外重要专业学术会议上及2004年国内重要专业刊物上公开发表，“鸡志贺氏菌病在我国的发现及其病原特性研究”一文，不仅公开发表于2004年第4期《中国预防兽医学报》，而且还于2003年10月获得第10次全国家畜传染病学术会议大会优秀学术论文。此外，该论文英文摘要还被收录于2005年8月在土耳其举办的第14届世界禽病学术大会论文集。
为了对多种动物有效预防该病的发生，本发明人利用分离到的鸡志贺氏菌研制出该菌灭活疫苗，并利用本发明产品对鸡进行免疫接种，同时进行了疫苗免疫功能和免疫保护力的测定，为有效预防该病提供了可靠依据和重要条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效预防鸡志贺氏菌感染的灭活铝胶疫苗及其制备方法。
本发明的技术方案是一种鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗，含有有效剂量的灭活鸡志贺氏菌和兽医学上可接受的佐剂；所述的佐剂为氢氧化铝胶或明矾；所述的灭活鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌，或鸡鲍氏志贺氏菌，或鸡福氏志贺氏菌，或鸡宋内氏志贺氏菌中的任一种灭活菌；所述的疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5.6～8.33亿/ml。
一种鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)菌种传代和复壮将纯化的鸡志贺氏菌接入1％葡萄糖肉汤中，在37±0.5℃条件下培养24～30h，然后用血液平板培养复壮；(2)细菌接种和扩大培养将复壮的鸡志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，用灭菌棉球蘸取培养好的鸡志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37±0.5℃培养24～30h；(3)收集细菌在长满志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入3～5ml 0.85％灭菌生理盐水，刮取SS平板上的志贺氏菌菌苔，然后将菌液移入无菌瓶中；(4)细菌计数和浓度调整将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为7～10亿/ml；
(5)细菌灭活向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37±0.5℃条件下作用24～30h；(6)加入佐剂向制备好的细菌灭活肉汤加入氢氧化铝胶，肉汤与氢氧化铝胶的体积比为4～5∶1，混合均匀后制成疫苗。
所述的疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5.6～8.33亿/ml。
所述的鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌，或鸡鲍氏志贺氏菌，或鸡福氏志贺氏菌，或鸡宋内氏志贺氏菌中的任一种。
所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗在预防鸡志贺氏菌感染方面的应用。
疫苗制成后，按要求分别进行成品无菌检验、安全检验和效力检验。
本发明的积极有益效果(1)利用本发明疫苗对鸡进行免疫接种，可有效预防鸡志贺氏菌感染，经测定，免疫鸡的细胞免疫和体液免疫力显著增强，首免后免疫保护率达85.1％，二免后免疫保护率可达90％以上，从而达到有效预防鸡志贺氏菌感染的目的。
(2)本发明疫苗具有性能稳定、易保存、无毒、无污染、简便易行等优点；鸡免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高等特点。
(3)由查新得知，利用鸡志贺氏菌发明的“鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗”产品，目前在国内外尚属首创。本发明产品已广泛应用于生产实践中，使鸡志贺氏菌感染率大大减少，在有效预防和控制鸡志贺氏菌感染方面发挥了积极的重要作用。
(4)本发明产品应用于畜牧养殖业，对有效控制鸡志贺氏菌感染，保障养殖业健康发展和绿色食品安全，防止人和动物交叉感染具有重要的意义。因此本发明产品和技术的推广应用，不仅在兽医学上，而且在医学公共卫生方面均具有重要的理论意义和现实意义。
(5)我国是一个养殖大国，要生产出更多优质安全的畜禽产品，该疫苗具有十分广阔的应用前景，可产生显著的经济效益和社会效益。
四
图1免疫组和未免疫组E-花环形成规律曲线图，图2免疫组和未免疫组抗体水平曲线图，
图3免疫组和未免疫组E-花环形成规律曲线图，图4各组抗体消长规律曲线图。
五具体实施例方式发明原理利用分离鉴定的鸡志贺氏菌经加工研制成疫苗，可用于该病的免疫预防接种。其原理是根据免疫学中疫苗抗原能够刺激机体产生抗体和细胞因子，二者可分别提高机体的体液免疫功能和细胞免疫功能，从而使机体获得抵抗志贺氏菌感染的能力。该原理属于免疫学基本原理的特异性免疫应答反应。
实施例一鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶疫苗的制备1、制备步骤(1)菌种传代和复壮将纯化的鸡鲍氏志贺氏菌接入1％葡萄糖肉汤中，在37℃条件下培养24h，然后用血液平板培养复壮；(2)细菌接种和扩大培养将复壮的鸡鲍氏志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用大量1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，用灭菌棉球蘸取培养好的鸡鲍氏志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37℃培养24h；(3)收集细菌在长满志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入3～5ml 0.85％灭菌生理盐水，刮取SS平板上的志贺氏菌菌苔，然后将菌液移入无菌瓶中；(4)细菌计数和浓度调整将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为10亿/ml；(5)细菌灭活向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37℃条件下作用24h；(6)灭活效果检验将灭活细菌肉汤分别接种三管1％葡萄糖无菌肉汤，每管0.2ml；将接种的三管1％葡萄糖肉汤经37℃24h培养，若均无细菌生长视为灭活合格；(7)细菌灭活肉汤的保存置于2～8℃保存备用；(8)加入佐剂将制备好的细菌灭活肉汤，按肉汤与氢氧化铝胶5∶1的体积比加入氢氧化铝胶，充分混合后制成铝胶疫苗，每毫升铝胶苗中含菌数为8.33亿/ml。
(9)各项检验疫苗制成后，按要求分别进行成品无菌检验、安全检验和效力检验。
①无菌检验按国家兽用生物制品质量检验标准进行，应无菌生长。
②安全检验用1月龄健康小鸡5只，每只胸肌注射2ml，观察10天均应健活。用2月龄以上的健康鸡5只，每只胸肌注射4ml，观察10天均应健活。
③效力检验用23日龄健康小鸡10只，每只胸肌注射1ml铝胶灭活疫苗，经16天，连同条件相同的未免疫对照鸡6只，用鸡鲍氏志贺氏菌对免疫组和未免疫对照组鸡只同时进行攻毒，鸡鲍氏型志贺菌肉汤培养物菌数为3.72亿个/ml，攻毒方法为每只小鸡口腔灌服和腹腔注射各1ml。攻毒后连续观察10天，鲍氏型未免疫对照组的6只鸡中出现拉稀症状之比为3/6；鲍氏型免疫组攻毒临床免疫保护率达80％以上，即免疫组攻毒后有2只鸡出现拉稀症状，至少有8只鸡无拉稀症状而得到保护，疫苗判为合格。
2、性状鸡鲍氏志贺氏菌铝胶灭活疫苗静置时，上层为淡黄色透明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀浑浊液。
3、作用及用途该疫苗可用于预防鸡和其它动物的志贺氏菌感染。鸡鲍氏志贺氏菌铝胶灭活疫苗初免后2周产生免疫力，免疫期1个月左右；用此苗二免后1周即可产生免疫力，免疫期4个月。
4、用法及用量用时摇匀，每只成鸡肌肉注射2ml；每只雏鸡肌肉注射0.5～1ml。
5、贮藏置4～10℃避光保存，有效期为1年；室温避光保存，有效期为半年。
6、注意事项及说明防冻结，用前需恢复至室温。
实施例二鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶疫苗的制备同实施例一基本相同，不同之处在于1、制备步骤(1)菌种传代和复壮将纯化的鸡痢疾志贺氏菌接入1％葡萄糖肉汤中，在37℃条件下培养30h，然后用血液平板培养复壮；
(2)细菌接种和扩大培养将复壮的鸡痢疾志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用大量1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，用灭菌棉球蘸取培养好的鸡痢疾志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37℃培养30h；(3)收集细菌在长满志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入3～5ml 0.85％灭菌生理盐水，刮取SS平板上的志贺氏菌菌苔，然后将菌液移入无菌瓶中；(4)细菌计数和浓度调整将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为7亿/ml；(5)细菌灭活向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37℃条件下作用30h；(6)灭活效果检验将灭活细菌肉汤分别接种三管1％葡萄糖无菌肉汤，每管0.2ml；将接种的三管1％葡萄糖肉汤经37℃ 24h培养，若均无细菌生长视为灭活合格；(7)细菌灭活肉汤的保存置于2～8℃保存备用；(8)加入佐剂将制备好的细菌灭活肉汤，按肉汤与氢氧化铝胶4∶1的体积比加入氢氧化铝胶，充分混合后制成铝胶疫苗，每毫升铝胶苗中含菌数为5.6亿/ml。
(9)各项检验疫苗制成后，按要求分别进行成品无菌检验、安全检验和效力检验。
2、效力检验用23日龄健康小鸡10只，每只胸肌注射1ml铝胶灭活疫苗，经16天，连同条件相同的未免疫对照鸡6只，用鸡痢疾志贺氏菌对免疫组和未免疫对照组鸡只同时进行攻毒，痢疾型菌数为5.49×106/ml，攻毒方法均为每只小鸡口腔灌服和腹腔注射各1ml。攻毒后分别连续观察10天，痢疾型未免疫对照组的6只鸡出现拉稀症状之比为4/6；痢疾型免疫组攻毒临床免疫保护率85.1％以上，即免疫组攻毒后有2只鸡出现拉稀症状，至少有8只鸡无拉稀症状而得到保护，疫苗判为合格。
其它步骤及说明同实施例一、不再详述。
在鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗制备的实施例中，肉汤培养物细菌浓度调整后细菌数在7～10亿/ml的范围内可任意选择，这些变化都是本发明实施例的常见变化，不再一一列举。
实施例三鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗的研究——免疫功能及免疫保护力的测定。
为了测定鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗的免疫功能和免疫保护力，用铝胶苗对免疫试验组鸡群定期进行三次接种，首免后第四周进行二免，并于二免后第九周进行三免，同时设立未免疫对照组。对免疫组和未免疫组鸡群每周采血一次，用E-花环形成试验和微量平板凝集试验测定机体的细胞免疫功能和免疫抗体水平。
1材料与方法1.1试验地点、时间2003年8月9日～2004年1月10日于河南农业大学工程楼1108重点实验室进行。
1.2实验动物1.2.1动物来源及饲养管理 50只普通鸡购自河南农业大学种鸡场1日龄固始鸡，淘汰2只弱雏，保留48只外观健康雏鸡，按正常饲养管理标准和免疫程序进行；未免疫对照组的1日龄SPF鸡10只，购自北京梅里亚维通实验技术公司，严格隔离饲养至3周。
1.2.2动物分组 免疫组为30只23日龄固始鸡，用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗首次免疫，每只胸肌注射1ml。首免后第4周二免，二免后第九周三免，均为鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗，每只胸肌注射2ml。未免疫组分为固始鸡18只，SPF鸡10只，均未经鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗免疫接种。
1.3疫苗鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗，由河南农业大学工程楼1108室研制(批号为030420)。
1.4待测样品的采集和处理各组试验鸡每周进行翼下静脉采血两份，一份新鲜抗凝血随即进行E-花环试验；另一份新鲜血液进行血清分离，将分离血清-20℃冻存，待测时先将冷冻血清融解，并进行56℃ 30min灭活。
1.5主要药品试剂和仪器设备1.5.1 E-花环形成试验所需试剂 肝素钠(效价≥160单位/毫克，批号为020509)由上海化学试剂公司生产，用前配制成200单位/毫升溶液；淋巴细胞分层液(ρ＝1.077±0.002，pH＝6.5-7.5)由上海恒信化学试剂有限公司生产(原上海试剂二厂)；绵羊血采于郑州北郊路寨正常成年羊；小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产，用前进行56℃ 30min灭活；50％戊二醛溶液，由天津市科密欧化学试剂开发中心生产(批号为020716)，用前配制成2.5％溶液；pH＝6.4PBS，pH＝7.4无钙镁Hank’s液，瑞氏染液和姬姆萨染液，pH＝7.2阿氏液。
1.5.2 E-花环形成试验所需仪器 台式水平离心机(型号TDL-40B)，由上海安亭科学仪器厂制造；800型离心机由上海手术器械厂制造；电热恒温水温箱(型号HH.W21.600-C)，由北京长源实验设备厂制造；真空干燥箱(型号DZF-IB型)，由上海跃进医疗器械厂制造；OLYMPUS光学显微镜为日本进口。
1.5.3免疫抗体测定所需主要试剂 鸡鲍氏志贺氏菌微量凝集监测抗原，由河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室制备，菌种由该室分离保存。鲍氏志贺氏菌标准阳性血清(批号040401)，由兰州生物制品研究所生产；阴性血清用SPF鸡制备；0.5％石炭酸灭菌生理盐水自备。
1.5.4免疫抗体测定所需主要仪器设备 50孔U型有机玻璃板，由江苏姜堰市容飞器械厂制造；20～200ul单道可调式移液器和50～300ul多道可调式移液器(型号Y32979和Y34540)，由上海雷勃分析仪器有限公司制造；电热恒温水温箱(型号HH.W21.600-C)，由北京长源设备厂制造；隔水式电热恒温培养箱(型号PYX-DHS-50×65-B)，由上海跃进医疗器械厂制造；台式离心机(型号为TDL-40B)由上海安亭科学仪器厂制造；755B型紫外可见光分光光度计，由上海精密科学仪器有限公司制造。
1.6 E-玫瑰花环形成试验简称“E-花环试验”，操作方法按常规法进行，具体内容参见王世若等主编的第二版《现代动物免疫学》(2001年吉林科学出版社出版)第518～519页。
1.7微量平板凝集试验试验方法首先在50孔U型有机玻璃板上做好标记，横向共五排，每排10孔。每排第1孔均加入0.5％石炭酸灭菌生理盐水930μL，而其它各孔均加入50μL。然后每排第一孔加入已灭活处理的待检血清30μL，吹打三次混匀，弃去860μL，然后再从第1孔内吸出50μL加入第2孔，依次类推至第10孔，混匀后弃去50μL。用带乳胶头的滴管每孔加1滴(50μL)混匀的鸡鲍氏志贺氏菌凝集抗原，同时设立标准阳性血清、阴性血清和抗原三个对照。摇动U型板使孔内加样充分混匀，反应温度为20～35℃，反应时间为30～40min。结果判定方法当有少量凝集颗粒，液体不甚透明时，即出现50％抗原凝集(用“++”表示)，此时血清最高稀释倍数为该待检血清的抗体效价。
1.8免疫攻毒保护试验在首免后第16天、第28天用分离的鸡鲍氏志贺氏菌接种于1％葡萄糖肉汤中，经37℃24h培养，对免疫组和未免疫组进行攻毒，同时对细菌肉汤培养物进行计数(首免后第16天攻毒鸡鲍氏志贺菌肉汤培养物为3.72亿个/ml，首免后第28天攻毒鸡鲍氏志贺菌肉汤培养物为7.32亿个/ml)，每组每只灌服1ml，同时腹腔注射1ml。攻毒后连续观察10天，每天观察2次，记录免疫组和未免疫组鸡的症状表现，且免疫组攻毒后前7天每天解剖1只鸡，未免疫组攻毒后前3天每天解剖1只鸡，剩余鸡第10天观察症状表现并全部进行剖检。
2结果2.1免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果详见表1，其规律性详见曲线图1。
表1免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果单位％
2.2免疫组和未免疫组免疫抗体水平测定结果鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗免疫组和未免疫组免疫抗体效价测定结果详见表2，其规律性详见曲线图2。
表2免疫组和未免疫组免疫抗体效价测定结果单位log2
2.3免疫攻毒保护试验结果用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗首免后，分别于第16天和第28天对免疫组和未免疫组鸡群进行攻毒。首免后第16天，免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变；首免后第28天，免疫攻毒组有4/10鸡只出现拉稀症状和剖检病变，剖检可见脾脏和肠道轻微病变。而未免疫攻毒组攻毒后10多小时，多数鸡只开始出现典型拉稀症状，重者为脓血便。据统计，未免疫攻毒组于首免后第16天，攻毒后1～7天有3/6鸡只出现典型拉稀症状，3/6出现典型剖检病变，主要病变为脾淤血肿大和肠道出血等；首免后第28天，未免疫攻毒组有5/6鸡只出现典型拉稀症状和剖检病变。总之，免疫攻毒组与未免疫攻毒组相比，免疫攻毒组发病率低，免疫保护率高，剖检病变少而轻，症状和剖检病变阳性率均明显低于未免疫攻毒组。有关症状和剖检病变阳性率统计结果详见表3和表4。
表3攻毒鸡症状阳性率及免疫保护指数单位只，％
注表3中分母为观察只数，分子为观察到相应症状的只数。
免疫保护指数计算公式PI＝(攻毒对照阳性率—免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。
表4攻毒鸡剖检病变病变阳性率及免疫保护指数单位只，％
注表4中分母为观察只数，分子为观察到相应病变的只数。
免疫保护指数计算公式PI＝(攻毒对照阳性率—免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。
3讨论与小结3.1鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗对细胞免疫功能的影响
E-花环形成率测定结果图表显示铝胶苗一免后E-花环形成率第3周上升至高峰，达24.8±1.80％，第4周下降至23.6±0.60％；从E-花环形成率图表1中还以可看出，铝胶苗二免后第2周上升至高峰，达28.9±0.38％，比一免后高峰(24.8±1.80％)高出4.1％，第4周开始缓慢下降，至第9周下降至24±2.04％；铝胶苗三免后2周E-花环形成率达到高峰，为30.40±1.92％。由此可见，动物加强免疫后可显著提高E-花环形成率，且维持时间更长。此外，由E-花环形成率测定结果图表还可以看出免疫组E-花环形成率均明显高于同时期的未免疫组，由此说明铝胶苗可显著提高机体的细胞免疫功能。从试验数据还发现，未免疫组鸡随年龄增长E-花环形成率不断升高，由雏鸡到青年鸡，其E-花环形成率为17.9±3.53％～25.04±1.40％。尽管如此，未免疫组E-花环形成率总是明显低于同时期的免疫组，这更进一步证明了该疫苗具有促进动物机体细胞免疫的作用。
3.2鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗对体液免疫功能的影响免疫抗体水平测定结果图表显示铝胶苗一免后第3周，免疫组免疫抗体效价上升至高峰，达11.7±0.43log2，第4周开始下降。铝胶苗二免后第1周抗体效价已上升到12.3±0.43log2，二免后第2周抗体上升至高峰，达13.0±0.63log2，比一免后高峰(11.7±0.43log2)高出1.3log2，第8周开始缓慢下降，至第9周下降至12.0±0log2；铝胶苗三免后第1周上升至高峰，达13.5±0.50log2，比一免后高峰和二免后高峰分别高出1.8log2和0.5log2。铝胶苗三免后连续测定第1～4周数值，免疫抗体效价一直保持较高水平(13.5±0.50log2)不变。由此可见，动物加强免疫后可显著提高免疫抗体效价水平，且维持时间更长。未免疫组(普通鸡)抗体效价水平始终维持在8log2左右，而未免疫组(SPF鸡)的三次免疫抗体效价测定值均为0，这说明未免疫组鸡(普通鸡)幼龄时曾有鸡鲍氏志贺氏菌的隐性感染。尽管如此，但仍可看出铝胶苗每次免疫后，免疫组的免疫抗体效价水平均明显高于未免疫组鸡(普通鸡)的隐性感染抗体水平达3.7～5.5log2。总之，免疫抗体效价检测结果显示免疫组免疫抗体效价明显高于同时期未免疫组，说明铝胶苗可显著提高机体的体液免疫功能。测得SPF鸡的抗体效价三次均为0，表明该鸡符合试验标准要求未曾感染志贺氏菌，同时进一步证明本试验测得的各组抗体效价数据准确可靠。
由上述可知，免疫组三次免疫后的细胞免疫水平和体液免疫水平均显著高于未免疫组，且动物免疫后同期内的E-花环形成率和免疫抗体效价水平呈现正相关，可见鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶疫苗既可提高机体的细胞免疫功能，同时也可提高机体的体液免疫功能，对有效预防鸡鲍氏志贺氏菌的感染可发挥高度特异性的免疫作用。此外，发现首免产生免疫力速度较慢，且维持时间较短；二免产生免疫力明显高于首免，且维持时间较长；三免产生免疫力明显高于二免。因此，为了使动物机体产生较高的免疫力，在使用鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗进行首免的基础上，必须加强免疫接种。
3.3鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶苗的免疫保护作用本研究免疫攻毒试验证明未免疫组于首免后16天和28天进行攻毒，短时间内多数鸡只(3/6～5/6)出现了典型的拉稀症状，重者脓血便，剖检可见典型的脾脏淤血肿大和肠道出血等病理变化；而免疫组首免后16天进行攻毒，仅有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变，与未免疫组相比，首免后16天临床免疫保护指数可达80％；首免后28天进行攻毒，随着免疫时间的延长，尽管免疫组免疫力有所下降，但是免疫组攻毒后仅有4/10鸡只出现拉稀症状和剖检病变，与未免疫组相比，首免后28天临床免疫保护指数仍可达51.8％。由此表明，鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶疫苗对预防该菌的感染起到了显著的免疫保护作用；当鸡群加强免疫接种时，可使其免疫力大大加强，故免疫保护率可达90％以上。
实施例四鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶疫苗的研究——免疫功能及免疫保护力的测定1材料与方法1.1试验地点、时间同实施例一。
1.2实验动物1.2.1动物来源及饲养管理同实施例一。
1.2.2动物分组 免疫组为30只23日龄雏鸡，首次免疫用鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗，每只胸肌注射1ml。首免后第4周二免，二免后第九周三免，均为鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗，每次每只胸肌注射2ml。未免疫组分为固始鸡18只，SPF鸡10只，均未接种鸡痢疾志贺氏菌灭活疫苗。
1.3疫苗鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗由发明人研制(批号030420)。
1.4待测样品的采集和处理同实施例一。
1.5主要药品试剂和仪器设备1.5.1 E-花环形成试验所需试剂同实施例一。
1.5.2 E-花环形成试验所需仪器同实施例一。
1.5.3免疫抗体测定所需主要试剂 鸡痢疾志贺氏菌微量凝集监测抗原，由河南农业大学工程楼1108微生物重点实验室制备，菌种由该室分离保存。痢疾志贺氏菌标准阳性血清(批号040401)，由兰州生物制品研究所生产；阴性血清用SPF鸡制备；0.5％石炭酸灭菌生理盐水自备。
1.5.4免疫抗体测定所需主要仪器设备同实施例一。
1.6 E-玫瑰花环形成试验简称“E-花环试验”，操作方法同实施例一。
1.7微量平板凝集试验以鸡痢疾志贺氏菌代替鸡鲍氏志贺氏菌进行试验，试验方法及结果判定方法同实施例一。
1.8免疫攻毒保护试验在首免后第16天、第28天，用分离的鸡痢疾志贺氏菌接种于1％葡萄糖肉汤中，经37℃ 24h培养，对免疫组和未免疫组进行攻毒，同时对细菌肉汤培养物进行计数(首免后第16天攻毒鸡痢疾志贺菌肉汤培养物为5.49×106/ml，首免后第28天攻毒鸡痢疾志贺菌肉汤培养物为3.28×107/ml)，每组每只灌服1ml，同时腹腔注射1ml。攻毒后连续观察10天，每天观察2次，记录免疫组和未免疫组鸡的症状表现，且免疫组攻毒后前7天每天解剖1只鸡，未免疫组攻毒后前3天每天解剖1只鸡，剩余鸡只第10天观察症状表现并全部进行剖检。
2结果2.1免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果详见表5，其规律性详见曲线图3。
表5免疫组和未免疫组E-花环形成率测定结果单位％
2.2免疫组和未免疫组免疫抗体水平测定结果鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗免疫组和未免疫组免疫抗体效价测定结果详见表6，其规律性详见曲线图4。
表6免疫组和未免疫组抗体效价测定结果单位log2
2.3免疫攻毒保护试验结果用鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗首免后，分别于第16天和第28天对免疫组和未免疫组鸡群进行攻毒。首免后第16天，免疫攻毒组有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变；首免后第28天，免疫攻毒组有4/10鸡只出现拉稀症状和剖检病变，剖检可见脾脏和肠道轻微病变。而未免疫攻毒组攻毒后10多小时，多数鸡只开始出现典型拉稀症状，重者为脓血便。据统计，未免疫攻毒组于首免后第16天，攻毒后1～7天有4/6鸡只出现典型拉稀症状，5/6出现典型剖检病变，主要病变为脾淤血肿大和肠道出血等；首免后第28天，未免疫攻毒组有5/6鸡只出现典型拉稀症状和剖检病变。总之，免疫攻毒组与未免疫攻毒组相比，免疫攻毒组发病率低，免疫保护率高，剖检病变少而轻，症状和剖检病变阳性率均明显低于未免疫攻毒组。有关症状和剖检病变阳性率统计结果详见表7和表8。
表7攻毒鸡症状阳性率及免疫保护指数单位只，％
注表7中分母为观察只数，分子为观察到相应症状的只数。
免疫保护指数计算公式PI＝(攻毒对照阳性率-免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。
表8攻毒鸡剖检病变阳性率及免疫保护指数单位只，％
注表8中分母为观察只数，分子为观察到相应剖检病变的只数。
免疫保护指数计算公式PI＝(攻毒对照阳性率-免疫阳性率)/攻毒对照阳性率。
3讨论与小结3.1鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗对细胞免疫功能的影响E-花环形成率测定结果图表显示铝胶苗一免后E-花环形成率第3周上升至高峰，达24.93±3.54％，第4周下降至23.2±2.94％；从E-花环形成率图表中还以可看出，铝胶苗二免后第1周上升至高峰，达29.26±1.19％，比一免后高峰(24.93±3.54％)高出4.33％，第4周开始缓慢下降，至第9周下降至24.05±0.48％；铝胶苗三免后连续测定第1～4周数值，E-花环形成率一直处于上升阶段(26.17±0.56％～29.20±1.17％)。由此可见，动物加强免疫后可显著提高E-花环形成率，且维持时间更长。此外，由E-花环形成率测定结果图表还可以看出免疫组E-花环形成率均明显高于同时期的未免疫组，由此说明铝胶苗可显著提高机体的细胞免疫功能。从试验数据还发现，未免疫组鸡随年龄增长E-花环形成率不断升高，由雏鸡到青年鸡，其E-花环形成率为17.9±3.53％～25.04±1.40％。尽管如此，未免疫组E-花环形成率总是明显低于同时期的免疫组，这更进一步证明了该疫苗具有促进动物机体细胞免疫的作用。
3.2鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗对体液免疫功能的影响免疫抗体水平测定结果图表显示铝胶苗一免后第3周，免疫组免疫抗体效价上升至高峰，达11.5±0.49log2，第4周开始下降；从免疫抗体水平测定结果图表2中还可以看出，铝胶苗二免后第3周抗体上升至高峰，达12.5±0.43log2，比一免后高峰(11.5±0.49log2)高出1.0log2，第7周开始缓慢下降，至第9周下降至11.7±0.83log2；铝胶苗三免后第1周上升至高峰，达13±0.43log2，比一免后高峰和二免后高峰分别高出1.5log2和0.5log2。铝胶苗三免后连续测定第1～4周数值，免疫抗体效价一直处于较高水平(13±0.43log2～13±0.70log2)。由此可见，动物加强免疫后可显著提高免疫抗体效价水平，且维持时间更长。未免疫组(普通鸡)抗体效价水平始终维持在8log2左右，而未免疫组(SPF鸡)的三次免疫抗体效价测定值均为0，这说明未免疫组鸡(普通鸡)幼龄时曾有痢疾志贺氏菌的隐性感染。尽管如此，但仍可看出铝胶苗每次免疫后，免疫组的免疫抗体效价水平均明显高于未免疫组鸡(普通鸡)的隐性感染抗体水平达3～5log2。总之，免疫抗体效价检测结果显示免疫组免疫抗体效价明显高于同时期未免疫组，说明铝胶苗可显著提高机体的体液免疫功能。测得SPF鸡的抗体效价三次均为0，表明该鸡符合试验标准要求未曾感染志贺氏菌，同时进一步证明本试验测得的各组抗体效价数据准确可靠。
利用双因素无重复数据方差分析可知铝胶苗一免与二免、二免与三免差异显著(P＜0.05)。由上述可知，免疫组三次免疫后的细胞免疫水平和体液免疫水平均显著高于未免疫组，且动物免疫后同期内的E-花环形成率和免疫抗体效价水平呈现正相关，可见鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶疫苗既可提高机体的细胞免疫功能，同时也可提高机体的体液免疫功能，对有效预防鸡痢疾志贺氏菌的感染可发挥高度特异性的免疫作用。此外，发现首免产生免疫力速度较慢，且维持时间较短；二免产生免疫力明显高于首免，且维持时间较长；三免产生免疫力明显高于二免。因此，为了使动物机体产生较高的免疫力，在使用鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗进行首免的基础上，必须加强免疫接种。
有关文献指出氢氧化铝佐剂的作用是把免疫原吸附于其分子表面，由于铝胶佐剂进入机体后吸收缓慢，故当疫苗注射后在肌肉组织中短期内形成了疫苗免疫原储藏库，使免疫原缓慢释放出来，不断刺激机体产生抗体和多种细胞因子，使机体在一定时间内保持较高的免疫力。由此证明，研制的鸡鲍氏、鸡痢疾志贺氏菌灭活苗加入佐剂氢氧化铝或明矾是非常必要的。
3.3鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶苗的免疫保护作用本研究免疫攻毒试验证明未免疫组于首免后16天和28天进行攻毒，短时间内多数鸡只(4/6～5/6)出现了典型的拉稀症状，重者脓血便，剖检可见典型的脾脏淤血肿大和肠道出血等病理变化；而免疫组首免后16天进行攻毒，仅有1/10鸡只出现轻微腹泻症状和剖检病变，与未免疫组相比，首免后16天临床免疫保护指数可达85.1％；首免后28天进行攻毒，随着免疫时间的延长，尽管免疫组免疫力有所下降，但是免疫组攻毒后仅有4/10鸡只出现拉稀症状和剖检病变，与未免疫组相比，首免后28天临床免疫保护指数仍可达51.8％。由此表明，鸡痢疾志贺氏菌灭活铝胶疫苗对预防该菌的感染起到了显著的免疫保护作用。当鸡群加强免疫接种时，可使其免疫力大大加强，故免疫保护率可达90％以上。事实上有关胶油苗的免疫攻毒结果也证实了这一点(具体内容详见另一专利材料“鸡志贺氏菌灭活油乳苗及其研制”)。用铝胶苗作首免，油乳苗作二免，与首免、二免均用铝胶苗二免后21天的抗体效价几乎相等，前者为12log2，后者为12.5±0.43log2。由于胶油苗二免后21天攻毒，免疫保护率可达90％，所以胶胶苗二免后若21天攻毒，则免疫保护率可达90％以上，但二者相比用油苗进行二免的免疫保护期较长。
权利要求
1.一种鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗，其特征是含有有效剂量的灭活鸡志贺氏菌和兽医学上可接受的佐剂。
2.根据权利要求1所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗，其特征是所述的佐剂为氢氧化铝胶或明矾。
3.根据权利要求1所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗，其特征是所述的灭活鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌，或为鸡鲍氏志贺氏菌，或为鸡福氏志贺氏菌，或为鸡宋内氏志贺氏菌中的任一种灭活菌。
4.根据权利要求1所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗，其特征是所述的疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5.6～8.33亿/ml。
5.一种鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)菌种传代和复壮将纯化的鸡志贺氏菌接入1％葡萄糖肉汤中，在37±0.5℃条件下培养24～30h，然后用血液平板培养复壮；(2)细菌接种和扩大培养将复壮的鸡志贺氏菌接种1％葡萄糖肉汤进行一代培养，然后将一代培养物用1％葡萄糖肉汤进行扩大培养，用灭菌棉球蘸取培养好的鸡志贺氏菌菌液，均匀涂抹于SS琼脂平板上，置37±0.5℃培养24～30h；(3)收集细菌在长满志贺氏菌菌苔的SS平板上，每平板倾入3～5ml 0.85％灭菌生理盐水，刮取SS平板上的志贺氏菌菌苔，然后将菌液移入无菌瓶中；(4)细菌计数和浓度调整将1％葡萄糖肉汤的细菌扩大培养物进行活菌计数，并用SS平板上刮取的志贺氏菌菌液对肉汤培养物进行细菌浓度调整，调整菌数为7～10亿/ml；(5)细菌灭活向调整好细菌浓度的1％葡萄糖肉汤细菌培养物中加入甲醛进行灭活，摇匀，使甲醛的最终浓度为0.5％，37±0.5℃条件下作用24～30h；(6)加入佐剂向制备好的细菌灭活肉汤加入氢氧化铝胶，肉汤与氢氧化铝胶的体积比为4～5∶1，混合均匀后制成鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗。
6.根据权利要求5所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗的制备方法，其特征是所述的疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5.6～8.33亿/ml。
7.根据权利要求5所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗的制备方法，其特征是所述的鸡志贺氏菌为鸡痢疾志贺氏菌，或为鸡鲍氏志贺氏菌，或为鸡福氏志贺氏菌，或为鸡宋内氏志贺氏菌中的任一种。
8.权利要求1所述的鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗在预防鸡志贺氏菌感染方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种兽用生物制品及其研制方法，特别是涉及一种鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗及其研制方法。鸡志贺氏菌灭活铝胶疫苗是利用鸡志贺氏菌经菌种传代、大量培养、调整浓度、灭活、按适当比例加入佐剂制备而成，疫苗中含灭活鸡志贺氏菌数为5.6～8.33亿/ml。经测定，免疫鸡的细胞免疫和体液免疫水平显著提高，首免后免疫保护率达85.1％，二免后免疫保护率可达90％以上；免疫接种可使鸡产生较高的免疫力，并获得坚强的免疫保护作用，从而达到有效预防鸡志贺氏菌感染的目的；本发明疫苗具有性能稳定、易保存、无毒、无污染等优点；鸡免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高，简便易行等特点；本发明产品对有效预防和控制鸡志贺氏菌感染，可产生显著的经济和社会效益。
文档编号A61P31/04GK1887348SQ200610018018
公开日2007年1月3日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者许兰菊, 王川庆, 张改平 申请人:河南农业大学