用于修复骨折的补充的基质的制作方法

专利名称：：用于修复骨折的补充的基质的制作方法
技术领域：
：本申请涉及补充的基质(supplementedmatrices)和其用于#~复和治愈骨折的用途。
背景技术：
：在欧洲和美国，估计每年由于外伤、运动或者活动相关的损伤或者骨质疏松而有5到6百万人遭受骨折。这些损伤的多数可以用手工复位或者外部固定(例如，模型)治疗。然而约20到25%的骨折需要住院，通常使用开放外科手术程序。将骨折定义为皮质骨结构中的不连续性，通常由过度的机械力导致。完全的骨折定义为在整个骨结构中发生的不连续性或者断裂，从而产生两个或者多个分离的骨段。对于分类为骨折的损伤，骨段不必分离。在一些情况中，骨膜将骨段保持在它们最初的解剖位置。在其他情况中，骨折导致肢弯曲，从而撕裂骨膜或者甚至周围的皮肤和肌肉组织。在其他情况中，如高速飞弹损伤或者严重事故的情况中常见的，大部分的骨断裂或者甚至从它的最初位置移去。骨折治疗的主要目的是充分愈合和恢复骨功能而不发生变形。由于残疾问题和成本约束，快速得到这些目标成为越来越重要的问题。在相当大部分患者群体中，两个目标，即充分愈合和骨功能的快速恢复由于患者的年龄和/或一般健康状况和/或骨折的类型和/或位置而处于危险中。具体地，对于骨质疏松患者，不愈合和增加的治愈时间的危险是高的。作为骨骼疾病，骨质疏松的特征是低骨量和骨组织的结构退化，从而导致骨脆性增加、治愈时间延长和发生不愈合。骨移植物和骨移植物代用品广泛用于许多矫形外科手术中治疗与骨丢失、延迟的愈合和不愈合骨折有关的问题或者用作植入物固定材料。在严重和复杂骨折的情况中，骨移植物和骨移植物代用品用于增强骨，然后用硬件稳定骨折。骨移植材料可以是自体的、同种异体的、异种的、合成来源的脱矿质骨基质(DBM)和它们的混合物。可以将骨移植材料分类成具有骨传导(osteoconductive)、骨诱导和骨发生性质的材料。骨传导材料不产生骨；相反，它们刺激附近活的骨细胞迁移到材料中。骨诱导材料刺激患者自身的系统产生骨组织。骨发生材料直接产生骨组织。骨发生材料局限于产生骨组织的成骨细胞和间充质干细胞。此类材料显示出超过一种所述的性质。自体移植物指从患者身体的一部分收获的将在损伤部位使用的任何组织或者骨。通常从髂峰收获骨自体移植物。尽管它们的优点为是生物相容的、安全的、具有血管化组成并且显示出骨诱导性质，但是缺点是主要的。自体移植物需要第二次手术，其可以导致手术后并发症，包括失血、感染和疼痛。自体移植物由于更长的住院期和手术时间而是昂贵的。每名患者的自体移植物的供应是有限的，并且收获自体材料后手术后疼痛通常比骨折自身更高。尽管有这些缺点，但是认为自体移植物在骨移植材料方面是"金标准"。同种异体移植物为从人尸体的各个位置取出的骨组织，其可以用机器制造成不同的结构和不同的形状。同种异体移植物是最低程度骨诱导性的，仅仅有有限的供应，并且它们由于宿主病原体而给患者造成感染的危险。合成的骨移植材料被开发为自体骨移植材料的"现货供应"备选物。合成的骨移植物代用品包括陶瓷材料和模拟人骨性质的自定形(self-setting)聚合物，如羟基磷灰石和聚曱基丙烯酸甲酯、胶原、磷酸三钙、硫酸钓和磷酸钓。这些材料显示出弱的处理性质和缺少骨诱导性质。近年来，已经努力开发骨移植物代用品，其显示出作为自体移植物的真实的"现货供应备选物"的骨诱导性质。DBM是骨诱导性骨移植物代用品的一个实例。然而，DBM作为同种异体材料面临着如同种异体骨那样相同的缺点。其他实例是StrykerCorp.的OP-1,其递送来自胶原基质的重组产生的骨形态发生蛋白7(BMP7)，或者使用来自胶原海绵的重组产生的BMP2的MedtronicSofamorDanek的INFUSE②骨移植物代用品材料。除了BMP的昂贵和时间长的生产方法外，两种产品中的蛋白质都以高浓度从胶原基质递送。牛来源的胶原基质具有异种材料的所有危险，在外科手术程序中显示出弱的处理性质，例如，它们不是可塑的以紧密地适合损伤部位的形状，并且递送到身体的高浓度的BMP可以在一些患者中导致器官的钙化或者在身体其他部位中的骨形成。用于骨缺陷的局部处理的其他基质包括使用人甲状旁腺素(PTH)或者其衍生物，其作为注射剂原位递送到身体中，从而形成血纤蛋白封闭剂组合物。曱状旁腺素是84个氨基酸的肽，其由曱状旁腺制备和分泌。全长激素用于调节全身钙水平和骨更新。曱状旁腺素是前体成骨细胞的有效的直接合成代谢因子和破骨细胞的间接的合成代谢因子。通过调节成骨细胞和破骨细胞的平衡，曱状旁腺素对所得的骨更新和随后释放钙到身体中具有直接作用。许多动物研究已经指出曱状旁腺素对骨矿物质密度(BMD)具有潜在的合成代谢作用。甲状旁腺素通过结合细胞表面受体而作用于细胞。已知该受体在成骨细胞上发现，成骨细胞是负责形成新骨的细胞。已经报导人甲状旁腺素的N-末端34个氨基酸结构域在生物学上等同于全长激素。曱状旁腺素1-34和其作用方式首次在美国专利号4,086,196中报导。已知曱状旁腺素34是曱状旁腺素的完全活性的截短形式，其不具有二硫键或者显著的三级结构。它含有适度的二级结构，包括几个ot螺旋。许多临床研究已经用全身施用的曱状旁腺素进行以增加骨质疏松患者中的总体骨量，其中多数需要每天注射仅曱状旁腺素或者曱状旁腺素卜34，或者组合其他活性剂，维持许多月。关于PTH和曱状旁腺素1-34的更多细节描述于WOO3/052091,将其各自的内容引入本文作为参考。曱状旁腺素的具有生物学活性的其他截短的形式包括曱状旁腺素1-25、1-31和1-38。尽管已经进行了许多工作来研究PTH的全身作用，但是PTH的局部施用;f艮少有研究。WO03/052091描述了用于PTH的局部施用的基质。具体地，WO03/052091描述了曱状旁腺素共价附着到合成的和天然基质，尤其血纤蛋白或者聚乙二醇基质，以用于局部施用和以受控的方式在需要的部位释放。然而，WO03/052091没有描述适于治愈骨折，尤其用于严重骨折，如处于变得延迟愈合或者不愈合危险的骨折修复的基质。因此，本发明的目的是提供适于骨折的局部修复的基质。发明概述已经令人惊奇地发现含有PTH的基质("补充的基质")可以用于将PTH局部递送到骨折部位以1务复和治愈骨折。从而，本发明涉及制剂，其包含(i)选自PTH和PTH融合肽的肽；(ii)包含钓矿物质的粒状材料和(iii)能够在生理条件下形成血纤蛋白基质的组合物，其包含血纤蛋白原前体组分和凝血酶前体组分，其中PTH或者PTH融合肽以0.01到2mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分的浓度存在，附带条件是不包括0.4mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分的浓度。本发明还涉及补充的基质，其包含(i)PTH或者PTH融合肽；(ii)包含钙矿物质的粒状材料和(iii)血纤蛋白；其中所述PTH或者PTH融合肽以0.01到2mg/mL血纤蛋白基质的浓度存在，附带条件是不包括0.4mg/mL血纤蛋白基质的浓度。本发明还涉及所述制剂和补充的基质用于生产局部施用以修复骨折的药物的用途。优选地，将PTH可释放地掺入基质中并且将补充的基质在骨折部位应用或者成形。优选地，PTH共价结合到基质。在一个实施方案中，基质是血纤蛋白基质。曱状旁腺素可以是PTHw4(天然的)、PTH138、PTH134、PTH^或PTH125，或者PTH的显示出类似于前面的("PTH")的性质即骨形成的任何经修饰的形式或者等位基因形式。PTH优选为PTHw4。在优选实施方案中，PTH是含有至少两个结构域的融合肽("PTH融合肽")，其中第一个结构域包含PTH并且第二个结构域包含可共价交联的底物结构域，所述底物结构域在基质形成期间或者之后交联到基质。在一个实施方案中，从制剂形成补充的血纤蛋白基质，该制剂包含(i)粒状材料，(ii)适于形成含有血纤蛋白原和凝血酶的血纤蛋白基质的组合物和(iii)0.01到2mgPTH/ml血纤蛋白基质范围的PTH，其适于修复和愈合骨折，附带条件是不包括0.4mgPTH/mL血纤蛋白基质的浓度。还提供了包含上述制剂的试剂盒，其中至少一种适于形成基质的组分与用于形成基质的其他组分分开保存。制剂和补充的基质优选用于修复和愈合骨折，尤其用于具有变得延迟愈合或者不愈合的危险的骨折。优选的适应症包括腕骨折(桡骨远端骨折)，长骨骨折，如胫骨骨折和髋骨折。附图简述图1显示了PTH变体的生物活性。将用连接到PTH受体的启动子的报道基因转染的细胞用等量的PTHw4、TG-pl-PTHw4(下文描述)或者国际上的84个氨基酸的标准PTH处理。测量安光素酶报道基因表达的抑制并与不暴露于溶液中PTH的转染的细胞(对照)比较。图2显示了血纤蛋白基质的PTH释放测定的结果。图3显示了在用补充的基质处理后，节段胫骨缺陷的稳定性测试的结果，表示为愈合得分。图4显示了在用补充的基质处理后，节段胫骨缺陷的稳定性测试的结果，表示为剩余的不稳定关节的百分数。发明详述本文描述了补充的基质，其包含可释放地掺入其中的PTH,任选含有粒状材料。PTH通过与基质共价连接或者通过与基质和/或颗粒的非共价相互作用掺入。这些补充的基质与自体移植物相比缩短愈合的时间或者触发否则不会愈合的骨折的愈合。基质是生物相容的和生物可降解的并且可以在在体外或者植入时在体内形成。PTH可以掺入到基质中，完全保持其生物活性。PTH可以可释放地掺入，其中使用提供对PTH使用该基质作为控释载体怎样、何时和多大程度释放的控制的技术，以愈合骨折。定义如本文一般使用的"粘着位点或者细胞附着位点"指肽序列，细胞表面上的分子，例如，粘着促进受体与所述肽序列结合。粘着位点的实例包括但不限于，纤连蛋白的RGD序列和层粘连蛋白的YIGSR(SEQIDNO:l)序列。粘着位点可以任选地通过包括可交联到血纤蛋白基质的底物结构域掺入到基质中。如本文一般使用的"生物学活性"指目的蛋白介导的功能事件。在一些实施方案中，这包括通过测量多肽与另一种多肽相互作用测定的事件。它还包括测定目的蛋白质对细胞生长、分化、死亡、迁移、粘着、与其他蛋白质相互作用、酶促活性、蛋白质磷酸化或者去磷酸化、转录或者翻译的作用。本文使用的"骨折"指横过整个骨结构的不连续性或者断裂，从而产生两个或更多个分离的骨段。如本文一般使用的"钩矿物质"指天然存在的含有钙离子的同质物质。钙矿物质的实例是羟基磷灰石(Cas[(OH)(P04)3])，其是牙和骨的主要组分。如本文一般使用的"交联"指形成共价键。如本文一般使用的"延迟愈合"指在3-4个月内，即认为足够正常骨愈合的时间间隔内不愈合的骨折。延迟愈合表明没有额外的外科手术或者非外科手术介入时，愈合是緩慢的但是将最终发生。然而，在一些情况中，延迟愈合在后来的时间点发展到不愈合。如本文一般使用的"血纤蛋白基质"指一种方法的产物，在该方法中，基本上所有前体组分、血纤蛋白原和凝血酶在钙源和因子XIIIa存在下交联以形成三维网络。如本文一般使用的"基质"指材料，取决于该材料，其意欲与生物学系统永久或者暂时面接以治疗、增加或者替换任意组织或者该组织的功能。基质可以作为掺入其中的PTH的递送装置和/或作为细胞向内生长基质。本文描述的基质从液体前体组分形成，该组分能够在身体中需要的部位形成支架。术语"基质"、"凝胶"或者生物材料在本文可作为同义词使用。术语"基质"和"凝胶"指将前体组分混合在一起后形成的组合物。从而，术语"基质"和"凝胶"包括部分或者完全交联的聚合物网络。它们可以为液体、半固体如糊剂或者固体的形式。取决于前体材料的类型，基质可以用水膨胀但是不溶解在水中，即形成水凝胶，其在身体中保持特定时间段。如本文一般使用的"天然存在的前体组分或者聚合物"指可以在自然界中发现的分子。如本文一般使用的"不愈合"指在损伤后3到6个月(取决于骨折的类型和位置)内在每月的放射显影研究中不显示出骨折愈合的进展的骨折。如本文使用的"PTH"包括PTH^84的人序列，和PTH的所有截短、修饰和等位基因形式，它们尤其当掺入，优选共价结合到血纤蛋白基质时显示出骨形成性质。PTH的优选的截短形式是PTHws、PTH134、PTH131或PTH125。最优选的是PTH134。优选地，PTH是人PTH，尽管来自其他来源的PTH，如牛PTH可以是合适的。如本文一般使用的"PTH融合肽"指含有至少第一个和第二个结构域的肽。一个结构域含有PTH，优选PTHw4,而另一个结构域含有底物结构域，其在血纤蛋白基质形成期间或者之后可交联到血纤蛋白基质。在第一个和第二个结构域之间也可以存在酶促或者水解降解位点。本文使用的"骨膜"指形成致密的纤维层的骨的外层，形成关节结构的那些部分除外，所述关节结构覆盖整个骨结构并且含有滋养外部骨组织的脉管系统。如本文一般使用的"生理的"指可以在活的脊推动物中发现的条件。具体地，生理条件指人体中的条件，如温度和pH。生理温度具体指351C到42X:之间的温度范围，优选约371C。如本文一般使用的"骨折的修复或者愈合"指断裂骨的末端的再结合和再对齐。如本文一般使用的"补充的基质"或者生物材料指具有掺入的PTH的基质。I.补充的基质A.基质材料对于组织修复或者再生，细胞必须迁移到伤口床、增殖、表达基质组分或者形成细胞外基质，和形成最终的组织形状。多种细胞群体必须通常参与该形态发生应答，通常包括血管和神经细胞。已经证明基质极大地增强组织修复或者再生，并且在一些情况中发现是组织修复或者再生所必需的。已经进行了从天然或者合成来源或者两者混合物开发基质的方法。已经发现在WO03/052091中描述的血纤蛋白基质是修复骨折的合适的基质材料。通过前体分子的离子、共价交联或者它们的组合和/或通过膨胀一种或多种聚合物材料，即基质，来形成基质，以形成聚合物网络，其具有足够的聚合物间空间以允许向内生长或者迁移到细胞的基质中。在一个实施方案中，基质由蛋白质形成，优选由基质所植入的患者中的天然存在的蛋白质形成。尤其优选的基质蛋白是血纤蛋白，尽管也可以使用由其他蛋白质，如胶原或者明胶制成的基质。多糖和糖蛋白也可以用于形成基质。血纤蛋白基质血纤蛋白是已经对几种生物医学应用报导的天然材料。由血纤蛋白制造的基质已经在Hubbell等人的美国专利号6,331，422中描述为细胞向内生长基质的材料。因为它能够结合到许多组织和它在伤口愈合中的天然作用，血纤蛋白已经用于封闭剂中。一些具体应用包括用作血管移植物附着、心脏瓣膜附着的封闭剂。此外，这些基质已经用作药物递送装置，并且用于神经元再生。尽管血纤蛋白基质提供了组织再生和细胞向内生长的固体支持物，但是在单体中只有少数活性序列直接增强这些过程。血纤蛋白原聚合成血纤蛋白的过程也已经被表征。最初，蛋白酶在两个对称位点切割二聚体血纤蛋白原分子。有几种可能的蛋白酶可以切割血纤蛋白原，包括凝血酶、肽酶和蛋白酶III,且每种在不同的位点切断该蛋白质。一旦血纤蛋白原被切割，就发生本体聚合步骤，其中血纤蛋白原单体聚集在一起并形成非共价交联的多聚体凝胶。发生该自身装配是因为在蛋白酶切割发生后，结合位点被暴露。一旦它们暴露，分子中心的这些结合位点就可以结合到血纤蛋白原链上的其他位点，所述其他位点存在于肽链的末端。以这种方式，形成多聚体网络。因子XIIIa、通过凝血酶蛋白酶解从因子XIIIa活化的转谷氨酰胺酶然后可以共价交联该多聚体网络。存在其他转谷氨酰胺酶并且它们也可以参与共价交联和移植到血纤蛋白网络。一旦形成交联的血纤蛋白基质，随后的降解就被严格控制。控制血纤蛋白降解中的关键分子之一是a2-纤溶酶抑制剂。该分子通过因子XIIIa的作用交联到血纤蛋白的oc链起作用。通过将它自身附着到基质，高浓度的抑制剂可以定位于基质。该抑制剂然后通过防止纤溶酶原结合血纤蛋白并灭活纤溶酶而起作用。oc2-纤溶酶抑制剂含有谷氨酰胺底物。确切的序列鉴定为NQEQVSPL(SEQIDNO:2)，第一个谷氨酰胺是用于交联的活性氨基酸。已经证明双结构域肽(其含有因子XIIIa底物序列和生物活性肽序列)可以交联到血纤蛋白基质中并且该生物活性肽在体外保持它的细胞活性。取决于适应症和混合到血纤蛋白基质中的物质，凝血酶的浓度可以改变。在一个优选实施方案中，血纤蛋白基质含有5到65mg/ml血纤蛋白基质，更优选15到60mg/ml血纤蛋白基质，甚至更优选25到55mg/ml血纤蛋白基质，且最优选30到45mg/ml血纤蛋白基质的血纤蛋白原。凝血酶以0.5到5LU./ml血纤蛋白基质的范围，更优选1.25到3.25I.U./ml血纤蛋白基质的范围，最优选1.5到2.5I.U./ml血纤蛋白基质的范围存在。额外的钙离子源帮助形成血纤蛋白基质。钙离子源优选为CaCl2*2H20,其浓度为0.5到5mg/ml血纤蛋白基质，甚至更优选浓度为2到3.5mg/ml血纤蛋白基质，最优选浓度为2.5到3mg/ml血纤蛋白基质。该组合物不考虑混合到血纤蛋白基质前用于润湿任何潜在颗粒的水，因为所述水在基质形成的整个过程中都保持在颗粒的孔中并从而对血纤蛋白基质中血纤蛋白原和凝血酶浓度没有任何稀释作用。I.U.代表凝血酶的一个国际单位并且定义为在0.0853mg的第一种国际标准的人凝血酶(FirstInternationalStandardofHumanThrombin)中所含的活性。形成血纤蛋白基质的前体组分优选从可以为溶液形式的两种前体组分形成血纤蛋白基质。第一种前体组分通常为溶液的形式，含有血纤蛋白原，优选浓度为10到130mg血纤蛋白原/ml前体溶液，更优选为30到120mg血纤蛋白原/ml前体溶液，甚至更优选50到llOmg血纤蛋白原/ml前体溶液，且最优选60到90血纤蛋白原/ml前体溶液。如果必须加入凝血酶以形成基质，那么第二种前体组分，也通常为溶液形式，含有凝血酶，其浓度优选为1到101.U.凝血酶/ml前体溶液，更优选2.5到6.5I.U.凝血酶/ml前体溶液，最优选3到5LU.凝血酶/ml前体溶液。此外，钩离子源为前体溶液之一。钙离子源优选为CaCl2*2H20，其浓度为1到10mg/ml前体溶液，甚至更优选4到7mg/ml前体溶液，最优选5到6mg/ml前体溶液。任选地，向前体溶液中加入能够催化基质形成的酶，如因子XIIIa。优选地，因子XIIIa以0.5到100I.U./ml前体溶液，更优选1到60I.U./ml前体溶液，且最优选1到10I.U./ml前体溶液的浓度存在。B.细胞附着位点细胞通过细胞表面的蛋白质-蛋白质、蛋白质-寡糖和蛋白质-多糖相互作用与它们的环境相互作用。细胞外基质蛋白为细胞提供了许多生物活性信号。需要该致密网络来支持细胞，并且已经表明基质中的许多蛋白质控制细胞粘着、铺展、迁移和分化。已经表明尤其有活性的一些特定蛋白质包括层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、血纤蛋白、血纤蛋白原和胶原。已经进行了层粘连蛋白的许多研究，并且血管发生中起重要作用。已经i定了直接^细胞受体相互作用并且导致粘着、铺展或者信号转导的一些特定的序列。已显示一种大的多结构域蛋白层粘连蛋白由具有几个受体结合结构域的三条链组成。这些受体结合结构域包括层粘连蛋白Bl链的YIGSR(SEQIDNO:l)序列、层粘连蛋白A链的LRGDN(SEQIDNO:3)和层粘连蛋白Bl链的PDGSR(SEQIDNO:4)。也已经鉴定了细胞的几个其他的识别序列。这些识别序列包括层粘连蛋白A链的IKVAV(SEQIDNO:5)和层粘连蛋白B2链的序列RNIAEIIKDI(SEQIDNO:6)。尤其优选的是来自纤连蛋白的RGD序列。在进一步优选的实施方案中，将细胞粘着的肽位点，即结合到细胞表面上的粘着促进受体的肽掺入到基质中。此种粘着促进肽包括如上所述的那些。特别优选的是来自纤连蛋白的RGD序列和来自层粘连蛋白的YIGSR(SEQIDNO:l)序列。细胞附着位点可以包括在一些天然基质中。例如，通过将含有半胱氨酸的细胞附着肽与包括缀合的不饱和基团如PEG丙烯酸酯、PEG丙烯酰胺或者PEG乙烯砜的前体分子混合，可以完成掺入。该步骤可以在短时间，例如几分钟内发生，然后与前体组分的包括亲和基团的剩余物，如含有硫羟的前体组分混合。如果细胞附着位点不包括半胱氨酸，那么它可以经化学合成以包括一个半胱氨酸。在该步骤中，粘着促进肽将变得掺入到用缀合的不饱和多重官能化的前体的一个末端中；当向系统中加入剩余的多硫鞋时，将形成交联的网络。共价结合到基质的粘着位点的浓度可以影响细胞渗入的速率。例如，对于给定的水凝胶，RGD浓度范围可以掺入到基质中，其以最佳的方式支持细胞向内生长和细胞迁移。粘着位点如RGD的最佳的浓度范围为0.04到0.05mM,且甚至更优选0.05mM，尤其对于水含量为平衡浓度到水摄取结束后92重量％的基质。c.PTH如本文使用的术语"PTH"包括PTH^4的人序列和PTH的所有截短、修饰和等位基因形式，其当共价结合到生物可降解的天然或者合成的基质时显示出骨形成性质。PTH的优选的截短形式是PTHws、PTH134、PTH131PTH,.28或PTH125。最优选的是PTH134。PTH优选为人PTH，尽管来自其他来源的PTH如牛PTH也是合适的。0.01到2mgPTH/mL基质范围的PTH适于骨折的修复和愈合，附带条件是不包括0.4mgPTH/mL基质的浓度。优选地，PTH的浓度范围为O.l到1.7mg/mL基质，甚至更优选浓度范围为0.3到1.5mg/mL基质，且最优选浓度范围为0.4到1.1mg/mL基质，附带条件是不包括OJmgPTH/mL基质的浓度。在优选实施方案中，基质是血纤蛋白基质。D.PTH融合肽在优选实施方案中，PTH为PTH融合肽，其包含至少两个结构域，其中第一个结构域包含PTH并且第二个结构域包含可交联的底物结构域，所述底物结构域在基质形成期间或者之后可交联到基质。底物结构域是酶的结构域，优选是转谷氨酰胺酶的底物结构域("转谷氨酰胺酶底物结构域")，更优选是组织转谷氨酰胺酶的底物结构域("组织转谷氨酰胺酶底物结构域")，且最优选地，它是因子XIIIa的底物结构域("因子xnia底物结构域")。转谷氨酰胺酶催化蛋白质结合的谷氨酰基残基的y-羧酰胺基团和赖氨酸残基的s-氨基之间的酰基转移反应，从而导致形成n-s-(y-谷氨酰基)赖氨酸异肽侧链桥。PTH融合肽的氨基酸序列可以设计成还含有酶促或者水解切割位点，从而可以释放PTH，其中对一级结构有很小的或者没有修饰。转谷氨酰胺酶底物结构域、且尤其是因子XIIIa底物结构域适于将融合肽连接到天然基质，如血纤蛋白基质。当与血纤蛋白基质一起使用时，融合肽中的降解位点优选为可酶促降解的，从而PTH的释放受到细胞特异性过程，如局部化蛋白酶解的控制。可交联的底物结构域可以包括G^K2)F(SEQIDNO:7)、KKKK(SEQIDNO:8)、YRGD77G^Gg^肌GG(SEQIDNO:9)或W^2M尸丄(SEQIDNO:2)。最优选的因子XIIIa底物结构域具有A^E:gKSP丄(SEQIDNO:2)的氨基酸序列并且在本文中称作"TG"和TG-PTH。通过重组或通过化学合成可以产生PTH融合肽。优选通过化学合成产生PTH1-34融合肽。已经在WO03/052091中详细描述了适于本发明目的的转谷氨酰胺酶底物结构域，包括它们的氨基酸序列，将其各自的内容引入本文作为参考。如本文描绘的，作为优选的实施方案，因子XIIIa底物结构域直接连接到PTHw4或者它可以包括PTH(第一个结构域)和NQEQVSP(SEQIDNO:2)序列(第二个结构域)之间的降解位点。同样地，在凝固期间，PTHw4融合肽可以通过因子XIIIa底物掺入在血纤蛋白内并且作为PTH,.34释放。降解位点允许PTH释放，其中对一级肽序列有很小或者没有修饰，这可以导致该因子的更高的活性。此外，它允许通过细胞特异性过程控制因子的释放。这允许因子在相同材料内以不同速率释放，这取决于细胞在该材料内的位置。这还减少所需的总的PTHw4的量，因为它的释放受到细胞过程的控制。在利用PTH掺入并且优选结合于基质的上述骨缺陷的强烈愈合的一种可能的解释中，认为重要的是PTH在延长的时间段内局部施用(即不仅仅是单次脉冲剂量)但是不以连续方式施用。这通过基质的酶促切割或者水解切割进行緩慢降解来完成。以这种方式，然后将分子通过在持续的时间内发生的假脉沖作用递送。当前成骨细胞渗入基质时，它将遇到PTH分子，该分子将诱导前成骨细胞的进一步增殖以及合成对新骨形成关键的多种生长因子。然而，如果该具体细胞不从基质继续释放结合的PTH,那么它将不会开始产生白细胞介素-6,从而避免以后阶段的对破骨细胞形成的分解代谢作用。净结果是更高的骨矿物质密度和净形成骨基质。最后，肽的治疗作用局限于缺陷区并且不随后扩大。融合肽的降解位点在融合肽的第一个和第二个结构域之间可以存在酶促或者水解降解位点。降解位点可以通过特定酶促降解来降解。这允许PTH的释放被细胞特异性过程如局部化蛋白酶解控制。它允许取决于细胞在材料内的位置，在基质内以不同速率释放PTH。优选地，通过选自纤溶酶和基质金属蛋白酶的酶可切割降解位点。通过小心选择该酶促降解位点的Km和Kcat，可以控制降解在血纤蛋白基质之前或之后发生，和/或通过利用相似或不相似的酶降解基质。这些可降解的位点允许工程改造PTH从血纤蛋白基质的更特异释放。通过侵入基质的细胞释放的酶可以切割可降解的位点。可降解的位点允许在基质内的不同位置的递送速率有变化，这取决于在该位置和/或基质内的细胞活性。额外的益处包括在递送系统内较低的总药物剂量，和释放的空间调节，其允许在最大的细胞活性时释放较大百分比的药物。在本发明上下文中，可降解的位点缩写为"pl"。蛋白酶解可降解的位点包括胶原酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、溶基质蛋白酶或者纤溶酶原激活物的底物。示例性底物在下面列出。Nl-N5表示从发生蛋白酶解的位点朝向蛋白质的氨基末端的氨基酸l-5位。Nl，-N4，表示从发生蛋白酶解的位点朝向蛋白质的羧基末端的氨基酸l-4位。表l:蛋白酶的样品底物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>参考文献1.TakagiandDoolittle，(1975)5zoc//ew.14:5149-5156.2.Sm池etal.，(1995).历o/.C/iem.270:6440-6449.3.Bessonetal.，(1996)爿nflfy"cfl/历oc/ie/w&^v237:216-223.4.4.Netzel腸Arnettetal.，(1991)丄历o/.CAe加,.266:6747-6755.5.Coombsetal.，1998.J.历o/.CAem.273:4323~4328.优选的实施方案是第一个结构域和第二个结构域之间的序列YKNR(SEQ.NO.18)，其使得连接纤溶酶可降解。尤其优选的PTH融合肽是TGpIPTH:NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQIDNO:19)优选的融合蛋白包括TG-PTHw4:这是包含天然PTH的氨基酸1-34以及TG(转谷氨酰胺酶)底物结构域的修饰形式的PTH:NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQIDNO:20)TG-Pl-PTHw4:该形式对应于TG-PTH,只是它额外含有在TG序列和PTHw4之间的纤溶酶可降解的序列(pi):NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQIDNO:19)可以用于蛋白酶解降解的酶是很多的。蛋白酶解可降解的位点可以包括胶原酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、溶基质蛋白酶或者纤溶酶原激活物的底物。在另一优选的实施方案中，在第一个和第二个结构域之间可以插入酯类低聚物结构域。这可以使用酯类低聚物，如乳酸的寡聚体完成。基质或者前体组分和PTH的组合PTH或者PTH融合肽优选为0.01到2mgPTH/mL基质或者形成该基质的前体组分，其适于修复和愈合骨折，附带条件是不包括0.4mgPTH/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分的浓度。优选地，PTH的浓度为0.1到1.7mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分，甚至更优选浓度范围为0.3到1.5mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分，且最优选浓度范围为0.4到1.1mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分，附带条件是不包括0.4mgPTH/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分的浓度。取决于患者的年龄，优选基质中PTH或PTH融合肽的某些浓度。如果将制剂应用于儿童中的骨折，那么PTH或PTH融合肽的浓度优选低于0.4mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分，但是高于0.01mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分。特别地，PTH或PTH融合肽的浓度为0.01到0.35mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分，更优选浓度范围为0.1到0.3mg/ml血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分，且最优选浓度范围为0.05到0.15mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分。而如果将制剂应用于成人，那么PTH或PTH融合肽的浓度优选高于0.4mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分，但是不高于2mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分。特别地，PTH或PTH融合肽的优选的浓度为0.45到2mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分，更优选0.7到1.5mgPTH或PTH融合肽/ml基质或者前体组分，且最优选0.9到l.lmgPTH或PTH融合肽/ml基质或者形成该基质的前体组分的范围内。在优选实施方案中，基质是血纤蛋白基质。E.粒状材料基质还可以含有粒状材料，优选粒状材料含有钙矿物质，该粒状体需要。粒状材料可以:任何生物相容的材料r从而提供对组合物的必要的机械支持，从而机械支持的程度依赖于适应症。优选地，粒状材料是陶瓷化合物。生物可降解的陶瓷材料已经在基质中显示出有利的性质。陶瓷化合物优选包含钙矿物质，如羟基磷灰石、磷酸钙或者硫酸钓。合适的材料包括羟基磷灰石和磷酸三钙的生物可降解的多孔混合物，如来自Biomatlante(法国)的TRICOS⑧或者来自CamImplants,Leiden(荷兰)的CAMCERAM。最优选的是羟基磷灰石和磷酸三钩的可降解的混合物。一个实例是以商标TRICOS⑧上市的产品，其含有60%羟基砩灰石和40%磷酸三钙的混合物。另一种多孔的羟基磷灰石/磷酸三钧颗粒是CAMCERAM⑧。还可能使用无孔的羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒、纯的羟基磷灰石颗粒(多孔或者无孔)、磷酸三钓颗粒(多孑L或无孔的)、硫酸钩颗净立、骨碎片(自体移植物或者同种异体移植物)或者异种移植物骨碎片。通过颗粒的死空间调节补充的基质中颗粒的量。在优选实施方案中，比率是1:1的颗粒中死空间体积比基质中液体的总体积；这将组成基质中颗粒的上限。取决于骨折的类型，如果骨折类型仅需要较小的机械支持，那么小于所述上限的任何量的颗粒都是可能的。II.应用方法预先形成然后植入所需部位，即，骨折部位。通过将含有PTH的血纤蛋白前体溶液与颗粒(如果存在的话)混合，并将基质应用于骨折部位，可以发生原位胶凝作用/成形。在另一实施方案中，基质可以在身体外形成，然后以预先形成的形状应用。当形成血纤蛋白基质时，在应用前应该保持前体组分分离以防止过早聚合。为了防止施用前的过早接触，可以使用将前体溶液彼此分开的试剂盒。在允许聚合的条件下混合后，前体溶液形成补充了PTH的三维网络。取决于前体组分和它们的浓度，胶凝作用时间可以根据需要调整。在一个实施方案中，从血纤蛋白原形成基质。当与凝血酶和钙源在合适的温度和pH下接触时，血纤蛋白原通过各种反应的级联胶凝以形成基质。三种组分血纤蛋白原、凝血酶和钙源应该单独保存。然而，只要三种组分的至少一种保持分离，那么在施用前可以组合其他两种组分。应该设计补充的基质，从而使得可能以液体或者以糊剂样稠度导入基质，其渗入并填充骨折部位。固化作用允许支架以及从而活性成分保持在骨折部位。还可以在植入前或者植入时，或者甚至在植入后，在多聚体交联形成基质时或者之后向补充的基质中加入细胞。这可以额外或者替代交联基质以产生胞间隙，其设计成促进细胞增殖或者向内生长。在一个实施方案中，将血纤蛋白原溶解(其可以额外含有抑酶肽以增强稳定性)在生理pH(pH6.5到8.0，优选pH7.0到7.5的范围内)的緩冲液中并与溶于氯化钙緩冲液中的凝血酶溶液分开保存。血纤蛋白原的緩冲液可以是组氨酸緩冲液，其额外包括NaCl或者TRIS緩沖盐水。两种溶液通常都冷冻保存并且必须在应用前解冻。在优选实施方案中，提供了试剂盒，其含有PTH，优选PTH融合肽，优选含有钓矿物质的粒状材料，血纤蛋白原、凝血酶和钙源。任选地，试剂盒含有交联酶，如因子XIIIa。PTH,优选PTH融合蛋白可以存在于血纤蛋白原或者凝血酶溶液中。在优选实施方案中，血纤蛋白原溶液含有PTH，优选PTH融合肽。血纤蛋白原和凝血酶溶液优选通过二向注射器装置混合，其中通过将两个注射器的内容物挤压通过混合室和/或针和/或静态混合器发生混合。在优选实施方案中，血纤蛋白原和凝血酶以冻干的形式单独保存。两种前体组分的任一种可以含有融合蛋白和粒状材料。使用前，向血纤蛋白原加入tris或者组氨酸緩冲液，緩冲液可以额外含有抑酶肽以形成血纤蛋白原前体溶液。使用前，将冻干的凝血酶溶解在氯化钧溶液中以形成凝血酶前体溶液。随后，将血纤蛋白原和凝血酶前体溶液置于单独的容器、小瓶或者注射器体中，并用二向连接装置如二向注射器混合。任选地，将容器、小瓶或者注射器体二分，从而具有通过与容器、小瓶或者注射器体壁垂直的可调节的隔板分开的两个室。一个室含有冻干的血纤蛋白原或者凝血酶，而另一个室含有合适的緩冲液。当下压柱塞时，所述隔板移动并且释放緩冲液到血纤蛋白原室中以溶解血纤蛋白原。一旦血纤蛋白原和凝血酶都溶解，两个二分注射器体就附着到二向连接装置并且通过将内容物挤压通过附着到连接装置的注射器针而混合所述内容物。任选地，连接装置含有静态混合器以改善内容物的混合。可以以单独的注射器提供粒状材料。根据优选的实施方案，通过向注射器注射无菌水润湿粒状材料。随后，上述含有血纤蛋白前体溶液和PTH的二向注射器附着到含有润湿的粒状材料的注射器。将二向注射器的完整内容物转移到含有粒状材料的注射器中。随后将完整内容物注射到骨折部位并且可以模塑几分钟。此外，除了上述成分外，可以将其他组分掺入到前体溶液和/或所得的基质中。例如，可以使用含有钙矿物质的材料，即含有钙离子的天然存在的同质物质，如羟基磷灰石。尽管已按照优选实施方案描述了组合物和方法，但是本领域技术人员将明白可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文描述的组合物、方法和方法的步骤和步骤的顺序进行改变。实施例实施例1:PTHw和TGplPTHw4的生物活性显示出与全长PTH^4相似的活性的PTHw4肽与该长度的蛋白质可以通过标准固态肽合成方法合成。使用标准的9-芴基曱氧基羰基化学用自动化肽合成仪在固体树脂上合成所有肽。肽通过c18层析纯化并用反相层析通过HPLC分析以测定纯度以及用质谱法(MALDI)分析以鉴定每种产物的分子量。使用该方法，合成了PTH134以及TG-pl-PTH134NQEQVPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWL-RKKLQDVHNF(SEQIDNO.19)和TGPTH134NQEQVPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQIDNO.20)。TGplPTHw4和TGPTH!34与PTH134的差别在于它额外包含因子XIIIa底物结构域，所述结构域通过纤溶酶可降解的pi序列YKNR(SEQIDNO.18)连接到PTH^4(对于TGplPTHw4的情况)和直接连接到PTHw4(对于TGPTH^4的情况)。为了研究PTH融合肽的生物活性，确立了才艮道基因测定。在该测定中，向细胞转染质粒，该质粒含有萤光素酶报道基因，该报道基因连接到曱状旁腺素受体的启动子。然后，如果细胞暴露于PTH并且PTH随后结合它在细胞上的受体，那么启动通过升高的cAMP水平指导的信号级联。通过天然反馈调节，这然后导致PTH受体水平的降低。由于降低是通过启动子指导的，所以它还导致连接的报道基因的产生的降低。使用该测定，研究了天然的PTHw4以及TG-pl-PTH1-34的活性并与国际标准比较。观察到这两种分子都显示出相似水平的活性，因为两种分子的报道基因表达的降低是相同的，并且该活性水平对于国际标准是相同的。结果在图1中显示。实施例2:PTH从血纤蛋白基质的释放血纤蛋白基质由TISSEELKit(BaxterAG,CH-8604Volketswil/ZH)血纤蛋白前体组分制备。组成在表2中列出。在0,1ng/mlPTHw4或者TGPTHw4存在下，加入凝血酶并混合以形成均匀的浓度。TGPTHw4仅在氨基末端具有转谷氨酰胺酶序列，没有降解位点。因而，TGPTHw4仅可以通过血纤蛋白基质自身的降解释放。如实施例1中描述的合成该肽。对于第一种释放测定，将具有0.1mgPTH或TGPTH/ml血纤蛋白基质的50yl血纤蛋白基质在37"C下10ml緩冲液中温育。所以，对于总释放，緩冲液中PTH或TGPTH的浓度将为0.5jagPTH或TGPTH/ml血纤蛋白基质。为了比较测定期间PTH或者TGPTH的稳定性，将PTH或TGPTH的样品直接在緩冲液中稀释到0.5ygPTH或TGPTH/ml血纤蛋白基质的浓度。测试不同的緩沖液蒸馏水、磷酸緩冲盐水、tris緩冲盐水。在第0、1、2、4和6天取等分试样并通过直接ELISA分析。结果表明PTH在任意緩沖液中稳定不超过2天。因此，对于释放数据不能4故出结论。PTH稳定性当然受到其低浓度和不是最佳的緩沖液的影响。通过使用在IOmM乙酸钠緩冲液中含有50mM甘露糖醇的稳定緩冲液重复释放实验。此外，每2天更换緩冲液以便防止肽的任何降解。PTH或者TGPTH浓度增加到lOOjil血纤蛋白基质中1mgPTH或TGPTH/mL血纤蛋白基质并在lml緩冲液中实现温育。对于总的释放，緩沖液中PTH或TGPTH的浓度将为100yg/mL血纤蛋白基质(为以前的200倍)。如在第一个实验中，制备加料样品(溶解在緩冲液中的相同量的PTH或TGPTH作为对照)以评估实验期间PTH或TGPTH的稳定性(100ng/ml)。在2周期间每2到4天收集样品(更换緩沖液)并通过直接ELISA分析。也每2天收集加料样品。结果表明在这些条件下，PTH和TGPTH在2周内是稳定的。如可以从图2看出的，在3天内实现从血纤蛋白基质的主要释放。3天后释放几乎60%的PTH和13%的TGPTH。这些数据证明通过加入TG序列大大增强了血纤蛋白基质中PTH的保留。实施例3:羊胫骨缺陷模型从TISSEELKit(BaxterAG,CH-8604Volketswil/ZH)开始形成血纤蛋白基质，从而得到4ml血纤蛋白基质。TISSEEI^从合并的人来源的血浆产生并且活性成分的含量可以在预定的范围内在批与批之间不同。基质使用3个单独的注射器制备基质，一个二向注射器含有血纤蛋白前体溶液和PTH融合肽(注射器1和2)，以及两个单向注射器含有颗粒(注射器3和4)。表2列出了使用的最终组成。表2:包含TISSEE!/和活性组分的最终组成<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>首先，通过注射器3的水的注射将注射器4中的羟基磷灰石/磷酸钓颗粒润湿。将注射器1中的血纤蛋白前体溶液(悬浮在具有抑酶肽的溶液中的血纤蛋白原和PTH,所述抑酶肽是帮助减小纤维溶解以保持血纤蛋白基质的完整性的丝氨酸蛋白酶抑制剂)与注射器2的血纤蛋白前体溶液(溶于氯化钙溶液中的凝血酶)混合。将TGplPTHw4配制成血纤蛋白原组分以得到基质中终浓度为0.1mg/ml到10mg/ml血纤蛋白基质，并且在凝胶化过程中，TGplPTHw4变得与基质交联。血纤蛋白前体溶液还含有血纤蛋白基质的其他组分，如血浆纤连蛋白、因子XIIIa、纤溶酶原和人清蛋白。当前体溶液为等体积时，发生凝固过程以形成血纤蛋白。凝固过程在几分钟内发生，其允许向含有润湿的颗粒的注射器4中同时注射混合的溶液。然后可以将基质导入需要的部位，其在所述部位固化。在缺陷中放置足够的基质以完全将其填充。动物选择总共42只SwissAlpine雌性羊作为实验动物，这些羊在44-83kg(平均62.8kg)和2.25-4.75岁之间。形成7个组，其中用自体移植物作为阳性对照，用血纤蛋白基质加上TCP颗粒作为阴性对照。其他组由相同的血纤蛋白基质和TCP颗粒组成，但是仅在TGplPTHw4的剂量中不同。跟踪这些组12周，然后在大学拥有的屠宰场处死动物。所有动物实验都根据瑞士的动物保护和福利法进行并且得到当地伦理委员会(EthicalCommittee)和兽医当局(VeterinaryAuthorities)的授权。外科手术直接在骨的上面进行到胫骨体的内侧进路，并从后膝关节(stifle)的远侧方向延伸到跗关节，切开胫骨的内侧筋膜并暴露胫骨的内侧而不干扰骨膜。将一个11个孔、3.5mm宽动态压缩接骨板(Synthes)与骨体轮廓相符，其中所述板的远端在胫跗关节上方结束。用11个3.5mm的螺丝钉以中性位将板固定到骨，并且5个螺丝钉孔在根据计划的缺陷远端分布，6个在近端分布。除去螺丝钉和板。之后，在骨上用手术刀刀刃标记缺陷，其中使用量规确保在第5个和第6个螺丝钉孔之间产生标准化的1cm缺陷。使用摆锯在恒定灌洗下切下缺陷并保留软组织。将包括周围骨膜的lcm段小心取出并用纱布施加压力停止骨髓或者局部软组织的局部出血。将板复位并重新插入所有螺丝钉，之后如上述向骨裂隙填充基质。小心地在板下方、侧面上以及transcortex上均匀分布基质。对于阳性自体移植物对照组，通过直接在髂嵴上的局部切割收获自体骨。用多个3.5mm的钻孔打开回肠的骨髓。用刮匙收获骨松质并立即置于胫骨的外科手术缺陷中。缺陷填充后，常规地封闭内侧筋膜并钉住皮肤(Signet35W,AutoSutures,Connecticut,USA)。在动物仍然被麻醉时，使用胫骨的中间外侧和尾-颅位观进行放射显影。应用完整模型(ScotchCastTMPlus，Laboratoires3MSant6，法国)，其涉及在膝盖骨水平上整个远端骨端向上延伸到后膝关节中间。让爪子的跖保持打开以确保在骨折部位承重，但是通过模型固定胫骨体以防止扭转力或者剪切力。动物在悬吊系统中恢复，该系统防止动物匆忙躺下和起立，从而导致肢再次骨折。动物在悬吊系统中保持4-5周，期间它们可以不受干扰地睡觉、进食、排粪和排尿。之后，在剩下的研究时间段内，将它们以2-3只动物的组保持在小的畜舍中。每7-10天进行模型改变或者如果动物显示出承重方面的问题，那么更早进行模型改变，并保持在适当位置最少4周但是最多12周。在4和8周通过模型进行随访放射显影。处死时(12周)，取出软组织、板和螺丝钉后用faxitron(HPElectronics)进4亍放射显影。肉眼评价处死后，肉眼评估裂隙的桥接，集中注意板和骨折稳定性、炎症病征和骨膜骨痂形成。所有骨都用数码相机(Minilta，Dimage7)记录。仅仅手工测试机械稳定性，但是为了以后的组织学制备，小心防止组织伤害。放射性评价开发了用于评估放射显影的半定量评分系统。高得分有利于骨愈合。通过三个独立的评论者评价放射显影，他们对研究期间的组和时间点不知情。所有放射显影都在一个期间打分，并且如果分数不同，那么将平均得分用于统计学评价。组织学.简言之，切割骨切片从而使得封闭整个以前的裂隙并在第一个螺丝钉孔近端和远端进行切割。在4%多聚曱醛中固定3-4周后，洗涤骨块，在酒精的递增系列中脱水，用二甲苯脱脂，并最终用丙烯酸树脂浸润。浸润完成后，以特氟隆(Teflon)形式进行聚合。使用Exacta带锯在骨的长轴的中间并平行于长轴切割切片。将切割的切片在acropal塑料栽玻片上封固前，使用专门的胶片(KodakPPL-2)用faxitron进行显微放射显影。将切片研磨和抛光到30-40pm的厚度。用曱苯胺蓝染色表面允许区分旧和新骨基质以及TCP颗粒。对于薄切片(5jam)，将块切割成更小的片，其含有至少一种皮质和部分骨膜和骨内膜骨痂。将切片在带正电荷的chromalaune覆盖的栽玻片上封固，去塑化(deplastified)并用甲苯胺蓝或者用McNeal复染的vonKossa银染染色。在后一种中，矿化的骨基质染成黑色，而未钧化的类骨质染成蓝色-青绿色。通过集中在细胞类型、炎症的病征和基质降解机制方面进行定性组织学评估。半定量评估集中在细胞类型的外观上，其中使用特别开发的评分系统，且组织形态学测量用作定量评估的基础。进一步在羊中的节段缺陷中测试基质(含有不同浓度的TGplPTH,.M)的再生能力。这里，在羊胫骨中产生单侧lcm的全厚度缺陷。切骨术后，小心取出骨膜以确保在将研究的时间段内，缺陷是不愈合的。产生缺陷后，如上文应用方法部分中描述的在缺陷中放置原位凝胶化材料。为了比较目的，测试不同剂量的TG-PTH:0.4、1、2、5和10mg/ml，进行两个对照处理，其中不向血纤蛋白-颗粒复合基质加入TGplPTHw4(0mg/ml)或者应用自体移植物(在图3和4中缩写为"AG")(阳性对照)。每4周拍摄X射线照片并在12周后处死动物。在每个时间点，分析X射线照片并确定愈合程度。此外，在终点时，提取胫骨用于通过计算机体层扫描射影术(CT)以及组织学进行分析。最后，由于进行了完全的切骨术且然后在一侧装板，所以缺陷受到显著的应力和机械力。如果用于治疗缺陷的材料不增加显著的强度，那么这可以导致板的弯曲和角度变形。从X射线照片和最终的样品看来，这是已经测量的另一个参数。这些实验的结果在图3中显示当在该模型中测试血纤蛋白加上仅TCP材料(阴性对照)时，观察到非常低的愈合应答。在用该对照材料处理的四只动物中，它们都没有显示出临床上相关的愈合，其中一只显示出中等愈合应答，且其他三只在12周后显示出不愈合的典型病征。此外，在前四周内，所有四只动物都显示出板的显著弯曲和随后缺陷的扭曲。在下一系列的动物中，用0.4、1、2、5或10mg/mLTGplPTHw4测试补充的基质。作为第一次测量，用放射显影分析观察这些动物以确定骨膜愈合(骨痂形成)的量。从随后的放射显影，观察到用各种剂量的TGplPTH^4处理这些动物提供了在所治疗的范围内的依赖于剂量的应答。具体地，当检查这些动物的放射显影时，当在12周时与用阴性对照材料治疗的那些和等同于自体移植物的愈合相比时，对于0.4到2mg/mL的剂量，在每个时间点观察到更强的骨膜愈合应答，其中0.4和1mg/mL提供了统计学上更强的骨膜愈合。此外，使用1mg/mL的剂量，观察到大多数动物在12周内实现了稳定的临床愈合(见图4)。在用1mg/mLTG-pl-PTH^治疗的组中，4周后，已经可以观察到愈合的第一种病征。该愈合在8周时间点显著增加，其中一只动物已经显示出临床愈合，而其他的5只显示出增强的愈合。这然后进一步发展，从而12周后，5只动物显示出稳定的临床愈合。此外，观察到稳定性的显著提高，其中只有1只动物显示出板的弯曲，其在前4周内发生。在图4中，显示了12周后节段胫骨缺陷的稳定性。在第12周处死羊后，取出板并容易地确定最初裂隙的稳定性。然后确定明显不稳定的缺陷百分数。可以看到用自体移植物处理的动物没有一只具有稳定的缺陷，从而验证了该模型。此外，当用1mg/mLTGplPTH^4治疗动物时，仅仅一只动物具有不稳定的缺陷，从而提供了相似的强烈愈合应答。接近lmg/mL的剂量也显示出一定的稳定性，而更高的剂量和0剂量在终点显示出低得多的稳定性。作为愈合的最终测量，通过组织形态学测量骨内膜骨形成(在长骨的内层的骨形成，即在裂隙内)和颗粒吸回的速率。观察到使用1mg/mLTGplPTHw4剂量，骨内膜骨形成的量比其他浓度的TGplPTHw4更高，其中更高的剂量提供较低量的新骨形成。此外，观察到颗粒吸回的速率与骨内膜骨形成的速率成正比，其中1mg/mLTGplPTH^4剂量再次提供了最佳的应答(即，最高的吸回速率)。当观察整个剂量范围时，可以看到较高的剂量提供了较低的骨内膜骨形成和颗粒吸回，其中约1mg/mLTGplPTHw4的剂量提供了最佳应答。用TGplPTH^4治疗组的改进的结果与对照组比较证明，在补充的基质中存在临床相关剂量的TGplPTHw4可以导致愈合的强烈改善。该高度机械应激模型中较快的愈合、提高的骨形成以及提高的稳定性是证明在远端桡骨受压骨折中补充的基质的应用有道理的相关的特征。此外，考虑到来自骨膜骨形成的结果，骨内膜骨形成和颗粒吸回和总体稳定性，可以看到0.4mg/mL到1.1mg/mLTGplPTH^4血纤蛋白基质的剂量是最优选的浓度范围。权利要求1.制剂，其包含(i)选自PTH和PTH融合肽的肽；(ii)包含钙矿物质的粒状材料和(iii)能够在生理条件下形成血纤蛋白基质的组合物，其包含血纤蛋白原前体组分和凝血酶前体组分，其中PTH或者PTH融合肽以0.01到2mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分的浓度存在，附带条件是不包括0.4mg/mL血纤蛋白基质或者形成该基质的前体组分的浓度。2.根据权利要求1的制剂，其中所述血纤蛋白原前体组分或凝血酶前体组分还包含4丐源。3.根据权利要求1或2的制剂，其中所述PTH融合肽包含至少两个结构域，其中第一个结构域包含PTH并且第二个结构域包含可交联的底物结构域。4.根据权利要求1到3任一项的制剂，其中所述PTH选自pi84、p138、pth，pupi25。5.根据权利要求4的制剂，其中所述PTH是PTHw4。6.根据权利要求3的制剂，其中所述第二个结构域包含转谷氨酰胺酶底物结构域。7.根据权利要求6的制剂，其中所述转谷氨酰胺酶结构域包含因子XIIIa底物结构域。8.根据权利要求3的制剂，其中所述PTH融合肽还包含第一个和第二个结构域之间的降解位点。9.根据权利要求1到8任一项的制剂，其中所述粒状材料是磷酸三钓和羟基磷灰石的混合物。10.试剂盒，其包含权利要求1到9任一项的制剂。11.根据权利要求10的试剂盒，其中所述血纤蛋白原前体组分和凝血酶前体组分相互分开。12.根据权利要求10或11的试剂盒，其中所述PTH融合肽还包含第一个和第二个结构域之间的降解位点，所述降解位点是酶促或者水解降解位点。13.补充的基质，其包含(i)PTH或者PTH融合肽；(ii)包含钓矿物质的粒状材料和(iii)血纤蛋白；其中所述PTH或者PTH融合肽以0.01到2mg/mL血纤蛋白基质的浓度存在，附带条件是不包括0.4mg/mL血纤蛋白基质的浓度。14.根据权利要求13的补充的基质，其中所述PTH选自PTH,-84、PTH138、PTH134、PTH^和PTH，15.根据权利要求14的补充的基质，其中所述PTH是PTHw4。16.根据权利要求13到15任一项的补充的基质，其中所述补充的基质由能够形成血纤蛋白基质的组合物和融合肽形成，该融合肽包含第一个结构域中的PTH和第二个结构域中可共价交联的底物结构域。17.根据权利要求16的补充的基质，其中所述第二个结构域包含因子XIIIa底物结构域。18.根据权利要求13到17任一项的补充的基质，其中所述PTH融合肽还包含第一个和第二个结构域之间的降解位点。19.根据权利要求18的补充的基质，其中所述降解位点是酶促降解位点。20.根据权利要求13到19任一项的补充的基质，其中所述粒状材料是磷酸三钙和羟基磷灰石的混合物。21.根据权利要求13到20任一项的补充的基质在制备局部施用以修复骨折的药物中的用途。22.根据权利要求1到9任一项的制剂在制备局部施用以修复骨折的药物中的用途。23.根据权利要求21或22的用途，其中所述骨折是桡骨远端或者胫骨骨折。全文摘要本文描述了补充的基质，其包含可释放地掺入其中的PTH，任选含有粒状材料。PTH通过共价连接基质或者通过与基质和/或颗粒的非共价相互作用掺入。这些补充的基质与自体移植物相比缩短愈合时间或者触发否则将不愈合的骨折的愈合。基质是生物相容的和生物可降解的并且可以在体外或在植入时体内形成。PTH可以是融合肽的部分。PTH可以掺入到基质中，完全保留其生物活性。PTH可以可释放地掺入，其中使用提供对PTH使用该基质作为控释载体怎样、何时和多大程度释放的控制的技术，以愈合骨折。文档编号A61L27/12GK101098717SQ200680001848公开日2008年1月2日申请日期2006年1月6日优先权日2005年1月6日发明者I·阿里吉,J·沃森,J·谢恩塞申请人:库罗斯生物外科股份公司