靶向blys受体的blys融合蛋白和用于治疗b细胞增殖性疾病的方法

专利名称：：靶向blys受体的blys融合蛋白和用于治疗b细胞增殖性疾病的方法耙向BLYS受体的BLYS融合蛋白和用于治疗B细胞增殖性疾病的方法本发明要求2005年2月1日提交的美国临时申请系列号60/649,478的优先权，该申请全文纳入本文作为参考。发明领域本发明至少涉及细胞生物学、分子生物学、癌症生物学和医学领域。更具体地说，本发明涉及包含与细胞毒剂缀合(conjugated)的BLyS多肽的组合物及这种组合物在治疗中的应用。发明背景B淋巴细胞刺激物是能诱导体内和体外B细胞增殖和分化的肿瘤坏死因子("TNF")超家族的成员之一(Moore等，Science285:260-263(1999))。BLyS与其它B-细胞生长和分化因子(例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-13、IL-15、CD40L或CD27L(CD70))的区别在于其单核细胞特异性基因和蛋白质表达模式及其在B淋巴细胞上的特异性受体分布和生物学活性，可藉此区分出BLyS。在天然杀伤("NK")细胞、T细胞或B细胞上未检测到BLyS表达，而是局限于骨髓来源的细胞。干扰素-y(IFN-y)上调静息单核细胞上的BLyS表达。编码BLyS的基因经作图定位于染色体13q34。人BLyS表达为285个氨基酸的II型膜结合的多肽和可溶性152个氨基酸的多肽(Moore等，1999，同上)。BLyS的膜结合形式在氨基酸残基47-73之间具有预计的跨膜结构域。BLyS的可溶形式的NH2-末端始于BLyS的膜结合形式的Ala134。可溶性重组BLyS显示能诱导鼠脾B-细胞体外增殖和结合这些细胞上的细胞表面受体(Moore等，1999，同上)。将可溶性BLyS给予小鼠显示能提高CD45RB§、Ly6D，也称为ThB)B-细胞的比例和血清IgM和IgA水平(Moore等，1999，同上)。因此，BLyS在其受体分布和生物学活性中均显示B-细胞嗜性。成功开发肿瘤靶向治疗剂部分取决于治疗剂的部位特异性递送，也取决于所递送药物的生物学活性。已利用单克隆抗体赋予其它无差别的细胞毒剂(例如毒素、放射性核素和生长因子)以选择性(Williams等，1990;Rowlinson-Busza等，1992;Wahl，1994)。一种这样的分子是白树毒蛋白(gelonin)，其是效力和作用机制类似于蓖麻毒蛋白A-链(RTAM旦稳定性提高且毒性降低的29-kDa核糖体失活性植物毒素(Stirpe等，1992;Rosenblum等，1995)。以前的研究已鉴定并检测了植物毒素白树毒蛋白与各种抗体的许多化学缀合物的生物学特性(Boyle等，1995;Xu等，1996;Rosenblum等，1999)。在以前的研究中，抗体ZME-018与纯化的白树毒蛋白化学偶联，该免疫缀合物在组织培养物和人肿瘤异种移植模型中显示针对抗原阳性黑色素瘤细胞的特异性细胞毒性(Rosenblum等，1991;Mujoo等，1995)。需要对异常增殖的B-细胞有特异性的改良治疗剂。发明概述本发明涉及产生和利用具有靶向活性(例如针对癌细胞(包括肿瘤))和细胞毒性活性的分子的方法。所述分子可包括，例如缀合多肽。本发明也包括从这些缀合多肽制备的组合物。例如，本发明的蛋白缀合物包括同时含有毒素和BLyS多肽的化合物。在一些实施方式中，缀合多肽经过重组工程改造而产生融合蛋白。缀合化合物也可通过例如，接头彼此相连。在本发明的具体实施方式中，通过该分子的单独部分提供耙向活性和细胞毒性活性，虽然另一部分可包含部分或全部的靶向和细胞毒性。本领域技术人员知道"BLyS"可与BAFF、BLYS、TALL1、THANK、ZTNF4、TALL-1、TNFSF20和ABAFF多核苷酸或多肽互换，虽然在其它实施方式中其不可互换。本领域技术人员知道如何测定可能与BLyS互换的分子是否合适，例如通过本文提供的内容和/或可从本领域中获得的内容。如本发明所示，SEQIDNO:1指全长285个氨基酸的人BLyS多肽。SEQIDNO:20指人BLyS的多核苷酸序列。SEQIDNO:1的氨基酸残基134-285包含可溶的BLyS多肽同工型，在某些实施方式中它是用于本发明缀合多肽的同种型。本发明也考虑了小鼠(多肽SEQIDNO:2;核苷酸SEQIDNO:3)BLyS或BLyS的任何其它直向同源物。BLyS的功能等价物也适用于本发明的靶向缀合多肽。例如，考虑了保留BLyS活性，与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示任一(多肽)具有至少80%序列同源性、至少85%序列同源性和至少90%序列同源性的多肽。在另一具体实施方式中，BLyS的氨基酸序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的至少约40、至少约50、至少约75、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250或至少约275个毗连氨基酸。在其它实施方式中，功能等价物至少包含参与受体识别的D-E环。(参见Oren等，NatStructBiol.2002年4月，9(4):288誦92)。在一些实施方式中可利用野生型BLyS，而在其它实施方式中则可利用突变型BLyS。示范性BLyS突变体在Cysl46处含有突变(Chen等，2002;2004;2005)，在具体实施方式中，突变为丙氨酸或缬氨酸。本发明所用的BLyS突变体保留了耙向B细胞的能力，例如保留了与至少一种BLyS受体结合的能力。可增强BLyS突变体的任何活性使其高于野生型BLyS，包括通过例如BLyS受体来提高与B细胞结合的能力。本发明的BLyS靶向多肽靶向于表达BLyS受体(例如TNFRSF13B/TACI(SEQIDNO:4)、TNFRSF17/BCMA(SEQIDNO:5)和TNFRSF13C/BAFFR(SEQIDNO:6))的细胞。在本发明的某些实施方式中，本发明的缀合多肽与表达SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的功能等价物的细胞特异性结合。在本发明的某些实施方式中，考虑到表达BlyS受体的细胞可能与B细胞的异常增殖相关。本领域技术人员知道为了介导受体识别，BLyS可形成二聚体或三聚体。应该知道本文所述缀合多肽的蛋白质组合物能使BLyS二聚体、三聚体或任何的多元蛋白质复合物得以形成。在某些实施方式中，BLyS多肽与某分子连接。在优选的实施方式中，所述连接是共价连接。在其它实施方式中，所述分子是例如细胞毒剂、药物、化疗剂、放射性同位素、促凋亡剂、抗血管生成药物、激素、细胞因子、生长因子、肽、蛋白质、抗生素、酶(例如，粒酶B或粒酶A)、抗体、抗体的Fab片段、成像试剂、核酸或抗原。这些分子只是代表。本发明范围内的分子实际上包括可与BLyS多肽连接并给予人对象的任何分子。在优选的实施方式中，促凋亡剂是例如短杆菌肽、马加宁、二甲双胍、防卫素或天蚕抗菌肽。在其它优选的实施方式中，抗血管生成药物是血小板反应蛋白、血管抑制素、内皮抑制素或色素上皮驱动因子(pigmentepithelium-drivedfactor)。在其它优选的实施方式中，细胞因子是例如白介素1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-18、干扰素-y(IF-力、IF-oc、IF-(3、肿瘤坏死因子-ot(TNF-a)或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。这种实例只是代表性的，不排除本领域已知的其它促凋亡剂、抗血管生成药物或细胞因子。本发明的一些实施方式提供了重组白树毒蛋白肽毒素(如SEQIDNO:7所示)，纳入本文作为参考的美国专利号5,631,348公开了该毒素。本发明重组白树毒蛋白毒素可以是保留毒素活性的SEQIDNO:7的任何部分或片段。在某些实施方式中，白树毒蛋白包含SEQIDNO:7的残基110-210。在另一具体实施方式中，重组白树毒蛋白的氨基酸序列是SEQIDNO:7的至少约30、至少约40、至少约50、至少约75、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225或至少约250个毗连氨基酸。本发明的其它化合物包括除含有核心毒素区外，还含有SEQIDNO:7中至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个毗连氨基酸的重组白树毒蛋白毒素。在本发明的其它实施方式中，白树毒蛋白包含SEQIDNO:21(Genbank登录号P33186)。在一些实施方式中可利用野生型rGel，而在其它实施方式这则可利用突变型rGel。在本发明的具体实施方式中，本发明利用了2002年2月12日提交的美国专利申请系列号10/074,596的rGel分子，该申请全文纳本文作为参考。本发明的一个实施方式提供了具有SEQIDNO:8所示序列的示范性缀合多肽。编码该缀合多肽的示范性多核苷酸示于SEQIDNO:9。本发明另一实施方式提供了具有SEQIDNO:10所示序列的示范性缀合多肽。编码该缀合多肽的多核苷酸示于SEQIDNO:11。在本发明的其它实施方式中，本发明提供的细胞毒剂可以是例如相思豆毒蛋白、商陆毒蛋白(dodecandrin)、天花粉蛋白(tricosanthin)、曲古克淋(tricokirin)、异株泻根毒蛋白(bryodin)、紫茉莉(mirabilis)抗病毒蛋白、大麦核糖体失活性蛋白(BRIP)、商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素、丝瓜蛋白和/或木鳖子皂苷。在本发明的某些方面，本发明多肽可以是缀合的。这些缀合多肽一般至少长5个氨基酸。在本发明的某些实施方式中，缀合多肽，例如长约5-约10个氨基酸、长约5-约50个氨基酸、长约5-约100个氮基酸、长约5-约150、约5-约500、约5-约1000或约5-约5000个氨基酸。可通过任何合适的方法缀合本发明多肽，所述方法包括，例如通过化学缀合与"遗传缀合"，例如含有与细胞毒性肽操作性相连的BLyS多肽的重组融合蛋白。所考虑的BLyS多肽的缀合(方式)包括在该蛋白的N-末端区(在最初100个氨基酸内)、内部区(N-末端和C-末端区之间)和/或该蛋白的C-末端区(在最后100个氨基酸内)的缀合。预想本发明可用的缀合技术详述于下文。可以外源性表达本发明的缀合多肽。在本发明的具体实施方式中，多肽含有融合多肽或嵌合多肽。嵌合型多肽包含两种或多种多肽的全部或不连续部分。多肽的不连续部分指具有可鉴定功能或活性的氨基酸区域。融合蛋白是其中第一多肽或第一多肽的部分首尾相连地与第二多肽或第二多肽的部分相连的一类嵌合蛋白。本发明也包括治疗患B-细胞增殖性疾病的对象的方法，该方法包括给予患病对象治疗有效量的一种或多种本发明的分子，包括缀合多肽。术语"B-细胞增殖性疾病"表示在形态学和基因型上经常显示不同于周围组织的恶性以及非恶性细胞群。细胞毒性多肽可以通过本领域技术人员已知和本文进一步详述的各种方式与BLyS多肽相连。可用本发明治疗的示范性B-细胞增殖性疾病至少包括以下疾病B-细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B-细胞前淋巴细胞性白血病、免疫细胞瘤/淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacyticlymphoma)(+/-瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、外套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴样组织(MALT)型边缘区B-细胞性淋巴瘤(MarginalZoneB-cellLymphomaofmucosa-associatedlymphoidtissue(MALT)type)、脾边缘区B-细胞淋巴瘤(+/-绒毛状淋巴细胞(villousLymphocytes))、毛细胞性白血病、弥散性大B-细胞性淋巴瘤、纵膈(胸腺)大B-细胞性淋巴瘤、血管内大B-细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤(多发性骨髓瘤)、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、无痛性骨髓瘤、郁积性骨髓瘤(smoldingmyeloma)、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、浆细胞性白血病、非分泌性骨髓瘤、浆细胞瘤、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病(HCD)、免疫球蛋白沉积病(Immunoglobulindepositiondiseases)、全身性轻链病和原发性淀粉样变性。在本发明的具体方面，组合物和方法涉及对某治疗方法不应(refractory)的B-细胞增殖性疾病。所述疾病可以最初即对治疗不应，或可以在最初或随后的治疗期间变得不应。本发明的其它实施方式关注用于预防和/或治疗B-细胞增殖性疾病的至少一种症状的本发明组合物。本发明的具体实施方式利用本发明组合物来预防和/或治疗自身免疫疾病，例如关节炎或狼疮。对于预防性实施方式，可完全防止症状发生，或者可延迟其出现。对于治疗性实施方式，可完全消除症状发生或者部分改善症状。在本发明的其它方面，将这些方法和组合物应用于已接受过针对相同B细胞增殖性疾病的另一治疗方法、将接受另一治疗方法或正在接受该治疗方法的个体。可采用任何其它疗法，虽然在具体实施方式中，所述其它疗法包括放疗、化疗、外科手术、基因疗法、免疫疗法、激素疗法或它们的组合。在具体实施方式中，提供了治疗患B-细胞增殖性疾病的个体的方法，其包括给予该患者治疗有效量的含有与细胞毒性肽缀合的BLyS多肽的组合物，例如缀合多肽，该方法的具体方面还包括给予该个体能提高BLyS受体表达的药物。在本发明的其它实施方式中，可将BLyS受体引入宿主细胞，在该宿主细胞中表达，从而使得BLyS能靶向其天然嗜性之外的细胞。在某些实施方式中，通过组织特异性启动子调节含有编码本发明BLyS缀合物(例如融合蛋白)的核酸序列的多核苷酸表达。例如，可利用合适的载体将BLyS受体分子(例如SEQIDNO:4(基因序列是SEQIDNO:12))引入宿主肝细胞。BLyS受体的表达受到肝癌特异性启动子的控制。因此，BLyS缀合的多肽可以靶向肝瘤细胞以用于治疗。在本发明的其它实施方式中，缀合多肽可以与成像试剂相连来追踪多肽在患者体内靶向(目标)的进展。在本发明另一实施方式中，提供了选择性耙向表达BLyS受体的细胞的方法，其包括使该细胞与含有缀合了细胞毒性肽的BLyS多肽的缀合多肽相接触。在本发明另一实施方式中，提供了监测B-细胞增殖性疾病治疗的方法，其包括给予患者治疗有效量的含有与细胞毒性肽和成像试剂缀合的BLyS多肽的缀合多肽。本发明涉及多种多肽组合物，其中多种多肽实体(entity)作为一种化合物存在。因此，BLyS蛋白可以与例如白树毒蛋白毒素相连，并与第二、第三、第四、第五、第六或更多种多肽相连。在本发明的其它实施方式中，提供了用于B-细胞增殖性疾病的治疗和/或预防的试剂盒，其装有包含与另一分子(例如细胞毒剂或药物试剂)缀合的BLyS多肽的组合物。在具体实施方式中，组合物包含rGel和BLyS的融合蛋白和/或编码它们的多核苷酸。因此，在本发明的实施方式中，提供了一种组合物，其包含与其它分子(包括与BLyS多肽不同的分子)缀合的BLyS多肽。在具体方面，所述其它分子不是BLyS的同源物。在本发明的具体方面，所述其它分子包括例如药物试剂、螯合剂或细胞毒剂。例如，组合物中所包含的各组分可以是融合蛋白，或可以是化学缀合的。本发明组合物可以包含重组多肽和/编码该重组多肽的多核苷酸。在具体方面，所述组合物还包含放射性试剂、细胞成像试剂或同时包含二者。所述组合物可以包含在药学上可接受的载体中。在BLyS多肽的具体方面，所述多肽含有B-细胞靶向结构域、含有D-E受体识别环、含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的全部或功能部分和/或含有BLyS的功能等价物，其中所述功能等价物与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有至少80%序列同源性。在利用细胞毒剂的实施方式中，细胞毒剂可以是任何合适的类型，虽然在具体实施方式中，所述细胞毒剂包含例如肽、多肽或小分子。在具体方面，细胞毒性肽包含白树毒蛋白肽，其在示范性实施方式中位于BLyS多肽的5'。在本发明的具体实施方式中，所述白树毒蛋白肽包含SEQIDNO:7。在其它具体实施方式中，所述白树毒蛋白肽包含SEQIDNO:7的氨基酸残基110-210。在本发明具体的实施方式中，所述细胞毒剂选自例如蓖麻毒蛋白A、白喉毒素、相思豆毒蛋白、商陆毒蛋白、天花粉蛋白、曲古克淋、异株泻根毒蛋白、紫茉莉抗病毒蛋白、大麦核糖体失活性蛋白(BRIP)、商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素、丝瓜蛋白、假单胞菌外毒素和/或木鳖子皂苷。在本发明的某些实施方式中，所述组合物包含例如SEQIDNO:8和/或SEQIDNO:10。在本发明的具体方面，提供了一种宿主细胞，其含有本发明组合物。在本发明的其它具体方面，提供了分离的多核苷酸，其编码本发明组合物的至少一部分，包括全部组合物。在具体实施方式中，所述多核苷酸包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:11。在本发明的其它实施方式中，提供了治疗患B-细胞增殖性疾病的个体的方法，其包括给予该患者治疗有效量的组合物，所述组合物含有与其它分子(例如细胞毒剂)缀合的BLyS多肽。该方法还包括给予该个体(例如)能提高BLyS受体表达的药物。在本发明的具体实施方式中，BLyS受体选自TNFRSF13B/TACI(SEQIDNO:4)、TNFRSF17/BCMA(SEQIDNO:5)和TNFRSF13C/BAFFR(SEQIDNO:6)。在本发明的实施方式中，提供了选择性靶向表达BLyS受体的细胞的方法，其包括使该细胞与含有缀合了细胞毒剂的BLyS多肽的组合物相接触。在本发明的另一实施方式中，提供了监测患B-细胞增殖性疾病个体的治疗的方法，其包括给予个体治疗有效量的含有与细胞毒剂和成像试剂缀合的BLyS多肽的组合物。为更好地理解以下的发明详述，上文相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点。下文描述了本发明的其它特征和优点，这些特征和优点构成了本发明权利要求的主题。本领域技术人员应该理解，为实施本发明的相同目的，不难将所公开的概念和具体实施方式用作改进或设计其它结构的基础。本领域技术人员应该知道这些等价构造不偏离本文所述的本发明构思和范围。对于其组织和操作方法，结合附图可从以下描述中更好地理解相信是本发明特性的新特征联同其它目标和优点。然而，特别应该理解，提供各幅附图的目的只是为了说明和描述，不应理解为对本发明的限制。附图简述为更完全地理解本发明，可参考以下关于附图的描述。图1显示了BLyS和rGel的示范性取向。图2显示了BLyS/rGel融合毒素的示范性DNA序列(SEQIDNO:9)和蛋白质序列(SEQIDNO:8)。图3显示了rGel/BLyS融合毒素的示范性DNA序列(SEQIDNO:ll)和蛋白质序列(SEQIDNO:10)。图4说明了示范性融合毒素rGel/BLyS的构建。釆用剪接重叠延伸PCR方法制备的融合毒素rGel/BlyS，其在N-末端含有rGel，其后是与BLyS分子相连的G4S肽。将重组rGel/BLySDNA构建物引入pET-32a载体的KpnI和XhoI限制性酶切位点以构建表达载体pET32rGel/BLyS。图5显示了rGd/BLyS融合毒素的纯化情况。rGel/BLyS融合毒素的考马斯-染色SDS-PAGE分析显示rGel/BLyS的Mr是45kDa，证明BLyS和rGel的摩尔比是1:1(左图)。利用抗-白树毒蛋白抗体或抗-BlyS抗体的蛋白质印迹分析证明rGel/BLyS融合毒素在融合毒素中含有毒素和BLyS组分(右图)。图6显示rGel/BLyS融合毒素的无细胞蛋白质合成抑制活性。为检验rGel/BLyS融合毒素中rGel组分的n-糖苷活性，将该物质加入体外蛋白质翻译试验，其中利用了分离的家兔网织红细胞掺入[3司亮氨酸。比较了rGel/BLyS融合毒素和天然rGd的抑制曲线。图7比较了rGel/BLyS和BLyS/rGel融合毒素对JEKO外套细胞系(mantlecellline)的细胞毒性活性。将JEKO外套细胞系接种(5X103个/孔)在平底96-孔微量滴定板上，以一式四份在孔中加入rGel、rGd/BLyS或BLyS/rGel。96小时后，向各孔中加入75plXTT标记混合物，然后再培育细胞4小时。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图8A-8M显示了rGel/BLyS融合毒素对各种肿瘤细胞系的剂量-应答曲线。Jurkat(8A)、KBM-5(8B)、THP-1(8C)、HL-60(8D)、IM-9(8E),MM1.S(8F)、MM1.R(8G)、RPMI8226(8H)、8226/LR-5(81)、JEKO(8J)、SP53(8K)、Mino(8L)和Granta(8M)。将13种肿瘤细胞系接种(5X103个/L)在平底96-孔微量滴定板上，以一式四份在孔中加入rGel或rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入75plXTT标记混合物，然后再培育细胞4小时。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图9显示了rGd/BLyS融合毒素对表达BLyS受体的JEKO外套细胞系的特异性。将JEKO外套细胞系接种(5X10S个/孔)在平底96-孔微量滴定板上，以一式四份在孔中加入BLyS、rGel、CTP/rGel和rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入75(ilXTT标记混合物，然后再培育细胞4小时。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图10提供了rGel/BLyS融合毒素对地塞米松敏感(MM1.S)和耐受(MM1.R)的多发性骨髓瘤细胞系的剂量-应答曲线。将MM1.S和MM1.R细胞系接种(5乂103个/孔)在平底96-孔微量滴定板上，以一式四份在孔中加入rGel、Dex或rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入75plXTT标记混合物，然后再培育细胞4小时。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图11显示了rGel/BLyS的最大耐受剂量(MTD)。为获得rGel/BLyS的MTD，连续5天将各种浓度的rGel/BLyS以静脉内方式经尾静脉注射入Balb/C小鼠，检测存活小鼠的体重和数量。图12显示了rGel/BLyS对表达BLyS受体的细胞的特异性。(图14A)利用完整的JeKo-l和HL-60细胞通过ELISA测定rGel/BLyS的BLyS组分的受体结合活性部分。(图14B)为测定rGel/BLyS对表达BLyS受体的三种外套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系的特定活性，将JeKo-lMCL细胞系接种(5乂103个/孔)在平底96-孔微量滴定板上，以一式四份在孔中加入BLyS、rGel、CTP/rGel或rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入50plXTT标记混合物，然后再培育细胞4小时。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图13A-13B证明了rGel/BLyS对JeKo-l细胞的竞争性抑制。对于竞争性抑制试验，将JeKo-l细胞接种(5X103个/L)在平底96-孔微量滴定板(BectonDicki歸n)上,用lnMBLyS、50nMBLyS(图15A)、10pg/mlBAFF-R:Fc、10iug/mlTACI:Fc或10pg/mlBCMA:Fc(图15B)预处理2小时，以一式四份在孔中加入rGel、BLyS或rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入50(ilXTT标记混合物(Roche)，然后再培育细胞4小时或过夜。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图14A-14C显示了rGel/BLyS对凋亡途径的作用。(图14A)处理后JeKo-l细胞的显微外观。用100pMBLyS、100pMrGel或100pMrGel/BLyS处理JeKo-l细胞。96小时后，通过TUNEL染色检验JeKo-l细胞的凋亡。(图14B)对随机选择的视野中的凋亡细胞计数(X200)，以百分比表示。为测定rGel/BLyS对凋亡途径的作用，以5Xl()5个/24-孔板接种JeKo-l或Granta519细胞，然后用100pMBLyS、100pMrGel或100pMrGel/BlyS处理。处理后，收集、洗涤细胞，用0.2ml裂解缓冲液裂解。通过8-15n/。SDS-PAGE分级细胞裂解物(50jig)，以电泳方法转移至稳定素-P硝酸纤维素膜。封闭膜，然后用各种抗体检测(图14C)。采用与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体，以ECL检测试剂使免疫反应性蛋白显影。将肌动蛋白用作蛋白质加载的对照。发明详述本说明书中所用的"一个"可表示一个或多个。当本文权利要求书中所用的词汇"一个"与词汇"包括"联用时，可表示一个或多于一个。本文所用的"另一个"可表示至少第二个或更多个。本发明的一些实施方式可由或基本上由一个或多个本发明元件、方法步骤和/或方法构成。考虑了本文所述任何方法或组合物可按照本文所述任何其它方法或组合物来执行。I.定义本文所用的术语"缀合的(conjugated)"在一些实施方式中表示BLyS分子与细胞毒剂分子连接。可通过本领域的任何合适方法进行连接，虽然在具体方面是通过重组、利用接头等进行连接。在具体方面，利用了离子缔合，例如利用亲和素-生物素连接键。II.本发明本发明提供了靶向于展示出BLyS多肽受体的异常增殖B-细胞的组合物。正常增殖的B细胞以及其它类型的细胞不表达BLyS受体。本发明多肽包含作为耙向结构域的BLyS多肽和能降低或消除所耙向细胞增殖的细胞毒性肽。这种多肽对异常增殖的B细胞具有特异性细胞毒性，因此可用于治疗任何B细胞增殖性疾病。本文描述了设计和在治疗中利用这种多肽的方法。III.BLyS蛋白质化合物本发明涉及耙向缀合多肽，具体地说是能赋予对象治疗益处的多肽。在某些实施方式中，本发明涉及包含蛋白质分子的新组合物。某些实施方式考虑了可通过氨基酸残基的缺失、取代或添加修饰该蛋白质化合物。在具体实施方式中，BLyS含有突变，但该分子仍具有结合BLyS受体的活性。所述突变可存在于编码BLyS分子的多核苷酸中。示范性BLyS突变体在Cysl46含有突变(Chen等，2002;2004;2005)，在具体实施方式中，突变是丙氨酸或缬氨酸。本发明所用的BLyS突变体保留了靶向B细胞的能力，例如通过保留与至少一种BLyS受体结合的能力。与野生型BLyS相比，BLyS突变体的任何活性可得到提高，包括通过例如BLyS受体来提高与B细胞结合的能力。此外，蛋白质化合物可包含氨基酸分子，所述氨基酸分子可含有多个多肽实体。本文所用的"蛋白质分子"、"蛋白质组合物"、"蛋白质化合物"、"蛋白质链"或"蛋白质物质"通常指(但不限于)约3-约100个氨基酸的肽、约100个氨基酸以上的多肽和约200个氨基酸以上的多肽或从某基因翻译的全长内源性序列。在本文，上述所有"蛋白质"术语可互换使用。此外，这些术语也可用于缀合多肽或蛋白质缀合物。在某些实施方式中，所述至少一种蛋白质分子的大小可包含但不限于约或至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、兩、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个或更多个氨基分子残基，以及可从中导出的任何范围。因此，术语"蛋白质组合物"包括的氨基分子序列包含天然合成蛋白质的20种普通氨基酸中的至少一种，或至少一种修饰或非天然氨基酸(包括但不限于下表1所示的)。表1修饰的和非天然氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表l修饰的和非天然氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本文所用的"氨基分子"指本领域技术人员已知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方式中，蛋白质分子的残基是连续的，不含中断氨基分子残基序列的任何非氨基分子。在其它实施方式中，序列可含有一个或多个非氨基分子部分。在具体实施方式中，一个或多个非氨基分子部分可中断蛋白质分子的残基序列。本发明的靶向缀合多肽可含有氨基酸缺失和/或取代；因此，含有缺失的蛋白质、含有取代的蛋白质和含有缺失及取代的蛋白质是靶向缀合多肽。在一些实施方式中，这些靶向缀合多肽还可包含插入或添加的氨基酸，例如接头。"靶向融合缺失蛋白"缺乏天然蛋白质的一个或多个残基，但具有天然蛋白质的特异性和/或活性。取代或替代变体通常含有在该蛋白质内的一个或多个位点将一种氨基酸替换为另一种，可将其设计为能调节该多肽的一种或多种特性，特别是提高其效力或特异性。此类型的取代优选是保守性的，即一种氨基酸被一种形状和电荷相似的氨基酸替代。本领域熟知保守性取代，包括，例如以下变化丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。除了缺失或取代，靶向融合蛋白可含有残基插入，通常包括在多肽中加入至少一个残基。这可包括插入靶向肽或多肽，或简单地插入一个残基。下文就末端添加(称为融合蛋白)进行讨论。术语"生物学功能等价物"是本领域熟知的，下文进一步作出定义。因此，(本发明)包括所含氨基酸与天然多肽的氨基酸有约70%-约80%，或约81%-约90%，或甚至约91%-约99%相同或在功能上等价的序列，前提是保留了该蛋白质的生物学活性。靶向融合蛋白可以是其天然对应物的生物学功能等价物。例如，其对于受体结合能力在生物学上等价。在其它实施方式中，本发明缀合多肽对它们受体的亲和力可高于它们的天然对应物。本文所用的术语"功能等价密码子"指编码同一氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的6种密码子，也指编码生物学等价氨基酸的密码子(参见下表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>也应知道氨基酸序列和核酸序列可包含其它残基，例如其它N-或C-末端氨基酸或5，或3，序列，但仍基本上如本文公开序列之一所示，只要所述序列符合上述标准，包括涉及蛋白质表达之处能维持生物学蛋白活性。加入末端序列特别适用于以下核酸序列例如在编码区5'或3，部分的侧翼包含各种非编码序列或可包含已知存在于基因中的各种内部序列，即内含子。下文讨论了根据蛋白质的氨基酸变化来产生等价物或甚至改善的第二代分子。例如，可用其它氨基酸取代蛋白质结构中的某些氨基酸，但与诸如底物分子结合位点的结构的相互结合能力没有明显丧失。因为蛋白质的相互作用能力和性质决定了该蛋白质的生物学功能活性，在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中可作出某些氨基酸取代，而仍能产生具有相似特性的蛋白质。因此，如下文所述，本发明人考虑了可在基因的DNA序列中作出各种变化，而它们的生物学用途或活性没有明显丧失。表2显示了编码具体氨基酸的密码子。在进行这种变化中，应考虑氨基酸的亲水(hydropathic)指数。氨基酸的亲水指数对赋予蛋白质相互作用生物学功能的重要性是本领域公知的(Kyte和Doolittle，1982)。氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白质的二级结构，进而决定该蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用是公认的。本领域也应知道可根据亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。纳入本文作为参考的美国专利4,554,101描述了由其毗邻氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最高局部平均亲水性与该蛋白质的生物学特性相关。美国专利4,554,101详细地给氨基酸残基指定了以下亲水性值精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(陽0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。应该知道可用具有相似亲水性值的另一氨基酸取代某氨基酸，而仍能产生生物学等价和免疫学等价的蛋白质。在这种变化中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸取代，特别优选亲水性值在±1以内的那些，甚至更尤其优选亲水性值在±0.5以内的那些。如上文所概述的，氨基酸取代通常以氨基酸侧链取代基的相对类似性为基础，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到上述各种特征的示范性取代是本领域技术人员熟知的，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。IV.缀合多肽本发明还提供与至少一种药物相连从而形成缀合物的缀合多肽，例如翻译的蛋白质、多肽和肽，通常是单克隆类型。本发明多肽的缀合物包括化学缀合物和"遗传缀合物"，例如重组融合蛋白。也考虑可采用本领域技术人员己知的技术从头合成本发明多肽。A.肽合成可合成本发明缀合多肽。本领域技术人员熟知肽合成技术(Bodanszky等，1976)"PeptideSynthesis"(《肽合成》)，1985;"SolidPhasePeptideSynthelia"(《固相肽合成》)，1984);"TheProteins"(《蛋白质》)，1976)。用于这种合成的合适保护基团可见上述教材以及"ProtectiveGroupsinOrganicChemistry"(《有机化学中的保护基团》，1973)。这些合成方法包括向增长中的肽链中连续加入一个或多个氨基酸残基或适当保护的氨基酸残基。通常利用合适的可选择性除去的保护基团保护第一氨基酸残基的氨基或羧基。对于含有反应性侧链基团的氨基酸(例如赖氨酸)，可利用不同的可选择性除去的保护基团。以固相合成为例，受保护或衍生的氨基酸通过其未保护的羧基或氨基连接于惰性固体支持物。然后选择性除去氨基或羧基的保护基团，混合序列中具有互补基团(氨基或羧基)并适当保护的下一个氨基酸，与已连接于固体支持物的残基反应。然后除去该新加入氨基酸残基上氨基或羧基的保护基团，再加入下一个氨基酸(适当保护的)，依此类推。以合适顺序连接了所有需要的氨基酸后，依次或同时除去任何剩余的末端和侧链基团保护基团(及固体支持物)，从而得到最终的肽。本发明肽优选不含苄基化或甲基节基化的氨基酸。这种保护基团部分可用于合成途径，但使用肽之前除去。如其它地方所述，需要其它反应来形成分子内连接键，从而能约束构象。B.接头/偶联剂多个肽或多肽可通生物学可释放的键(例如可选择性切割的接头或氨基酸序列)而相连。例如，考虑了包含酶的切割位点的肽接头，所述酶最好位于肿瘤环境内或在该环境内有活性。这种肽接头的示范性形式是能用尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶(例如胶原酶、明胶酶或间质溶解素)切割的形式。或者，肽或多肽可连接于佐剂。可利用氨基酸，例如可选择性切割的接头、合成接头或其它氨基酸序列来分离蛋白质部分。此外，虽然已知可成功地利用许多类型的含二硫键接头来缀合毒素部分与靶向药物，但是按照不同的药理学特征和性能，某些接头通常优于其它接头。例如，优选含有空间上"受阻"的二硫键的接头，因为它们在体外更稳定，从而能防止毒素部分在作用位点结合前释放。此外，利用许多毒素部分(包括白树毒蛋白和蓖麻毒蛋白的脱糖基化A链)可了解本发明某些优点。适用于本发明通用准则是适用于本发明中的任何生化交联接头(cross-linker)也可用于本文中，也可考虑其它接头。利用交联剂来形成将两个不同分子的官能团连接在一起的分子桥，例如稳定剂和凝结剂。为一步连接两个不同的蛋白质，可利用能消除有害均聚物形成的异双功能交联接头。考虑了交联接头可与本发明蛋白质分子联用。已将双功能交联剂广泛用于各种目的，包括制备亲和基质，修饰和稳定各种结构，鉴定结合位点和结构研究。在本发明范围内，可利用这种交联接头稳定多肽或使其更可用作治疗剂，例如通过提高修饰蛋白质的靶向能力或总效力。交联接头也可为可切割的接头，例如二硫键、酸敏感的接头和其它接头。已证实携带两个相同官能团的同双功能试剂能高度有效地诱导相同和不同大分子或大分子亚单位之间的交联，以及使多肽与结合伴侣的特异性结合位点相连。异双功能试剂含有两个不同的官能团。利用这两个不同官能团的差别反应性，可有选择地并顺次控制交联。可根据双功能交联剂的官能团(例如氨基、巯基、胍基、刚哚基、羧基特异性基团)的特异性将其分类。在这些交联剂中，涉及游离氨基的试剂特别常用，因为它们可商品化购得、易于合成并且可以在温和的反应条件下应用。大多数异双功能交联剂包含伯氨反应基团和巯基反应基团。另一实例描述了异双功能交联剂和这些交联剂的用法(专门全文纳入本文作为参考的美国专利5,889,155)。交联剂组合了亲核的酰肼残基和亲电的马来酰亚胺残基，从而能将，例如醛与游离巯基偶联在一起。可修饰交联剂来交联各种官能团，因此其可用于交联多肽和糖。在其天然序列中不含有适用于某给定交联剂的残基的具体多肽(例如白树毒蛋白)中，可利用一级序列中的保守性遗传或合成氨基酸变化。本领域己知将多肽与其缀合部分相连或缀合的几种方法。一些连接方法包括利用与多肽相连的金属螯合复合物，该复合物利用，连接于多肽的例如有机螯合剂，如二乙三胺五乙酸酐(DTPA);乙三胺四乙酸(ethylenetriaminetetraaceticacid);N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3oc-6oc-二苯基甘脲-3(各自纳入本文作为参考的美国专利号4,472,509和4,938,948)。多肽也可在有偶联剂，例如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。在有这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备含荧光素标记物的缀合物。在美国专利号4,938,948中，利用单克隆抗体实现乳腺肿瘤成像，可检测的成像部分利用接头(例如对羟基亚氨逐苯甲酸甲酯(methyl-p-hydroxybenzimidate)或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酉旨)与多肽结合。c.成像剂在本发明的一些方面。BLyS多肽与至少一种成像剂缀合。与多肽缀合的成像剂的非限制性例子包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体，例如生物素。如它们与抗体连接的方法一样，本领域已知许多合适的成像剂(参见，例如各自纳入本文作为参考的美国专利号5，021，236;4,938,948和4,472,509)。所用的成像部分可以是顺磁离子；放射性同位素；荧光染料；NMR-可检测物质；X-射线成像。以顺磁离子为例，可以提及的离子的例子有，例如铬(in)、锰(11)、铁(ni)、铁(ii)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、钕(in)、钐(m)、镱(ni)、轧(m)、钒(ii)、铽(m)、镝(m)、钬(ni)和/或铒(m)，其中特别优选钆。可用于其它上下文中(例如x射线成像)的离子包括但不限于镧(m)、金(m)、铅(n)，以及特别是铋(in)。以治疗和/或诊断应用的放射性同位素为例，可以提及的有砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152EU、镓67、3氢、碘123、碘125、碘U1、铟m、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、technici認,和/或钇，1251经常优选用于某些实施方式中，technicium99"1和/或铟m也经常是优选的，因为它们能量低，适合于长期检测。可按照本领域熟知的方法制备本发明放射性标记的单克隆抗体。例如，可将单克隆抗体与碘化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触使之碘化。经常用于结合以金属离子存在的放射性同位素与多肽的中间官能团是二乙三胺五乙酸酐(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。考虑用作缀合物的荧光标记物包括Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade蓝、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon绿488、Oregon绿500、Oregon绿514、Pacific蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。也可利用含有叠氮基的分子，通过低强度紫外线产生的反应性氮宾中间体与蛋白质形成共价键(Potter和Haley，1983)。具体地说，已利用嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物作为定点光探针(photoprobe)来鉴定粗制细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley，1987;Atherton等，1985)。2-和8-叠氮基核苷酸也己用于对纯化蛋白质的核苷酸结合结构域作图(Khatoon等，1989;King等，1989;和Dholakia等，1989)，其可用作结合试剂。V.治疗剂在本发明的具体方面，本发明BLyS多肽与可认为是治疗剂的另一分子缀合。在具体方面，所述治疗剂可以是细胞毒剂、放射性同位素、小分子、化疗剂、促凋亡剂、天然产物、抗体、细胞因子、趋化因子、血管生成抑制剂、程序性细胞死亡调节物，等等。下文讨论了治疗剂的一些例子。A.细胞毒剂本发明利用靶向分子的细胞毒性活性，在具体实施方式中，所述细胞毒性活性可称为毒素。只要不干扰缀合多肽的靶向部分(例如)并且至少能减缓(如果不能完全抑制的话)所靶向细胞的增殖，则任何毒素均适用于本发明。核糖体抑制性毒素(RIT)是真核生物蛋白质合成的强效抑制剂。这些蛋白质的酶结构域起细胞毒性n-糖苷酶的作用，一旦它们进入胞内区室能使催化性核糖体失活。这通过切割28srRNA中4324位腺嘌呤的n-糖苷键来实现，从而明显破坏延长因子的结合位点使核糖体不可逆地失活。从细菌分离的RIT在高等植物中很普遍。在植物中有两种类型I型毒素包含具有核糖体抑制活性的单条多肽链，与I型蛋白质相比，II型毒素具有通过二硫键相连的A链和B链，B链具有细胞结合特性。I型RIT的例子是白树毒蛋白、商陆毒蛋白、天花粉蛋白、曲古克淋、异株泻根毒蛋白、紫茉莉抗病毒蛋白、大麦核糖体失活性蛋白(BRIP)、商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素、丝瓜蛋白和/或木鳖子皂苷。II型毒素包括蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白。毒素可以与本文所述任何多肽缀合或表达为融合蛋白。作为本发明的一部分，以下毒素均适合，例如蓖麻毒蛋白A-链(Burbage，1997)、白喉毒素A(Massuda等，1997;Lidor，1997)、百日咳毒素A亚单位、大肠杆菌内毒素A亚单位、霍乱毒素A亚单位和假单胞菌毒素c-末端。已证明含有融合蛋白可调节白喉毒素A链基因的质粒的转染对癌细胞具有细胞毒性。设想可用于本发明的其它毒素包括相思豆毒蛋白、A/B热不稳定毒素、肉毒毒素、罗马蜗牛素(Helixpomatia)、木菠萝凝集素(Jacalin)或木菠罗、花生凝集素、接骨木黑质(Sambucusnigra)、破伤风(毒素)、(毒素)(ULEX)和槲寄生毒素(Viscumin)。预计任何上述治疗剂可与本发明多肽缀合。在一些情况中，优选重组表达含有其它蛋白质的毒素部分的嵌合型蛋白质。在其它情况中，优选将小分子化合物与本文所述改造的内化(internalizing)多肽化学缀合。在具体实施方式中，毒素包含突变，但该分子仍具有细胞毒性活性。突变可以存在于编码该毒素的多核苷酸中。B.放射性药物许多不同的放射性药物，包括放射性同位素可用于癌症治疗。治疗性应用的放射性同位素的例子包括例如砹211、"铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152铕、镓67、碘123、碘125、碘131、铟"1、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、technidum""1、忆90、镥177、钐153、钬166和锕225。C.化疗剂(Chemopharmaceuticals)术语"化疗"指利用药物来治疗癌症。"化疗剂"用于表示在癌症治疗中给予的化合物或组合物。称为生物化疗(biochemotherapy)的化疗亚类，包括联用化疗与生物治疗。化疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、博莱霉素、白消安、喜树碱、碳铂、瘤可宁、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、雌激素受体结合药物、依托泊苷(VP16)、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异磷酰胺、氮芥、美法仑、丝裂霉素、诺维本、硝基脲(nitrosurea)、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC的水性形式)、反铂(transplatinum)、长春碱、甲氨喋呤、长春新碱或上述药物的任何类似物或衍生变体。按照这些药物在细胞内的活性方式将它们分类，例如它们是否影响细胞周期，影响哪个阶段。或者，可根据其直接交联DNA、插入DNA、或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂异常的能力来表征药物。大多数化疗剂属于以下种类烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂、亚硝基脲、激素药物、杂类药物和它们的任何类似物或衍生变体。化疗剂和给药方法、剂量等是本领域技术人员熟知的(参见，例如Goodman和Gilman，"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"(《治疗学的药理学基础》)和"Remington'sPharmaceuticalSciences"(《雷明顿药物科学》)，相关部分纳入本文作为参考)，并且根据本文内容可与本发明联用。根据所治疗对象的情况，剂量当然会有一些出入。无论如何，负责给药的人应确定每位对象的合适剂量。本文也描述了具体化疗剂和剂量方案的实例。当然，本文所述的所有剂量和药物是示范性而不是限制性的，对于具体患者或应用，技术人员可采用其它剂量或药物。预计这些点之间的任何剂量或可从中导出的范围也可用于本发明。1.烷化剂垸化剂包括但不限于白消安、瘤可宁、顺铂、环磷酰胺(环磷酰胺(cytoxan))、氮烯咪胺、异环磷酰胺、氮芥(氮芥(mustargen))和美法仑。在具体的方面，可联用曲格列酮(troglitazaone)和这些烷化剂的任何一种或多种(下文讨论了一些)来治疗癌症。2.抗代谢物抗代谢物包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西他滨和甲氨蝶呤。嘌呤类似物和相关化合物包括但不限于巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2-脱氧柯福霉素)。巯基嘌呤已用于急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病和慢性粒细胞性白血病。硫鸟嘌呤(Thrioguanine)已用于癌症治疗，例如治疗急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。喷司他丁已用于癌症，例如毛细胞性白血病、蕈样真菌病和慢性淋巴细胞性白血病。有丝分裂抑制剂包括，例如多西他赛、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉酚、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。鬼臼乙叉甙包括，诸如替尼泊苷和VP16的化合物。紫杉烷包括但不限于诸如多西他赛和紫杉醇的化合物。长春花生物碱包括诸如长春碱和长春新碱的化合物。3.抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素具有抗微生物和细胞毒性活性。这些药物也通过化学抑制酶和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。这些药物不是(细胞周期)阶段特异性的，因而它们作用于细胞周期的所有阶段。因此，它们广泛应用于各种癌症。抗肿瘤抗生素的实例包括但不限于博莱霉素、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素(亚得里亚霉素)、普卡霉素(光神霉素)和伊达比星。这些化合物广泛用于赘生物的临床治疗时，一般通过静脉内推注或口服给予。4.激素当使用皮质类固醇激素杀伤或减缓癌细胞生长时，可认为它们是化疗剂。皮质类固醇激素能增加其它化疗剂的效力，因此它们常用于联合治疗。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素的实例。黄体酮，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮己用于子宫内膜癌和乳腺癌。雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二醇已用于例如乳腺癌和前列腺癌的癌症。抗雌激素，例如他莫昔芬已用于例如乳腺癌的癌症。雄激素，例如丙酸睾丸酮和氟氢甲睾酮也已用于治疗乳腺癌。抗雄激素，例如氟他米特已用于治疗前列腺癌。促性腺激素释放激素，例如醋酸亮丙瑞林己用于治疗前列腺癌°5.杂类药物一些化疗剂因其活性而不符合以前分类的条件。它们包括但不限于铂配位络合物、蒽二酮(anthracenedione)、取代的脲、甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、安吖啶、L-天冬酰胺酶和维甲酸。D.天然产物天然产物通常指从天然来源原始分离，且经鉴定具有某药理学活性的化合物。可采用本领域技术人员已知的任何技术从天然来源、化学合成或重组产生这种化合物及其类似物和衍生物。天然产物包括，例如有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物应答调节物等类别。有丝分裂抑制剂包括能抑制细胞分裂或有丝分裂所需蛋白质合成的植物生物碱和其它天然药物。它们在细胞周期的特定阶段起作用。有丝分裂抑制剂包括，例如多西他赛、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉酚、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。紫杉烷是从灰树(ashtree)、短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的树皮分离的一类相关化合物。紫杉烷包括但不限于诸如多西他赛和紫杉醇的化合物。紫杉醇与微管蛋白结合(在与长春花生物碱所用部位不同的部位)，促进微管装配。长春花生物碱是经鉴定具有药学活性的一类植物生物碱。它们包括例如长春碱(VLB)和长春新碱的化合物。E.肽模拟物制备本发明多肽的另一实施方式是利用肽模拟物。模拟物是能模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子。参见，例如纳入本文作为参考的Johnson等，"PeptideTurnMimetics"(肽转角模拟物)，刊于BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY(《生物技术和药学》)，Pezzuto等编，ChapmanandHall，纽约，(1993)。利用肽模拟物的基础原理是存在的蛋白质肽骨架主要以促进分子相互作用的方式定向氨基酸侧链，例如促进抗体和抗原的相互作用。预计肽模拟物能进行类似于天然分子的分子相互作用。可采用这些原理来工程改造第二代分子，使之具有本文所述靶向肽的多种天然特性，但具有改变的和甚至改善的特性。F.抗体在某些实施方式中，使抗体能抵御已鉴定的靶向肽或它们的受体是理想的。可将合适的靶向肽或受体或其部分通过接头、多接头或衍生的氨基酸与一种或多种药物偶联、键合、结合、缀合或化学连接。进行该(操作)能产生双特异性或多价组合物或疫苗。还设想本领域技术人员熟悉制备这些组合物所用的方法，并应适用于给予人对象，即药学上可接受。优选的载体药物是匙孔蜮血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。术语"抗体"用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括抗体片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。本领域熟知制备和利用基于各种抗体的构建物和片段的技术。本领域熟知制备和特征鉴定抗体的方法(参见，例如纳入本文作为参考的Antibodies:ALaboratoryManual(《抗体实验室手册》)，冷泉港实验室，1988)。g.细胞因子和趋化因子在某些实施方式中，将特定生物学活性药物与一种或多种靶向肽偶联以用于靶向递送至器官或组织是理想的。这种药物包括但不限于细胞因子、趋化因子、促凋亡因子和抗血管生成因子。术语"细胞因子"是由一种细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一种细胞的蛋白质的通用术语。这种细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子、生长因子和常规的多肽激素。细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prordaxin);糖蛋白激素，例如促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子(hepaticgrowthfactor);前列腺素；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；OB蛋白；肿瘤坏死因子-OC和-P;苗勒抑制物质；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，例如NGF-P;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-a和TGF-P;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-a、-P和-y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)，例如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18;LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3，血管他丁，血小板反应蛋白，内皮他丁，肿瘤坏死因子和LT。本文所用的术语细胞因子包括天然来源或重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等价物。可利用具有刺激活性或具有生长抑制活性的细胞因子，在具体实施方式中，本发明组合物可利用各种细胞因子。趋化因子通常用作化学引诱物将免疫效应细胞募集至表达趋化因子的部位。联合表达特定的趋化因子基因和例如细胞因子基因来提高将其它免疫系统组分募集至治疗部位是有利的。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIPl-a、MIPl-p和IP-IO。技术人员应知道某些细胞因子也己知具有化学引诱物作用，也能分类为趋化因子。H.程序性细胞死亡调节物凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育、维持成熟组织稳态和抑制癌形成的关键过程(Kerr等，1972)。己证明Bcl-2家族蛋白和ICE样蛋白酶是其它系统中凋亡的重要调节物和效应物。发现与滤泡性淋巴瘤有关的Bel2蛋白在对多种凋亡刺激起反应而控制凋亡和提高细胞存活中起主要作用(Bakhshi等，1985;Cleary禾卩Sklar，1985;Cleary等，1986;Tsujimoto等，1985;Tsujimoto和Croce，1986)。现在认识到进化保守的Bcl2蛋白是可归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂的相关蛋白质家族成员。在发现Bcl2后，已显示了Bcl2起到遏制各种刺激触发细胞死亡的作用。现在已明了存在一族Bcl2细胞死亡调节蛋白，它们具有共有结构和序列同源性。这些不同的家族成员显示具有与Bcl2相似的功能(例如，BclXL、BclW、BclS、Mcl-l、Al、Bfl-l)或抵消Bcl2的功能从而促进细胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。示范性促凋亡剂也包括例如，TNF，任何胱冬酶，包括胱冬酶-3、胱冬酶-7、胱冬酶-6、胱冬酶-9或胱冬酶10a/b，或任何粒酶，包括例如粒酶A或粒酶B。本发明范围所考虑的促凋亡剂的非限制性例子包括短杆菌肽、马加宁、二甲双胍、防卫素、天蚕抗菌肽或它们的组合或混合物。I.血管生成抑制剂在某些实施方式中，本发明涉及给予与抗血管生成药物相连的靶向肽，所述抗血管生成药物为例如血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、血小板因子4、IP-IO、Gro-P、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、多育曲菌素相关蛋白、羧酰氨三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他、聚戊糖聚硫酸酯(pentosanpolysulphate)、血管生成素2(Regeneron)、干扰素隱a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、蛇毒素(accutin)、血管他丁、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。J.剂量技术人员受"Remington'sPharmaceuticalSciences"(《雷明顿药物科学》)，第15版，第33章，特别是第624-652页的指导。根据所治疗对象的状况，剂量肯定会发生一些变化。无论如何，负责给药的人应确定每位对象的合适剂量。此外，对于人体给药，制剂应该符合FDA生物制品标准办公室的无菌、热原质性和总体安全性及纯度标准。本领域技术人员可测定任何上述治疗剂的剂量。在某些实施方式中，合适的剂量可以是给予约0.1mg/kg-约0.3mg/kg或也可给予约1.5mg/m、约2mg/m2。或者，合适剂量可以是约0.1mg/m2、约0.12mg/m2、约0.14mg/m2、约0.15mg/m2、约0.2mg/m2、约0.25mg/m2、约0.5mg/m2、约1.0mg/m2、约1.2mg/m2、纟勺1.4mg/m2、纟勺1.5mg/m2、纟勺2.0mg/m2、纟勺2.5mg/m2、纟勺5.0mg/m2、约6mg/m2、约8mg/m2、约9mg/m2、约10mmg/m2。VI.融合蛋白本发明的其它实施方式涉及融合蛋白。这些分子通常具有靶向肽的全部或关键性部分，在靶向肽的N-或C-末端连接有第二多肽或蛋白质的全部或一部分。例如，融合可利用其它物种的前导肽，从而能在异源宿主中重组表达蛋白质。另一有用的融合包括加入免疫学活性结构域(例如抗体表位)以促进融合蛋白纯化。在融合连接处或其接近之处包含切割位点有助于在纯化后除去外源性多肽。其它有用的融合包括功能性结构域的连接，例如酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号肽或跨膜区。在优选的实施方式中，本发明融合蛋白包含与治疗性蛋白质或肽相连的耙向肽。可掺入融合蛋白的蛋白质或肽的实例包括细胞抑制性蛋白质、细胞杀死蛋白质、促凋亡剂、抗血管生成药物、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、Fab片段抗体、抗原、受体蛋白质、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞黏着蛋白和结合蛋白。这些实例不是限制性的，本发明范围内实际上考虑了可掺入包含靶向肽的融合蛋白的蛋白质或肽。本领域技术人员熟知制备融合蛋白的方法。例如，可利用双功能交联剂的化学连接、通过从头合成完整的融合蛋白、或通过将编码靶向肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列相连然后表达完整的融合蛋白来制备这种蛋白质。VII.合成肽由于本发明靶向肽的尺寸较小，可按照常规技术在溶液或固体支持物上合成它们。各种自动合成仪可商品化购得，可按照已知方案使用。参见，例如各自纳入本文作为参考的Stewart和Young，(1984);Tam等，(1983);Merrifield，(1986);Barany和Merrifield，(1979)。采用这些方法不难制备通常约6个到最多约35-50个氨基酸的短肽序列。或者，可采用重组DNA技术，其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体，将该载体转化或转染入合适的宿主细胞，在适合于表达的条件下培养该宿主细胞。VIII.蛋白质纯化虽然本发明的一些实施方式涉及重组蛋白，但是在一些实施方式中，本发明采用纯化蛋白质(包括重组蛋白)的方法和工艺。这些技术在某一水平上通常包括将细胞环境粗分级为多肽和非多肽组分。将多肽与其它蛋白质分离后，可采用层析和电泳技术进一步纯化感兴趣的多肽，从而实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白质液相层析或甚至是HPLC。此外，实施这些技术的条件可以影响所纯化分子的特征，例如功能活性。本发明某些方面涉及所编码蛋白质或肽的纯化，在具体实施方式中涉及基本上纯化。本文所用的术语"纯化的蛋白质或肽"指可与其它组分分离的组合物，其中所述蛋白质或肽可纯化为相对其天然可获得状态的任何程度。因此纯化的蛋白质或其肽也指脱离其天然产生环境的蛋白质或肽。"基本上纯化的"蛋白质或肽。"纯化的"通常指经分级除去了各种其它组分的蛋白质或肽组合物，所述组合物基本上保留其所表现的生物学活性。当用术语"基本上纯化的"时，该名称所指的组合物中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如构成该组合物中约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、约99.2%、约99.4%、约99.6%、约99.8%、约99.9%或更多的蛋白质。根据本文内容，本领域技术人员将知晓定量测定蛋白质或肽纯度的各种方法。这些方法包括，例如测定活性组分的特定活性，或通过SDS/PAGE分析评估组分内多肽的含量。评估组分纯度的优选方法是计算该组分的特定活性，将该活性与初始提取物的特定活性作比较从而计算纯度，本文通过"纯化倍数"评估。用于表示活性量的实际单位当然取决于纯化后选择的具体分析技术和所表达的蛋白质或肽是否显示可检测活性。本领域技术人员熟知适用于蛋白质纯化的各种技术。这些技术包括，例如用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过加热变性沉淀，然后通过离心；层析步骤，如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和层析；等电点聚焦；凝胶电泳；和这些及其它技术的组合。本领域已知，据信进行各种纯化步骤的次序可以不同，或者可省略某些步骤，但仍能得到制备基本上纯的蛋白质或肽的合适方法。蛋白质或肽无需总以它们最纯的状态提供。实际上，某些实施方式可以利用纯度低于基本上纯化产物的产物。联用较少的纯化步骤部分纯化或采用同一总体纯化方案的不同形式可实现部分纯化。例如，应该知道，利用HPLC装置进行阳离子互换柱层析得到的纯化倍数通常高于利用低压层析系统的同一技术。显示相对纯化程度较低的方法对于蛋白质产物的总回收率，或维持所表达蛋白质的活性较佳。已知多肽的迁移率随不同SDS/PAGE条件而变化，有时变化明显(Capaldi等，1977)。因此，应该知道，在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可以不同。也考虑了联用肽标签和本发明方法及组合物。标签利用了两条多肽间的相互作用。参与所述相互作用的多肽之一的一部分可用作标签。例如，谷胱甘肽S转移酶(GST)的结合区可用作标签，从而可利用谷胱甘肽珠富集含GST标签的化合物。可利用作为抗体或T细胞受体识别的氨基酸区域的表位标签。可利用与编码修饰蛋白的核酸区段操作性相连的核酸区段来编码标签，从而能通过核酸分子编码融合蛋白。其它合适的融合蛋白是含有P-半乳糖苷酶、泛素、六组氨酸(6XHis)等的融合蛋白。IX.核酸分子本发明一方面利用了编码本发明缀合多肽的核酸分子。A.编码缀合多肽的多核苷酸本发明涉及可从细胞分离的多核苷酸，所述多核苷酸不含总的基因组DNA并能表达本发明靶向融合蛋白或多肽的全部或一部分。经操作可编码靶向融合蛋白的多核苷酸可编码天然蛋白。例如，多核苷酸可编码多个部分，如与BLyS靶向多肽共价相连的白树毒蛋白多肽。本申请所用的术语"多核苷酸"指经分离不含总基因组核酸的核酸分子。因此，"编码多肽的多核苷酸"指如下的DNA区段，其是从哺乳动物或人总基因组DNA中分离或纯化的编码多肽的序列。因此，例如当本申请指多核苷酸编码的白树毒蛋白、"天然白树毒蛋白多肽"或"融合白树毒蛋白多肽"的功能或活性时，其表示该多核苷酸编码具有白树毒蛋白酶活性的分子。本文所用的术语"DNA区段"指经分离不含特定物种的基因组总DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA区段指含有野生型、多态性或突变型多肽编码序列，但已从哺乳动物或人的总基因组DNA中分离或纯化的DNA区段。术语"DNA区段"包括一种或多种多肽、小于多肽的DNA区段和重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。术语"cDNA"指利用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或从基因组的未加工或部分加工RNA模板聚合的DNA相反，利用cDNA的优点是cDNA主要含有相应蛋白的编码序列。有时优选全部或部分基因组序列，例如当为最佳表达而需要非编码区，或者在反义方案中要靶向于非编码区，例如内含子时。也考虑了用核酸序列略有不同，但编码同一蛋白质的天然变体代表某给定物种的具体多肽(参见上表1)。类似地，含有分离的或纯化的野生型、多态性或突变型多肽基因的多核苷酸指包含野生型、多态性或突变型多肽编码序列和调节序列(在某些方面)，基本上与其它天然产生的基因或蛋白质编码序列相分离的DNA区段。在此方面，为简明起见，术语"基因"用于指功能性蛋白、多肽或肽编码单元。本领域人员应理解，该功能性术语包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、缀合多肽和突变体的基因组序列、cDNA序列和工程改造的较小基因区段。编码天然或修饰多肽的全部或一部分的核酸可含有编码这种蛋白质的全部或部分的具有以下长度的连续核酸序列约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、歸、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或更多个核苷酸、核苷或碱基对。考虑了一种多核苷酸可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO种或更多种不同的多肽(全部或一部分)。在具体的实施方式中，本发明涉及掺入编码靶向融合多肽或肽的DNA序列的重组载体和分离的DNA区段，所述靶向融合多肽或肽在其氨基酸序列中含有天然多肽或基本上对应于天然多肽的连续氨基酸序列。因此，分离的DNA区段或含有DNA区段的载体可以编码，例如融合白树毒蛋白多肽，该融合多肽具有核糖体灭活活性和对天然白树毒蛋白特异性，并与BLyS多核苷酸(例如，SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示)操作性相连。术语"重组"可与多肽或具体多肽的名称联用，这通常指从经体外操作的核酸分子或这种分子的复制产物产生的多肽。无论编码序列自身的长度多大，本发明所用核酸区段可与其它核酸序列(例如启动子、聚腺苷酸化信号、其它限制性酶切位点、多克隆位点、其它编码区段等)组合，从而使其总长明显不同。因此，考虑几乎可使用任何长度的核酸片段，其中总长度最好限于便于制备和在所需重组方案中的应用。考虑了本发明核酸构建物可编码任何来源的全长多肽或编码该多肽的截短形式，例如截短的白树毒蛋白，从而使得编码区的转录物能代表截短形式。然后可将截短的转录物翻译成截短的蛋白质。或者，为了例如多肽的纯化、转运、分泌、翻译后修饰或为治疗益处(例如耙向性或效力)，核酸序列可编码含额外异源编码序列的全长多肽序列。如上所述，可将标签或其它异源多肽加入修饰多肽编码序列，其中"异源"指不同于该修饰多肽的多肽。在一非限制性例子中，可制备含有与具体基因(例如毒素白树毒蛋白(基因))相同或互补的核苷酸连续延伸段的一种或多种核酸构建物。核酸构建物可以长至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、麵、900、1,000、2,000、3,000、4，000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100,000、250,000、500,000、750,000到至少1,000,000个核苷酸，以及体积更大的构建物，最大和包括染色体大小(包括所有居间长度和居间范围)，假定本领域普通技术人员已知核酸构建物，例如酵母人工染色体的出现。不难理解本文所用"居间长度"和"居间范围"表示包括或介于所引用数值之间的任何长度和范围(即，包括和介于这种数值之间的所有整数)。本文所用的术语"DNA区段"指经分离不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA区段指含有野生型、多态性或突变型多肽编码序列，但己从哺乳动物或人的总基因组DNA中分离或纯化的DNA区段。术语"DNA区段"包括一种或多种多肽、小于多肽的DNA区段和重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。本发明所用DNA区段包括生物学功能等价多肽和肽，例如修饰的功能等价白树毒蛋白毒素或修饰的功能等价BLyS。密码子冗余和己知在核酸序列和由此编码的蛋白质中天然产生的功能等价性导致这种序列的产生。或者，考虑到被替换氨基酸的特性，可应用重组DNA技术产生功能上等价的蛋白质或肽，其中可工程改造蛋白质结构中的变化。可应用定点诱变技术引入人为设计的变化，例如提高蛋白质的细胞毒性或提高涉及该蛋白质的任何治疗方案的效力。B.载体包含在载体中的核酸分子可编码天然和修饰的多肽。术语"载体"用于指可在其中插入核酸序列以引入复制它的细胞的运载体核酸分子。核酸序列可以是"外源性"的，这表示它对于引入载体的细胞而言是外来的，或者该序列对于细胞中的序列是同源的，但其处于宿主细胞核酸中通常未发现该序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(细菌噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员熟知采用Sambrook等，1989和Ausubel等，1996(二者纳入本文作为参考)所述的标准重组技术构建载体。除了编码修饰的多肽(例如修饰的白树毒蛋白)外，载体还可编码未修饰的多肽序列，例如标签或靶向分子。对于为后期纯化和分离或切割而制备谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白，编码这种融合蛋白的有用载体包括pIN载体(Inouye等，1985)，编码组氨酸延伸段的载体和pGEX载体。靶向分子是将修饰的多肽引导至对象体内特定器官、组织、细胞或其它部位的分子。术语"表达载体"指含有编码能被转录的基因产物至少一部分的核酸序列的载体。在一些情况中，RNA分子随后翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情况中，这些序列不翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可含有各种"控制序列"，其指操作性相连的编码序列在具体宿主生物中转录和可能的翻译所需的核酸序列。除调节转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体也可含有起其它功能的下述核酸序列。1.启动子和增强子"启动子"是控制序列，它是控制转录起始和速度的核酸序列的某区域。它可含有能与调节性蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其它转录因子)结合的遗传元件。短语"操作性定位"、"操作性相连"、"控制下"和"转录控制下"表示相对于某核酸序列，启动子处于控制该序列转录起始和/或表达的正确功能位置和/或取向。启动子可以与或不与"增强子"联用，增强子指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。启动子可以与某基因或序列天然结合，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列获得。这种启动子可称为"内源性"的。类似地，增强子可以与某核酸序列天然结合，位于该序列的下游或上游。或者，可通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制可获得某些益处，重组或异源启动子指通常不与其天然环境中的核酸序列结合的启动子。重组或异源增强子也指不与其天然环境中的核酸序列结合的增强子。这种启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，从任何其它原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子和非"天然产生"的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件和/或能改变表达的突变。除合成产生启动子和增强子的核酸序列外，可联用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)和本文所述组合物来制备序列(参见各自纳入本文作为参考的美国专利4,683,202;美国专利5，928，卯6)。此外，考虑也可利用能在非核细胞器，例如线粒体、叶绿体等中指导序列转录和/或表达的控制序列。利用能有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物中表达的启动子和/或增强子当然至关重要。分子生物学领域的技术人员通常知道利用启动子、增强子和细胞类型组合来表达蛋白质，例如参见纳入本文作为参考的Sambrook等，(1989)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在合适条件下可用于指导所引入DNA区段的高水平表达，例如对重组蛋白和/或肽的大规模生产有利。启动子可以是异源的或内源性的。本领域技术人员熟知组织特异性启动子或元件的特性以及表征它们活性的试验。这种区域的实例包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生长抑素受体2基因(Kraus等，1998)、鼠附睾维甲酸-结合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠a2(XI)胶原(Tsumaki等，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)、人血小板内皮细胞黏着分子-1(Almendro等，1996)。下表3显示了考虑用于表达本发明缀合多肽(例如融合蛋白)的启动子。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表3启动子和/或增强子启动子/增强子参考文献血小板衍生生长因子(PDGF)Pech等，1989进行性假肥大性肌营养不良Klamut等，1990SV40Banerji等，1981;Moreau等，1981;Sleigh等，1985;Firak等，1986;Herr等，1986;Imbra等，1986;Kadesch等，1986;Wang等，1986;Ondek等，1987;Kuhl等，1987;Schaffner等，1988多瘤Swartzendruber等，1975;Vasseur等，1980;Katinka等，1980,1981;Tyndell等，1981;Dandolo等，1983;deVilliers等，1984;Hen等，1986;Satake等，1988;Campbell禾口/或Villarreal,1988逆转录病毒Kriegler等，1982，1983;Levinson等，1982;Kriegler等，1983，1984a,b，1988;Bosze等，1986;Miksicek等，1986;Celander等，1987;Thiesen等，1988;Celander等，1988;Choi等，1988;Reisman等，1989乳头瘤病毒Campo等，1983;Lusky等，1983;Spandidos和/或Wilkie，1983;Spalholz等，1985;Lusky等，1986;Cripe等，1987;Gloss等，1987;Hirochika等，1987;Stephens等，1987乙肝病毒Bulla等，1986;Jameel等，1986;Shaul等，1987;Spandau等，1988;Vannice等，1988人免疫缺陷病毒Muesing等，1987;Hauber等，1988;Jakobovits等，1988;Feng等，1988;Takebe等，1988;Rosen等，1988;Berkhout等，1989;Laspia等，1989;Sharp等，1989;Braddock等，1989巨细胞病毒(CMV)Weber等，1984;Boshart等，1985;Foecking等，1986长臂猿白血病病毒Holbrook等，1987;Quinn等，19892.起始信号和内部核糖体结合位点有效地翻译编码序列也可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或毗邻序列。可能需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员不难测定该信号并提供所需信号。人们熟知起始信号必须与所需编码序列的读框"同框"(in-frame)以确保翻译整个插入物。外源性翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可通过包含合适的转录增强子元件提高表达效率。在本发明的某些实施方式中，利用内部核糖体进入位点(IRES)元件产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能绕过5'甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型，在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。小RNA病毒科的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件已见描述(Pelletier和Sonenberg,1988)，哺乳动物信息的IRES也有描述(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源开放读框相连。各自由一个IRES隔开的多个开放读框可以一起转录，产生多顺反子信息。由于IRES元件，核糖体可接近各开放读框从而有效翻译。利用单个启动子/增强子转录一条信息能有效表达多个基因(参见纳入本文作为参考的美国专利号5,925,565和5,935,819)。3.多克隆位点载体可包含多克隆位点(MCS)，其是含有多个限制性酶切位点的核酸区域，其中任一位点可与标准重组技术联用来消化载体(参见纳入本文作为参考的CarbonelH等，1999;Levenson等，1998;和Cocea，1997)。"限制性酶消化"指利用仅在核酸分子中特定位点起作用的酶催化性切割核酸分子。许多这些限制性酶可商品化购得。本领域技术人员普遍知道这种酶的应用。常用能在MCS内切割的限制性酶使载体线形化或片段化，以使外源性序列与载体连接。"连接"指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两片段彼此可以毗连或不毗连。重组
技术领域：
的技术人员熟知涉及限制性酶和连接反应的技术。4.剪接位点大多数转录的真核RNA分子会进行RNA剪接以除去初级转录物的内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保为蛋白质表达而适当加工转录物(参见纳入本文作为参考的Chandler等，1997)。5.终止信号本发明载体或构建物通常包含至少一个终止信号。"终止信号"或"终止子"由参与经由RNA聚合酶特异性终止RNA转录物的DNA序列构成。因此，某些实施方式考虑了使RNA转录物的产生终结的终止信号。体内可能需要终止子来实现所需的信息水平。在真核系统中，终止子区域也可含有能位点特异性地切割新转录物，从而暴露聚腺苷酸位点的特定DNA序列。这向特异性的内源性聚合酶发出信号，从而在转录物的3'端添加约200个A残基(polyA)的延伸段。用该polyA尾修饰的RNA分子显示更稳定，能更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的其它实施方式中，终止子优选包含RNA切割的信号，更优选终止子信号促进信息的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件能用于提高信息水平和/或尽可能减少(表达)盒连读进入其它序列。本发明考虑使用的终止子包括本文所述或本领域技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，如牛生长激素终止子或病毒终止子序列(如SV40终止子)。在某些实施方式中，终止信号可以是因为例如序列截短而造成的缺乏可转录或可翻译序列。6.聚腺苷酸信号在表达期间，特别是真核生物表达期间，常包含聚腺苷酸信号以实现转录物适当聚腺苷酸化。据信，聚腺苷酸化信号的性质不是成功实施本发明的关键，和/或可以利用任何这样的序列。优选的实施方式包括方便和/或已知在各种耙细胞中良好起作用的SV40聚腺苷酸信号和/或牛生长激素聚腺苷酸信号。聚腺苷酸可增加转录物的稳定性或可促进胞质转运。7.复制起点为在宿主细胞中繁殖载体，载体可含有一个或多个复制起始位点(常称为"ori")，所述复制起始位点是一段特定核酸序列，复制在此序列处开始。或者，如果宿主细胞是酵母，可利用自主复制序列(ARS)。8.可选择和可筛选标记在本发明的某些实施方式中，可通过在表达载体中包含标记，在体外或体内鉴定含本发明核酸构建物的细胞。这种标记可赋予细胞可鉴定的变化，从而能方便地鉴定含表达载体的细胞。可选择标记通常是赋予用于选择的某种特性的标记。阳性可选择标记是其存在能用于选择的标记，而阴性可选择标记是其存在能阻止其选择的标记。阳性可选择标记的实例是药物耐受标记。包含药物选择标记通常有助于克隆和鉴定转化子，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇耐受的基因是有用的可选择标记。除了赋予能根据实施条件鉴别转化子的表型的标记外，也考虑了其它类型的标记，包括可筛选标记，例如基于比色分析的GFP。或者，可利用可筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(A)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何利用可能与FACS分析联用的免疫学标记。据信，所用的标记不至关重要，只要它能随编码基因产物的核酸同时表达。本领域技术人员熟知可选择和可筛选标记的其它实例。9.宿主细胞本文所用的术语"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用。所有这些术语也包括它们的后代，即任何及所有后代。应该知道，由于有意或偶发的突变，不是所有的后代都相同。在表达异源核酸序列的上下文中，"宿主细胞"指原核或真核细胞，包括能复制载体和/或表达载体所编码异源基因的任何可转化生物。宿主细胞可以(并且己)用作载体的受体。可以"转染"或"转化"宿主细胞，"转染"或"转化"指将外源性核酸(例如修饰的蛋白质编码序列)转移或引入宿主细胞的过程。转化细胞包括原代对象细胞及其后代。根据所需结果是复制载体还是表达载体所编码核酸序列的一部分或全部，宿主细胞可源自原核生物或真核生物，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，它们可从作为活培养物或遗传材料的存档机构的美国模式培养物保藏所(ATCC)(www.atcc.org)获得。本领域技术人员根据载体骨架和所需结果可确定合适的宿主。例如，可将质粒或粘粒引入原核宿主细胞以复制许多载体。作为宿主细胞来复制和/或表达载体的细菌细胞包括DH5a、JM109和KC8，以及许多可商品化购得的细菌宿主，例如SURE感受态细胞和SolopackGoldCells(Stratagene,LaJolla)。或者，可将细菌细胞(例如大肠杆菌LE392)用作噬菌体病毒的宿主细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母OS"acc/arom;;cejcerev^/ae)、粟酒酵母(Sacc/zaromj/c";omZe)禾口巴其万德毕赤酵母(/7c/7/fl/aWon力。用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的实例包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。可利用来自各种细胞类型和生物的许多宿主细胞，本领域技术人员已知这些细胞。类似地，可将病毒载体与真核或原核宿主细胞一起使用，特别是能复制或表达载体的细胞。一些载体可利用能使其在原核细胞和真核细胞中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员还应知道维持所有上述宿主细胞及复制载体的培养条件。也应理解和知道能大规模制备载体以及制备载体所编码核酸及其相关多肽、蛋白质或肽的技术和条件。10.表达系统存在的许多表达系统包含上述组合物的至少一部分或全部。本发明可利用原核和/或真核系统产生核酸序列或它们的相关多肽、蛋白质和肽。许多这些系统可商品化购得并广泛应用。昆虫细胞/杆状病毒系统可产生异源核酸区段的高水平蛋白质表达，例如纳入本文作为参考的美国专利号5，871，986;4,879,236所述，如购得的名为I而TROGEN⑧的MAXBAC2.0禾口C腦TECH⑧的BACPACKTM杆状病毒表达系统。除本发明公开的表达系统外，表达系统的其它例子包括STRATAGENE的COMPLETECONTROlJM可诱导哺乳动物表达系统(包括合成的蜕皮素可诱导受体)，或其PET表达系统，大肠杆菌表达系统。可诱导表达系统的另一例子是携带T-REXTM(四环素-调节的表达)的系统(可获自INVITROGEN),该系统是利用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达系统。INVITR0GE^也提供称为甲醇毕赤酵母(尸/c/n'fl^7"/^"0/^0)表达系统的酵母表达系统，该系统设计为在甲基营养酵母(methylotrophicyeast)嗜甲毕赤酵母中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员应知道如何表达载体(例如表达构建物)来产生核酸序列或其相关多肽、蛋白质或肽。11.病毒载体将表达载体引入细胞的方法有许多种。在本发明的某些实施方式中，表达载体包含病毒或衍生自病毒基因组的工程改造载体。用作基因载体的第一种病毒是DNA病毒，包括乳多空病毒(猿病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤)(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986)。对于外来DNA序列，这些病毒的容量较低，宿主谱有限。此外，它们的致癌可能性和细胞病变效应在受纳细胞中会产生安全顾虑。它们只能容纳最多8kb的外来遗传材料，但能方便地引入各种细胞系和实验动物中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin，1986)。逆转录病毒是特征在于能在受感染细胞中将其RNA转化为双链DNA的一族单链RNA病毒；它们也能用作载体。可利用其它病毒载体作为本发明的表达构建物。可使用源自病毒的载体，例如源自牛痘病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986;Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988;Baichwal禾口Sugden，1986;Hermonat和Muzycska,1984)和疱疹病毒的载体。对于各种哺乳动物细胞，这些载体提供了几种有吸引力的特征(Friedmann，1989;Ridgeway，1988;Baichwal禾卩Sugden，1986;Coupar等，1988;Horwich等，1990)。X.治疗方法设想用于治疗性应用的本发明分子，例如蛋白质缀合物，是保留了BLyS部分的特异性与毒素或治疗剂的细胞毒性潜能的分子。考虑了将本发明多肽以治疗有效量给予需要的患者。本文所用的术语"治疗有效的"指改善某疾病相关的一些症状所需的化合物用量。例如，在癌症治疗中，改善癌症至任何程度或使癌症的任何症状停滞的化合物是治疗有效的。例如，癌症的改善可以是抑制癌细胞和/或组织的血管生成，抑制或减缓细胞生长，促进细胞死亡或它们的组合。治疗有效量的化合物不要求治愈疾病，但能提供对某疾病的治疗。预计本发明多肽可用于治疗B-细胞性慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤B-细胞性前淋巴细胞性白血病、免疫细胞瘤/淋巴浆细胞性淋巴瘤(+/-瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、外套细胞性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)型的边缘区B-细胞性淋巴瘤、脾边缘区B-细胞性淋巴瘤(+/-绒毛状淋巴细胞)、毛细胞性白血病、弥散性大B-细胞性淋巴瘤、纵膈(胸腺)大B-细胞性淋巴瘤、血管内大B-细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤(多发性骨髓瘤)、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、无痛性骨髓瘤、郁积性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、浆细胞性白血病、非分泌性骨髓瘤、浆细胞瘤、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病(HCD)、免疫球蛋白沉积病、全身性轻链病和原发性淀粉样变性。在优选的实施方式中，本发明多肽用于治疗人类。XI.联合治疗/癌症治疗为增强本发明缀合多肽或编码其的表达构建物的效力，可能需要将这些组合物与治疗B-细胞增殖性疾病有效的其它药物(例如抗癌药物)联用。实际上，在具体实施方式中，本发明缀合多肽与一种或多种化疗剂联用，从而能有效地将该化疗剂递送至细胞上，包括敏感的或耐受的细胞。除另一种癌症治疗外，例如放疗、外科手术、基因疗法等等，可单独给予缀合多肽或与一种或多种化疗剂联合给予患有B-细胞增殖性疾病的个体。"抗癌"药物在对象中能负面影响癌症，例如通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制癌症发展或增长癌症患者的寿命。更具体地说，这些其它组合物可以能有效杀伤或抑制细胞增殖的用量提供。该方法包括使细胞同时与表达构建物和一种或多种药物或多因子接触。这可通过使细胞与一种组合物或包含两种药物的药学制剂接触，或通过使细胞同时与两种不同的组合物或制剂接触来实现，其中一种组合物含有表达构建物，另一种含有第二药物。对化疗和放疗药物耐受的肿瘤细胞代表临床肿瘤学的主要问题。目前癌症研究的目的之一是发现通过将化疗和放疗与另一种治疗联合来提高化疗和放疗效力的方法。例如，当通过逆转录病毒载体系统将单纯疱疹-胸苷激酶(HS-tK)基因递送至脑肿瘤时，其成功地诱导了对抗病毒药物更昔洛韦的敏感性(Culver等，1992)。除其它促凋亡或细胞周期调节药物外，在本发明上下文中，考虑了可类似地联用缀合多肽与化疗、放疗、基因疗法或免疫治疗干预。所述治疗可以数分钟到数周为间隔在其它药物治疗之前或之后进行。在将其它药物和缀合多肽分别施用于细胞的实施方式中，通常应确保未超出每次递送时间之间的有效时间，从而使得药物和表达构建物能对细胞施加有利的并用效果。在这种情况中，考虑了在彼此间约12-24小时内，更优选在彼此间约6-12小时内使细胞与两种药征(modality)接触。然而，在各给药之间是几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)间隔的一些情况中，需要明显延长治疗时间段。可采用各种组合，其中缀合多肽治疗是"A"，第二药物，例如放疗或化疗是例如"B":A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A考虑到载体的毒性(如果有的话)，可根据给予化疗剂的通用方法给予患者本发明治疗性表达构建物。估计如果需要可重复该治疗周期。也考虑了可将各种标准治疗以及外科手术干预与所述过度增殖性细胞治疗联用。A.化疗癌症治疗也包括联用化学或放射治疗的各种组合治疗。联合化疗包括，例如顺铂(CDDP)、碳铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异磷酰胺、美法仑、瘤可宁、白消安、硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合药物、紫杉酚、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨喋呤，或上述药物的任何类似物或衍生变体。B.放疗导致DNA损伤并广泛应用的其它因素包括通常称为Y-射线、X-射线和/或将放射性同位素直接递送至肿瘤细胞的那些因素。也考虑了其它形式的DNA损伤因素，例如微波和紫外辐射。所有这些因素很可能对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持施加了广泛的损伤作用。X-射线剂量范围从用于长期(3-4周)的50-200伦琴的每日剂量到2000-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围取决于同位素的半衰期、所发出辐射的强度和类型、肿瘤细胞的摄取而极为不同。当术语"接触"和"暴露"应用于细胞时，其在本文用于描述将治疗性构建物和化疗或放疗药物递送至靶细胞或置于与靶细胞直接毗邻的位置上的过程。为实现细胞杀伤或停滞，将组合用量的两种药物递送至细胞，该组合用来有效杀伤细胞或防止其分裂。C.免疫疗法免疫疗法通常依赖于免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。例如，免疫效应物可以是肿瘤细胞表面一些标记的特异性抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物或它可募集其它细胞从而实际上影响细胞杀伤。也可将抗体与药物或毒素(化疗、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，而抗体只是用作靶向物质。或者，效应物可以是携带能直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。因此，免疫疗法可用作联合治疗的一部分而与基因疗法联用。联合治疗的通用方法如下文所述。肿瘤细胞一般必须携带适合于靶向的一些标记(即不存在于大多数其它细胞上)。肿瘤标记有许多，在本发明范围中任何这些标记适用于靶向。常规肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和pl55。D.基因在还有另一实施方式中，第二治疗是基因疗法，其中治疗性多核苷酸在给予本发明缀合多肽之前、之后或同时给予。联合递送缀合多肽和编码以下基因产物之一的第二载体对靶组织具有联合的抗-过度增殖作用。或者，可利用编码两种基因的一种载体。本发明包括各种蛋白质，其中一些如下所述。1.细胞增殖诱导物诱导细胞增殖的蛋白质按照功能还属于各种类别。所有这些蛋白质的共性是它们能调节细胞增殖。例如，PDGF的一种形式，sis癌基因是分泌的生长因子。癌基因很少源自编码生长因子的基因，sis是目前唯一己知的天然产生的致癌生长因子。本发明的一个实施方式中，考虑利用细胞增殖的具体诱导物的反义mRNA来防止该细胞增殖诱导物的表达。蛋白质FMS、ErbA、ErbB和neu是生长因子受体。这些受体突变导致可调节功能丧失。例如，影响Neu受体蛋白跨膜结构域的点突变导致neu癌基因。erbA癌基因源自甲状腺激素的胞内受体。据信，修饰的致癌性ErbA受体与内源性甲状腺激素受体竞争，从而导致生长不受控。最大一类癌基因包括信号转导蛋白(例如，Src、Abl和Ras)。蛋白Src是胞质蛋白-酪氨酸激酶，在一些情况中其通过酪氨酸残基527的突变从原癌基因转化为癌基因。相反，在一个实例中，GTP酶蛋白ras序列中的氨基酸12从缬氨酸突变为甘氨酸导致其从原癌基因转化为癌基因，从而降低了GTP酶活性。与转录因子一样，蛋白Jun、Fos和Myc是对核功能直接施加影响的蛋白质。2.细胞增殖抑制剂肿瘤抑制癌基因起到抑制细胞过度增殖的作用。这些基因的灭活破坏了它们的抑制活性，从而导致增殖不受控。肿瘤抑制物p53、pl6和C-CAM如下所述。在化学致癌作用、紫外辐射和几种病毒转化的许多细胞中发现了高水平的突变型p53。在各种人肿瘤中，p53基因是突变灭活的常见耙位，该基因早已证实是普通的人癌症中最频繁突变的基因。它在超过50。/。的人NSCLC(Hollstein等，1991)和广泛的其它肿瘤中发生突变。p53基因编码能与宿主蛋白(例如大T抗原和E1B)形成复合物的393个氨基酸的磷蛋白。在正常组织和细胞中发现该蛋白，但与转化的细胞或肿瘤组织比较，其浓度极低。野生型p53被认为是许多细胞类型中重要的生长调节物。错义突变对于p53基因常见，对于癌基因的转化能力至关重要。点突变促使的单一遗传变化能产生致癌性p53。然而，与其它癌基因不同，已知p53点突变发生在至少30个不同的密码子中，常产生细胞表型改变而纯合性不降低的显性等位基因。此外，这些显性负等位基因中有许多显示在生物中耐受并能在种系中传递。各种突变型等位基因出现的范围从最低限度的功能失调到强烈渗透的显性负等位基因(Weinberg,1991)。另一种细胞增殖抑制剂是pl6。细胞周期蛋白依赖性激酶或CDK触发真核细胞周期的主要转变。一种CDK，细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)调节Gl期的进展。该酶的活性是在G1后期磷酸化Rb。CDK4的活性受活化亚单位——D-型细胞周期蛋白和抑制性亚单位——pl6INK4(己通过生物化学方法特征鉴定为特异性结合并抑制CDK4的蛋白)的控制，从而可调节Rb磷酸化(Serrano等，1993;Serrano等，1995)。由于pl6INK4蛋白是CDK4抑制剂(Serrano,1993)，使该基因缺失可提高CDK4的活性，从而导致Rb蛋白高度磷酸化。p16也已知能调节CDK6的功能。pl6INK4属于一类新揭示的CDK-抑制性蛋白，该类蛋白也包括pl6B、pl9、p21WAFl和p27KIPl。pl6INK4基因作图定位于9p21，这是在许多肿瘤类型中常缺失的染色体区域。人肿瘤细胞系中常发现pl6INK4基因的纯合缺失和突变。该证据提示pl6INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，原代未培养肿瘤中pl6INK4基因的变化频率远低于培养的细胞系的观察结果挑战了这种解释(Caldas等，1994;Cheng等，1994;Hussussian等，1994;Kamb等，1994;Kamb等，1994;Mori等，1994;Okamoto等，1994;Nobori等，1995;Orlow等，1994;Arap等，1995)。通过用质粒表达载体转染来恢复的野生型pl6INK4功能降低了一些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994;Arap，1995)。本发明可用的其它基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/pl6融合体、p21/p27融合体、抗-血栓形成基因(例如，COX-l、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、参与血管生成的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或它们的受体)和MCC。3.程序性细胞死亡的调节物凋亡或程序性细胞死亡对于正常的胚胎发育、维持成熟组织中稳态和抑制癌形成至关重要(Kerr等，1972)。Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶己证实是其它系统中凋亡的重要调节物和效应物。发现与滤泡性淋巴瘤有关的Bel2蛋白在应答多种凋亡刺激而控制凋亡和提高细胞存活中起主要作用(Bakhshi等，1985;Cleary禾口Sklar，1985;Cleary等，1986;Tsujimoto等，1985;Tsujimoto禾口Croce，1986)。现在认识到进化保守的Bcl2蛋白是可归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂的相关蛋白质家族的成员。在发现Bcl2后，已显示其起到遏制各种刺激触发的细胞死亡的作用。现在明显也有一族Bcl2细胞死亡调节蛋白，它们具有共有结构和序列同源性。这些不同的家族成员显示具有与Bcl2相似的功能(例如，BclXL、BclW、BclS、Mcl-l、Al、Bfl-l)或抵消Bcl2的功能从而促进细胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。e.外科手术约60%患癌症的人会接受某些类型的外科手术，包括预防性、诊断性或分期的(staging)、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可与其它治疗(例如本发明治疗、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或其它疗法)联用的一种癌症治疗方法。本发明嵌合分子可用作新辅助手术疗法(neoadjuvantsurgicaltherapy),例如在切除前减小肿瘤体积，或者可用作手术后辅助疗法(postadjuvantsurgicaltherapy),例如在除去部分或所有肿瘤之后稳定外科床(surgicalbed)。治愈性手术包括切除术，其中物理除去、割除和/或破坏了所有或部分癌组织。肿瘤切除术指物理除去肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除术外，外科手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制的手术(Mohs外科手术)。还考虑了可将本发明与除去浅表癌症、初癌或附带量的正常组织联合应用。切除部分或所有癌细胞、组织或肿瘤后，体内可能形成空腔。可采用其它抗癌症疗法通过该区域的灌注、直接注射或局部涂布实现治疗。这种治疗可重复进行，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗的剂量也可以不同。f.其它药物考虑了联用其它药物与本发明以提高治疗的疗效。这些其它药物包括免疫调节药物、影响上调细胞表面受体和GAP连接的药物、细胞稳态和分化药物、细胞黏着抑制剂或提高过度增殖性细胞对凋亡诱导物的敏感性的药物。免疫调节药物包括肿瘤坏死因子；干扰素a、(3和y;IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1(3、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。还考虑了上调细胞表面受体或它们的配体(例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL)可通过对过度增殖性细胞产生自分泌或旁分泌作用来加强本发明的凋亡诱导能力。通过增加GAP连接数目来提高细胞间信号转导可增强对毗邻过度增殖性细胞群的抗过度增殖效力。在其它实施方式中，联用细胞稳态或分化药物与本发明可提高治疗的抗过度增殖效力。考虑了细胞黏着抑制剂能提高本发明效力。细胞黏着抑制剂的例子是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他丁。还考虑了联用能提高过度增殖性细胞对凋亡的敏感性的其它药物，例如抗体c225与本发明可提高疗效。也可联用激素疗法与本发明或以前描述的任何其它癌症疗法。在某些癌症，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌的治疗中可利用激素来降低某些激素，例如睾酮或雌激素的水平或阻断其作用。该治疗常与至少一种其它癌症疗法联用作为治疗选择或降低转移风险。XII.药物组合物和给药途径本发明考虑了编码融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中将药物组合物给予对象。本发明的不同方面包括给予有效量的水性组合物。这种组合物通常溶解于或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。此外，按照所治疗的疾病或状况，这种组合物可与另一种治疗联合给予。淋巴瘤治疗可包括给予化疗、放疗、免疫疗法或激素。本领域技术人员熟知如何将基因递送至体内和离体位置。对于病毒载体，通常制备病毒载体储备物。根据病毒的类型和可获得的滴度，可向患者递送1-100、10-50、100-1000、或最多1X104、1X105、1xio6、1xio7、1X108、1X109、1X101Q、1XIO"或1X1012个感染性病毒颗粒。对于脂质体或其它非病毒制剂，通过比较相对摄取效率可外推类似的数目。下文讨论了作为药学上可接受组合物的制剂。短语"药学上可接受的"或"药理学上可接受的"指适当地给予动物或人时不产生相反、过敏或其它不利反应的分子实体和组合物。本文所用的"药学上可接受的载体"包括任何与所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。本领域熟知利用药学活性物质的这些介质和试剂。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗性组合物中的应用。补充性活性成分(例如其它抗癌药物)也可掺入组合物。可将本发明活性化合物配制用于胃肠外给药，例如配制用于经静脉内、肌肉内、胸腔内、皮下或甚至腹膜内途径注射。根据上文，本领域技术人员可以知道含有能提高I类MHC分子表达的一种或多种化合物的水性组合物的制备方法。一般可将这些组合物制备为可注射的，液体溶液或悬浮液；也可制备为适用于在注射前加入液体而制成溶液或悬浮液的固体形式；这些制剂也可以乳化。可在水中适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合制备作为游离碱或药学上可接受的盐形式的活性化合物溶液。也可用甘油、液体聚乙二醇和它们的化合物和油中制备分散液。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适用于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于无菌可注射溶液或分散液的即配制剂的无菌粉末。在所有情况中，(药物)形式必须无菌，必须是其流动性达到可易于注射的液体。它在生产和储存条件下也应该稳定，保藏时必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。可将活性化合物配制成中性或盐的形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，所述酸加成盐用无机酸(例如盐酸或磷酸)，或用有机酸(例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可源自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)，和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等)。载体也可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如可利用包衣(如卵磷脂)，在分散液的情况中维持所需粒径，和利用表面活性剂来维持适当的流动性。可利用各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物作用。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可利用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)的组合物来实现可注射组合物的延长吸收。在合适溶剂中将需要量的活性化合物视需要与上述各种其它成分掺合，然后除菌过滤来制备无菌可注射溶液。通常将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和所需要的上述其它成分的无菌载体来制备分散液。以制备无菌可注射溶液的无菌粉末为例，优选的制备方法是能得到活性成分粉末的真空干燥和冻干技术，加上事先经除菌过滤的任何其它所需成分的溶液。可经由任何常规途径给予本发明治疗性组合物，只要经由该途径可到达耙组织。在将本发明用作病毒载体的情况中，主要考虑该载体所携带异源序列的所需位置。给药途径包括口服、鼻部、颊部、直肠、阴道或局部给药。或者可通过常位、真皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射给药。这种组合物通常作为含有药学上可接受的载体、缓冲液或其它赋形剂的药学上可接受的组合物给予。对于治疗肺部病症，考虑以气溶胶形式递送至肺部。气溶胶的体积介于约O.Olml-0.5ml之间。类似地，治疗结肠相关疾病的治疗方法可以利用灌肠剂。灌肠剂的体积介于约lml-100ml之间。直接肿瘤内注射是优选的模式，更具体的实施方式是连续肿瘤内灌注。某些实施方式可能需要连续供给患者治疗性组合物。对于静脉内或动脉内途径，利用滴注系统实现。对于局部涂布，可采用反复涂布。对于各种方法，可利用缓释制剂在一段时间内和延长的时间段内提供有限但恒定量的治疗剂。对于内用，优选用，例如携带异源核酸区段的病毒载体连续灌注感兴趣区域。在一些情况中，手术后可通过导管插入术，然后连续给予治疗剂来实现。临床医师可根据具体患者和状况来选择灌注时间，但时间可以是从约1-2小时、到2-6小时、到约6-10小时、到约10-24小时、到约1-2天、到约1-2周或更长时间。经由连续灌注的治疗性组合物剂量通常等于按照给予注射的时间调整的一次或多次注射给予的剂量。然而，相信通过灌注可得到较高的剂量。对于水溶液的胃肠外给药，例如，溶液应视需要适当缓冲，首先用足够的盐水或葡萄糖赋予液体稀释剂等渗性。这些具体水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而论，本领域技术人员鉴于本文内容应知道可使用的无菌水性介质。例如，可将一份剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液，加入1000mL皮下输液液体或在打算输注的部位进行注射(参见，例如"Remington'sPharmaceuticalSciences"(《雷明顿药物科学》)，1990)。根据所治疗对象的状况，剂量必定会有一些差异。无论如何，负责给药的人应确定每位对象的合适剂量。可根据所需目的决定治疗性组合物的有效量。术语"单位剂量"或"剂量"指适用于对象的物理上不连续的单位，各单位含有预定量治疗性组合物，其经计算用于产生与其给药(即合适的途径和治疗方案)相关的上述所需反应。按照治疗次数和单位剂量的给药量取决于所需的保护作用。治疗性组合物的精确用量也取决于医师的判断，并因人而异。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状况、给药途径、治疗的所需目的(缓解症状与治愈)和具体治疗性物质的效力、稳定性及毒性。配制后，以与剂量制剂相容的方式和治疗有效量给予溶液。可采用各种剂型方便地给予制剂，例如上述可注射溶液的类型，但也可利用药物释放胶囊等。本文所用的术语"体外给予"指对取自动物的细胞进行的操作，包括但不限于培养的细胞。术语"离体给予"指已在体外进行操作，然后给予活动物的细胞。术语"体内给予"包括对动物体内的细胞进行的所有操作。在本发明的某些方面，可以体外、离体或体内给予组合物。在某些体外实施方式中，可将编码修饰的蛋白质的表达构建物转导入宿主细胞。然后可将转导的细胞用于体外分析或者体内给予。纳入本文作为参考的美国专利号4，690，915和5,199,942公开了用于治疗性应用的血液单核细胞和骨髓细胞的离体操作方法。也考虑了本发明组合物的体内给予。例子包括但不限于通过囊内导管插入术将本发明转导组合物给入膀胱来转导膀胱上皮细胞(Bass，1995)，通过导管经门静脉输注合适的转导组合物来转导肝细胞(Bao，1996)。其它例子包括用即时转导组合物直接注射肿瘤，和鼻内或气管内(Dong，1996)滴注转导组合物来影响肺细胞的转导。可通过以下方式给予本发明(组合物)静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、伤口内、颅内、关节内、前列腺内(intraprostaticaly)、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠、外用、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、囊内(intravesicularlly)、粘膜、心包内、口服、外用、局部和/或利用气溶胶、注射、输注、连续输注、直接或经导管和/或灌洗来的局部灌注浸浴耙细胞(bathingtargetcell)。XIII.本发明试剂盒可将本文所述的任何组合物装在试剂盒中。在一个非限制性实例中，BLyS缀合物和任选的其它药物可装在试剂盒中。因此，这些试剂盒可在合适的容器装置中装有本发明的BLyS缀合物和任选的其它药物。无论标记或未标记的)。试剂盒的各组分可包装成水性介质或冻干形式。这些试剂盒的容器装置通常包括盛放组分(优选合适等分)的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置。当试剂盒中有多种组分时，试剂盒通常也装有分别盛放其它组分的第二、第三或其它额外的容器。然而，可将组分的各种混合物装在一个小瓶中。本发明试剂盒通常也密封装有商业出售的包含BLyS缀合物、其它药物的装置和任何其它试剂容器。这种容器可包括装有所需小瓶的注射或吹塑的塑料容器。本发明治疗性试剂盒是装有BLyS缀合物的试剂盒，通常在合适的容器装置中装有其药学上可接受的制剂。所述试剂盒可装有一个容器装置和/或各化合物可具有不同的容器装置。当用一种和/或多种液体溶液提供试剂盒的各组分时，所述液体溶液是水溶液，优选无菌水溶液。也可将一种或多种BLyS缀合物成分配制成可注射组合物。在此情况中，容器装置本身可以是能将制剂应用至身体受感染的区域、注射入动物和/或甚至应用于和/或与试剂盒其它组分混合的注射器、移液管和/或其它类型的装置。然而，试剂盒各组分可以干粉形式提供。当以干粉提供各试剂和/或组分时，可加入合适的溶剂重建粉末。预计溶剂也可在另一容器装置中提供。这些试剂盒也可装有第二容器装置来包含无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其它稀释剂。本发明试剂盒通常也密封装有商业出售的包含各小瓶的装置，例如，装有所需小瓶的注射或吹塑的塑料容器。无论容器的数目和/或类型，本发明试剂盒也可包括和/或包装有协助将最终组合物注射/给予和/或置于动物身体和/或动物体内的工具。这种工具可以是注射器、移液管、镊子和/或任何这种医学上批准的递送载体。因此，在本发明的具体实施方式中，组合物包含在药学上可接受的载体中和/或经适当等分以递送至个体。实施例给予以下实施例来示范本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该知道以下实施例所公开的技术代表本发明人发现的能在本发明实施中良好起作用的技术，因此可以认为构成其优选实施方式。然而，鉴于本文内容，本领域技术人员应该知道可在公开的具体实施方式中作出许多变化，但仍能得到类似或相似的结果而不脱离本发明构思和范围。实施例1设计重组白树毒蛋白(rGdonin)/BLyS多肽采用剪接重叠延伸PCR(OE-PCR)方法(Higuchi等，1988)，以Blys和重组白树毒蛋白DNA作为模板将编码人BLys和重组白树毒蛋白的cDNA融合在一起。采用OE-PCR方法，以BLys和重组白树毒蛋白的整个编码区作为DNA模板扩增各基因片段，来制备取向A(BLys-rGel)或取向B(rGd-BLys)的融合蛋白。为构建BLys-rGel，利用寡核苷酸引物PETBLysFor，(5,-GGCGGAAGCGGTACCGACGACGACGACAAGGCCGTTCAGGGTCCA-3，SEQIDNO:12)和BLysBacLink，(5，-GCTCCCGCCTCCCCCCAGCAGTTTCAATGC-3'SEQIDNO:13)从BLys基因的N-末端部分扩增编码肠激酶消化位点和限制性酶尺PWI的上游OE-PCR片段。利用寡核苷酸引物LinkRgel，(5'-GGGGGAGGCGGGAGCGGCCTGGACACCGTG-3'SEQIDNO:14)和RGelBac，(5，-GCTCGTGTCGACCTCGAGTCATTATTTAGGATCTTTATC-3'SEQIDNO:15)从重组白树毒蛋白基因扩增编码G4S接头和限制性酶X/wI的毗邻下游OE-PCR片段。然后利用侧接5'-和3，-端的寡核苷酸引物对PETBLysFor和RGelBac(见上文)，通过额外的PCR步骤将上游和下游OE-PCR片段重新装配为编码融合蛋白的全长融合BLys-rGel基因。纯化最终的PCR片段，用《/>WI和XAoI限制性内切核酸酶切割，然后克隆入利用T7启动子控制所插入融合基因转录的Novagen表达载体pET-32a中。先通过DNA测序验证融合BLys-rGel基因构建物，再表达蛋白质。对于取向B，RGel-BLys，DNA操作中采用上述方法，上游片段利用寡核苷酸引物PETGdFor，GAGC-3'SEQIDNO:16);RGelBacLink，(5，-GCTCCCGCCTCCCCCTTTAGGATCTTT-3，SEQIDNO:17);下游片翻用BLysFor,(5，-GGGGGAGGCGGGAGCGCCGTTCAGGGTCCA-3'SEQIDNO:18);BLysRev，(5'國GCCGTCGACCTCGAGTCATTACAGCAGTTTCAATGC-3，SEQIDNO:19)。利用寡核苷酸引物对PETGelFor和BLysRev，通过额外的PCR步骤扩增最终基因融合片段。然后将构建物转化入大肠杆菌菌株AD494(DE3)pLysS来表达融合蛋白。实施例2化学缀合BLYS和重组白树毒蛋白和纯化BLYS/RGEL化学缀合物如上所述产生含有用于位点特异性缀合的额外半胱氨酸残基的重组白树毒蛋白(rGel)，如前所述(Rosenblum等，1991;Mujoo等，1995;Rosenblum等，1996)利用SPDP将其与BLyS缀合。利用组合了凝胶渗透(S-200)和亲和(BlueSepharose)层析的快速蛋白质液相层析系统(Pharmacia，纽约，纽约州)纯化化学缀合物BLyS/rGel。采用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评估BLyS/rGel缀合物的纯度。实施例3细胞毒性研究下表4概述了用rGd/BLyS融合蛋白进行的各种细胞毒性研究的结果。表4.BLyS、BAFF-R、TACI、BCMA的表达和rGel/BLyS对各种类型细胞系的比较性IC^值细胞系细胞类型BLyS~~BAFF-R~~TACI~~BCMAIC50(nM)耙向指断(bp)313256196285rGelrGel/BLySJurkat急性T细胞性白血病+-3,0001,5002.0KBM-5髓细胞性白血病++--250703.6THP-1急性单核细胞性白血病+++--110303.7HL-60急性前髓细胞性白血病+++--1,0003003.3IM-9多发性骨髓瘤++++++700200MM1.S多发性骨髓瘤++++6002202.7<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>靶向指数代表rGel/IC5。ofrGd/BLyS的ICN.D.代表未测定。图1说明了BLyS和rGel的取向。图2显示了示范性BLyS/rGel融合毒素的示范性DNA序列(SEQIDNO:9)和蛋白质序列(SEQIDNO:8)。图3显示了示范性rGel/BLyS融合毒素的示范性DNA序列(SEQIDNO:ll)和蛋白质序列(SEQIDNO:10)。图4说明了示范性融合毒素rGel/BLyS的构建。图5显示了rGel/BLyS融合毒素的纯化情况。rGel/BLyS融合毒素的考马斯-染色SDS-PAGE分析显示rGel/BLyS的Mr是45kDa，证明BLyS和rGel的摩尔比是1:1(左图)。利用抗-白树毒蛋白抗体或抗-BlyS抗体的蛋白质印迹分析证明rGel/BLyS融合毒素在其中含有毒素和BLyS组分(右图)。图7比较了rGel/BLyS和BLyS/rGel融合毒素对JEKO外套细胞系的细胞毒活性。将JEKO外套细胞系接种(5X103个/亮氨酸的体外蛋白质翻译试验。比较rGd/BLyS融合毒素和天然rGel的抑制曲线。图10是rGel/BLyS融合毒素对地塞米松敏感(MM1.S)和耐受(MM1.R)的多发性骨髓瘤细胞系的剂量-应答曲线。将MMl.S和MMl.R细胞系接种(5X103个/L)在平底96-孔微量滴定板上，以一式四份在孔中加入rGel、Dex或rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入75plXTT标记混合物，然后再培育细胞4小时。利用ELISA读数计检测450nm的分光光度吸光度。图11显示了rGel/BLyS的最大耐受剂量(MTD)。为获得rGel/BLyS的MTD，连续5天将各种浓度的rGd/BLyS以静脉内方式经尾静脉注射入Balb/C小鼠，检测存活小鼠的体重和数量。实施例5融合毒素RGEL/BLYS的构建、表达和纯化本发明人采用剪接重叠延伸PCR方法(Ho等，1989)构建了rGel/BLyS融合构建物，其取向是N-末端的rGel，其后是与BLyS分子相连的G4S肽(图4)。然后将融合构建物连接入pET-32a(+)载体的KpnI和XhoI位点，转化入大肠杆菌AD494(DE3)菌株。表达rGel/BLyS，采用固定化的金属离子亲和层析(Amersham)纯化。用酶除去20kDa的His-标签后，纯化的rGel/BLyS在还原条件下在SDS-PAGE上作为单体迁移至预计分子量45.5kDa处。rGel/BLyS也与BLyS和rGel的抗体免疫反应，因此证明该融合毒素中同时存在毒素和BLyS组分(图5)。实施例6融合毒素RGEL/BLYS中RGEL组分的生物学活性将毒素与其它蛋白质缀合或融合可严重损害毒素的生物学活性。为检验融合毒素rGel/BLyS中rGel组分的n-糖苷活性，将该物质加入利用萤光素酶生产的无细胞蛋白质翻译试验。比较rGel/BLyS和天然rGel的抑制曲线。rGel/BLyS和rGel的计算的IC50值分别是10pM和61pM。因此，这些结果提示rGel/BLyS中rGel组分的酶活性略高于游离rGel的酶活性(图6)。VEGF121和rGel的融合构建物也报道了类似的结果。与rGel毒素本身相比，VEGF121/rGel同源二聚体显示特定活性提高(Veenendaal等，2002)。这些数据表明，在本发明的某些实施方式中，rGel组分多聚化可在毗邻毒素分子之间产生协同性。实施例7BLyS、BAFF-R、TACI和BCMA表达及对rGel/BLyS的反应本发明人利用一组白血病、骨髓瘤和外套细胞淋巴瘤细胞系的RT-PCR分析检验了BLyS配体及其3种受体的表达分布。13种细胞系(Jurkat、KBM-5、THP-1、HL-60、IM-9、MM1.S、MM1.R、RPMI8226、8226/LR-5、JeKo-l、SP53、Mino和Granta519)表达BLyS和BAFF-R，而TACI和BCMA只在除4种白血病细胞系(Jurkat、KBM-5、THP-1和HL-60)以外的9种测试的示范性细胞系中表达。然后检验BLyS受体表达水平与对rGel/BLyS的敏感性之间是否有相关性。检验了对13种示范性细胞系(包括白血病、骨髓瘤和外套细胞淋巴瘤)的比较性IC50值。计算各细胞类型对rGel与rGel/BLyS的IC5o值之比。该比例(靶向指数)代表了rGel/BLyS中BLyS组分介导该毒性组分递送至靶细胞胞质的能力。如表4总结的，Jurkat、KBM-5、THP-1、HL-60、IM-9、MM1.S、MM1.R、8226/LR-5和Granta519显示耙向指数介于2禾B4之间，而表达BAFF-R、TACI和BCMA的3种MCL细胞系(JeKo-l、SP53和Mino)对rGel/BLyS高度敏感，显示耙向指数介于7,000和100,000之间。发现MCL细胞系JeKo-l对rGel/BLyS最敏感(靶向指数=100,000)。本发明人未能发现BLyS受体表达水平与对rGel/BLyS的敏感性之间有直接相关性。实施例8RGEL/BLYS的结合活性利用完整的JeKo-l和HL-60细胞系比较rGel/BLyS中BLyS组分的细胞结合活性。融合毒素rGel/BLyS显示对表达所有3种BLyS受体的JeKo-l细胞有特异结合活性，而rGel不与JeKo-l和HL-60细胞结合。令人感兴趣的是，如PCR估计的，rGel/BLyS不与只表达BAFF-R的HL-60细胞结合(图12)。实施例9RGEL/BLYS的特异性为评估rGel/BLyS对表达BLyS受体的细胞的特异性，我们用BLyS本身、游离的rGel、CTP/rGel(非B细胞靶向化学缀合物)或rGel/BLyS处理JeKo-l细胞。BLyS本身促进细胞生长，而非-B细胞耙向缀合物CTP/rGd显示与游离rGel相似的IC5c。然而，rGel/BLyS对表达3种BLyS受体的JeKo-l细胞的细胞毒性非常高(图9)。在经rGd/BLyS处理的JeKo-l细胞中，BLyS预处理显示剂量-应答曲线有偏移，但在rGel处理的JeKo-l细胞中没有(图13A)。此外，在JeKo-l细胞中，BAFF-R:Fc、TACI:Fc或BCMA:Fc预处理阻断了rGel/BLyS的细胞毒性，但在rGel-和BLyS-处理的JeKo-l细胞中没有(图13B)。这些数据证明rGel/BLyS的细胞毒性看来受BLyS受体介导。此外，三种受体的任一种看来能有效介导融合毒素的细胞毒性作用。实施例10rGel/BLyS内摄入JeKo-l外套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中利用家兔抗-rGel抗体检测到内摄的rGel/BLyS。与rGel/BLyS接触1小时后，在胞质和核中观察到rGel/BLyS中rGel部分，从而证明融合毒素rGel/BLyS能通过BLyS与BLyS受体结合而与细胞有效结合，从而快速内摄并将rGel毒素递送至JeKo-l细胞的胞质和核。实施例11RGEL/BLYS对凋亡途径的作用为测定rGel/BLyS的细胞毒性作用是否与凋亡机制相关，用100pMBLyS、100pMrGel或100pMrGel/BLyS处理JeKo-l细胞。96小时后，通过TUNEL染色检验JeKo-l细胞凋亡。rGel/BLyS处理的细胞显示34%凋亡细胞死亡，而rGel处理未诱导凋亡(图14A和14B)。己知蛋白质的胱冬酶级联(series)是细胞凋亡过程的中心介导物。为测定rGel/BLyS诱导细胞死亡期间，JeKo-l细胞中的胱冬酶-3是否活化，我们检验了胱冬酶-3的切割(产物)及其底物聚(ADP)-核糖聚合酶(PARP)。用BLyS或rGel处理对胱冬酶-3和PARP切割没作用，而用rGel/BLyS处理导致在96小时(出现)胱冬酶-3和PARP的切割(产物)(图14C)。实施例12本发明的意义BLyS是促进外周B细胞发育的关键生长因子，BLyS的生长剌激作用受称为BAFF-R、TACI和BCMA的3种细胞表面受体介导(Thompson等，2001;vonBulow和Bram，1997;Laabi等，1992)。这些报道提示BLyS看来在B-CLL样品中以各种模式表达，可能说明了对治疗剂先天耐受的患者亚组。因此，本发明人选择BLyS作为靶向配体将rGEL毒素特异性递送至表达一种或多种BLyS受体的肿瘤细胞。对于融合构建物，本发明人选择rGel/BLyS取向而不是BLyS/rGel取向，因为未发表的数据表明BLyS分子中未受阻的C末端对于三聚作用和受体识别重要。此外，在这点上，对无活性的BLyS/rGel融合构建物的进一步研究证实了这些观察结果。为发现BLyS受体的细胞表达水平与对rGel/BLyS敏感性之间的潜在相关性，本发明人检验了BLyS及其三种受体的表达水平和rGel/BLyS及rGel对各种人细胞系(包括白血病、多发性骨髓瘤、外套细胞淋巴瘤和小鼠B细胞性淋巴瘤细胞系)的比较性ICs()值。BCL-1小鼠B淋巴瘤细胞系显示靶向指数最高(187,500)。Kanakaraji等(2001)报道BCL-1细胞具有4,800个结合位点/细胞，而IM-9细胞具有3,200个结合位点/细胞。BCL-1细胞对rGel/BLyS的反应性也与BLyS受体的总数有关。表达BAFF-R、TACI和BCMA的3种MCL细胞系(JeKo-l、SP53禾卩Mino)对rGel/BLyS高度敏感，显示耙向指数介于7，000-100，000之间，而Granta519MCL细胞系显示耙向指数介于2-4之间，即使RT-PCR评估Granta519细胞表达BLyS所有3种受体的水平接近JeKo-l细胞上表达的。发现JeKo-lMCL细胞系对rGel/BLyS最敏感(靶向指数=100,000)。在MCL细胞系中，Granta519细胞对rGel/BLyS和rGel本身最敏感。本发明人未能发现BLyS受体表达水平与对rGd/BLyS的敏感性之间有直接相关性，并在这两种MCL细胞系中检验了rGel/BLyS的细胞毒性机制来鉴定可解释趋异细胞毒性作用的机制。本发明人观察到rGd/BLyS能快速内摄入最敏感的细胞系JeKo-l，但不内摄入Granta519(数据未显示)。该结果表明与BLyS受体结合后，rGel/BLyS能内摄入JeKo-l细胞，并将rGel毒素递送至表达3种BLyS受体的JeKo-lMCL细胞系。外套细胞淋巴瘤(MCL)是不同类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤，其特征是一系列形态学、免疫表型和细胞遗传学特征并过量表达细胞周期蛋白Dl。常规细胞毒性治疗无效，总体预后不佳(Leonard等，2001)。MCL是B细胞非霍奇金淋巴瘤中对治疗最耐受的(Weisenburger等，2000)。MCL对目前化疗方案的耐受性表明无疑需要MCL的新治疗方法。这些结果表明融合毒素rGd/BLyS至少对目前大多数化疗方案难治的外套细胞淋巴瘤是优秀的治疗剂。多发性骨髓瘤(MM)是以骨髓中浆细胞的克隆扩增为特征的B-细胞瘤，即使常规的高剂量治疗依然不可治愈。Greenstein等(2003)建立了三种MM1.S(地塞米松敏感细胞)、MM1RE(地塞米松耐受MMl.R细胞的早期形式)和MM1.RL(地塞米松耐受MM1.R细胞的晚期形式)来研究MM的病因学、化疗剂的效力和临床耐受性的发生。令人感兴趣的是，本发明人发现地塞米松敏感(MM1.S)和耐受(MM1.R)细胞系同样对rGel/BLyS敏感(rGel/BLyS的IC5()值是300nM)。本发明人也发现亲代美法仑敏感性RPMI8226和耐受性8226/LR-5多发性骨髓瘤细胞同样对rGel敏感(分别是200和280)，但对rGel/BLyS的敏感度不相同(分别是10与110)(表4)。这表明对地塞米松的细胞耐受看来未导致对融合毒素发生交叉耐受，而对美法仑的细胞耐受确实导致对美发仑发生交叉耐受。正在进行信号转导研究来理解rGel/BLyS在药物敏感和耐受细胞系中的细胞毒性机制。总之，这些数据表明rGel/BLyS是治疗至少外套细胞淋巴瘤的良好候选者，在具体实施方式中，BLyS用作靶向配体将毒素特异性递送至表达一种或多种BLyS受体的B细胞。实施例13示范性材料与方法本实施例提供用于本发明的示范性材料与方法。材料PCR试剂、RNA分离试剂盒和逆转录(RT)-PCR试剂盒购自LifeTechnologies，Inc.(Frederick，MD)。限制性酶购自NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)。RNA和DNA纯化试剂盒购自Qiagen，Inc.(Valencia,CA)。细菌菌株、pET细菌表达质粒和重组肠激酶(rEK)购自Novagen(Madison,WI)。Hi-Trap螯合性HP树脂和其它层析树脂购自AmershamBioscience(Uppsala,瑞典)。小鼠单克隆抗-PARP抗体(Ab)、家兔抗-细胞周期蛋白DlAb和山羊抗-P-肌动蛋白Ab购自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA)。家兔多克隆抗-活性胱冬酶-3Ab购自BDBiosciences(SanJose，CA)。细胞系和细胞培养多发性骨髓瘤阿霉素敏感细胞系MM1.S和耐受细胞系MM1.R由VarshaGandhi博士(M.D.AndersonCancerCenter,休斯顿，德克萨斯)馈赠。浆细胞性骨髓瘤美法仑耐受细胞系8226/LR-5由WilliamDalton博士(ArizonaCancerCenter,Tucson)馈赠(Phillips等，2003)。四种外套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系(JeKo國l、SP53、Mino禾卩Granta-519)由HeshamAmin博士(M.D.AndersonCancerCenter,休斯顿，德克萨斯)馈赠(Kanakaraj等，2001)。Jurkat、KBM-5、THP-l、HL-60、IM-9、RPMI8226、MM1.S、MM1.R和JeK-1细胞系在补加了10%热灭活胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素和100pg/ml链霉素的RPMI1640培养基(ATCC，Manassas,VA)中培养。RPMI8226/LR-5细胞系的RPMI1640培养基(ATCC)中含有5nM美法仑。Granta519细胞系在补加了10%热灭活胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素和100|ig/ml链霉素的DMEM(Invitrogen，GrandIsland,NY)中培养。SP53和Mino细胞系在补加了20%热灭活FBS、100单位/ml青霉素和100吗/ml链霉素的RPMI1640培养基(ATCC)中培养。构建rGel/BLyS融合毒素分离JeKo-l细胞的RNA，利用以下引物通过RT-PCR扩增编码人BLyS的cDNA:BLySf(5'—3'):GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC(SEQIDNO:22)和BlySr(5'—3):GTCCATGTCTTTGGGGATGAATTG(SEQIDNO:23)(Schneider等，1999)。采用剪接重叠延伸PCR(OE-PCR)方法(Weisenburger等，2000)，将BLyS和重组白树毒蛋白的整个编码区作为DNA模板扩增各基因片段来制备rGel/BLyS融合DNA构建物。为构建rGel/BLyS融合DNA构建物，利用寡核苷酸引物PETgelfor，(5'國AGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGGCCTGGACACCGTGAGC-3，；SEQIDNO:16);rGelbaclink，(5'-GCTCCCGCCTCCCCCTTTAGGATCTTT-3，；SEQIDNO:17)从重组白树毒蛋白的N-末端部分扩增编码肠激酶消化位点和限制性酶KPNI的上游OE-PCR片段。利用寡核苷酸引物BlySfor，(5'國GGGGGAGGCGGGAGCGCCGTTCAGGGTCCA-3，；SEQIDNO:18)禾卩BlySrev，(5，-GCCGTCGACCTCGAGTCATTACAGCAGTTTCAATGC-3，;SEQIDNO:19)从BLyS基因扩增编码G4S接头和限制性酶XhoI的毗邻下游OE-PCR片段。然后利用侧接5，-和3，-端的寡核苷酸引物对PETgelfor和BLySrev(见上文)，通过额外的PCR步骤将上游和下游OE-PCR片段重组装为全长rGel/BLyS融合基因。纯化最终的PCR片段，用KpnI和XhoI限制性内切核酸酶切割，然后克隆入表达载体pET-32a(Novagen)中，该载体利用T7启动子控制所插入融合基因的转录。通过DNA测序验证融合毒素rGel/BLyS基因构建物，将正确的融合构建物转化入大肠杆菌菌株AD494(DE3)来表达融合毒素。rGel/BLyS在大肠杆菌中的表达和诱导37°C，用摇床培养器以235rpm将用携带rGel/BLyS插入物的质粒转化的细菌菌落在含有400吗/ml氨苄西林和30貼/ml卡那霉素的Luria肉汤培养基中培养过夜。然后用含抗生素的新鲜LB培养基将细菌培养液作1:100稀释，37'C培养至A6G()=0.8。随后用加入400pg/ml氨苄西林和30吗/ml卡那霉素的新鲜LB培养基将细菌培养液作1:l稀释，在23t:通过加入lOOpM异丙基-l-巯基-P-D-吡喃半乳糖苷酶(IPTG)诱导生长因子融合毒素rGel/BLyS表达过夜。离心收集细胞，重悬在40mMTris-HCl(pH8)中，冷冻(-8(TC)。纯化rGel/BLyS融化冷冻的细菌细胞，然后在4'C通过物理破坏裂解(珠破碎机，BiospecProducts,Bartlesville，OK)。40,000Xg超离心细菌裂解液1.5小时。将上清液中NaCl的终浓度调节至500mMNaCl，然后加样到带有200mMNi2S04的Hi-Trap螯合性HP树月旨(Amersham)上。用40mMTris-HCl(pH8)和含有30mM咪唑的500mMNaCl洗柱，用40mMTris-HCl(pH8)和含有300mM咪唑的500mMNaCl洗脱。合并含有rGel/BLyS的组分，透析入含有20mMTris-HCl(pH7.4)和150mMNaCl的透析缓冲液。为除去组氨酸标记，在室温用重组肠激酶(rEK，Novagen)消化含组氨酸标记的rGel/BLyS融合毒素过夜。利用Q-Sepharose速流(Amersham)的离子交换层析和Blue-SepharoseCL-6B(Amersham)的亲和层析除去非特异蛋白和20kDa的组氨酸标记。纯化的rGd/BLyS样品过滤除菌，分为等份，4'C保存。分析rGel/BLyS为评估rGel/BLyS融合毒素中rGel毒素和BLyS组分的存在，在还原条件下通过12%SDS-PAGE分析最终样品。通过SDS-PAGE(8-15%)分离纯化的rGel/BLyS(5pg)，4。C用转移缓冲液[25mMTris-HCl(pH8.3)，190mM甘氨酸，20%甲醇]将其电泳转移至PVDF膜(MilliporeCorporation,Bedford,MA)过夜。用含5%脱脂奶的Tris-缓冲盐水(TBS)封闭PVDF膜1小时，然后用家兔抗-白树毒蛋白Ab或山羊抗-BLySAb检测。利用缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗-家兔或猪抗-山羊抗体(Bio-RadLaboratories,Hercules，CA)，用ECL检测试剂(AmershamPharmaciaBiotechInc.，Piscataway，NJ)目测观察l:4000稀释度的免疫反应性蛋白质。BLyS或重组白树毒蛋白用作阳性对照。数据表示为按照(3-肌动蛋白标准化的蛋白质条带的相对密度。利用Histogram定量测定这些条带的强度。rGel/BLyS的无细胞蛋白质合成抑制活性与rGd/BLyS融合毒素的n-糖苷抑制活性相比，评估重组rGel毒素的n-糖苷抑制活性。采用生产商(Promega，Madison，WI)和以前(Hale，2001)所述的家兔网织红细胞裂解物试验评估毒素诱导的蛋白质产生抑制作用。rGel/BLyS的BLyS受体结合活性为评估融合毒素rGel/BLyS的BLyS受体结合活性，将JeKo-l和HL-60细胞以1X105个/孔的密度固定在聚丄-赖氨酸包衣的96孔板上(BectonDickinsonLabware，FranklinLakes,新泽西)。将各板再水合，用3。/。BSA封闭，然后室温下在稀释缓冲液(PBS，0.1%吐温20，0.1%BSA)中与不同浓度的rGel/BLyS或rGd培育2小时。洗涤后，在室温将各板与家兔抗-白树毒蛋白多克隆抗体培育1小时，用PBST(1(ig/ml，PBS配帝U，0.1%吐温20，0.1%BSA)洗漆4次，然后向各孔加入100^过氧化物酶缀合的山羊抗-家兔IgG(lng/ml，稀释缓冲液配制；Vector,Burlingame，CA)。各板在室温培育1小时，用PBST洗涤4次，用四甲基联苯胺底物(Sigma)显影。利用SpentraMax3000仪器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)检测450nm的吸光度。检测各种细胞系上BLyS、BAFF-R、TACI和BCMA的表达采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析评估13种细胞系中BLyS、BAFF-R、TACI和BCMA的表达。利用13种细胞系分离的总RNA合成第一链cDNA,然后利用设计的特定引物通过PCR来扩增人BLyS(313bp)(Schneider等，1999)、BAFF-R(256bp)(Kern等，2004)、TACI(196bp)(Phillips等，2003)和BCMA(285bp)(Phillips等，2003)。GADPH用作对照。rGel/BLyS的细胞毒性活性和游离BLyS或诱杀受体的竞争性抑制作用为测定rGel/BLyS对13种细胞系的比较IC50值，将13种细胞系接种(5X103个/孔)在平底96-孔微量滴定板上(BectonDickinson),以一式四份在孔中加入rGel本身或rGel/BLyS。96小时后，向各孔中加入50piXTT标记混合物(Roche)，然后再培育细胞过夜。利用ELISA读数计(Bio-TekInstruments,Inc.,Winooski，VT)检测450nm的分光光度吸光度。为测定rGel/BLyS对表达BLyS受体的细胞的特异性，我们将BLyS本身、游离rGel、CTP/rGel(非-B细胞靶向化学缀合物)、rGel/BLyS或培养基以一式四份加入孔中来处理JeKo-l细胞。对于竞争性抑制试验，将JeKo-l细胞接种(5X103个/孔)在平底96-孔微量滴定板上(BectonDickinson),用lnMBLyS、50nMBLyS、10|ug/mlBAFF-R:Fc、10pg/mlTACI:Fc或10|ig/mlBCMA:Fc预处理2小时，然后以一式四份加入rGel/BLyS或rGel本身。rGel/BLyS内摄入JeKo-l外套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系将JeKo-lMCL细胞系以1乂104个/孔加入聚赖氨酸包被的16孔腔室载玻片(chamberslide)(Nunc，罗切斯特，纽约)，在不同时间用100nMrGel或100nMrGel〃BLyS处理。然后用细胞离心涂片器(Shandon，匹兹堡，宾夕法尼亚)将细胞涂布到载玻片上，再用甘氨酸缓冲液[500mMNaCl和0.1M甘氨酸(pH2.5)]培育IO分钟来剥离与细胞表面结合的蛋白质，用0.5MTris(pH7.4)中和0.5分钟，用PBS简单洗涤，然后在室温用3.7%甲醛(Sigma，St.Louis，MO)固定20分钟，随后用PBS简单清洗。然后用含0.2%TritonX-100的PBS透化处理细胞10分钟，用PBS洗涤3次，在室温用含3%BSA的PBS封闭1小时。用PBS简单洗涤后，细胞于室温在含0.1%吐温20和0.2%BSA的PBS中与1:500稀释的家兔抗-rGel多克隆抗体培育1小时。细胞用含0.1%吐温20的PBS洗涤3次，15分钟，与含1|ug/ml碘化丙啶(PI)的FITC-偶联抗-家兔IgG(Sigma)的1:IOO稀释液培育。细胞用含0."/。吐温20的PBS洗涤3次后，用PBS洗涤l次，IO分钟，用DABCO封固剂封固。然后用ZeissLSM510激光扫描显微镜(CarlZeiss,Jena，德国)分析载玻片。检测凋亡采用TdT-介导的dUTP镍末端标记(TUNEL)试验检测凋亡。为评估凋亡，将JeKo-l细胞以5乂103个/孔加入聚赖氨酸包被的16孔腔室载玻片(Nunc)，用100pMBLyS、100pMrGel、100pMrGel/BLyS或培养基处理4天。然后收集漂浮细胞，利用细胞离心涂片器(Shandon)将其黏附到载玻片上，干燥，然后在室温用3.7%甲醛(Sigma)固定20分钟，随后用PBS简单清洗。然后用含0.2%TritonX-100和0.1%柠檬酸钠的PBS透化处理细胞IO分钟，用PBS洗涤3次，在室温用含3%BSA的PBS封闭1小时。用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche)染色固定的细胞。最终洗涤步骤后，用封固剂封固载玻片，在荧光显微镜下分析。蛋白质印迹分析为检验rGel/BLyS对切割的胱冬酶-3和PARP表达的作用，将JeKo-l细胞以5Xl()5个细胞/24-孔板接种，然后用100pMBLyS、100pMrGel、100pMrGel/BLyS或培养基处理。96小时后，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，在冲液(IOmMTris-HCl，pH8，60mMKC1，1mMEDTA，1mMDTT，0.2%NP-40)裂解20分钟。通过SDS-PAGE(8-15%)分离细胞裂解物(50jig)，4。C用转移缓冲液[25mMTris-HCl(pH8.3)，190mM甘氨酸，20%甲醇]将其电泳转移至PVDF膜(MilliporeCorporation,Bedford,MA)过夜。用含5%脱脂奶的Tris-缓冲盐水(TBS)封闭PVDF膜1小时，然后用小鼠单克隆抗-PARP抗体(Ab)、家兔多克隆抗-活化胱冬酶-3Ab或山羊抗-P肌动蛋白检测。利用缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗-小鼠/抗-家兔或猪抗-山羊抗体(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，用ECL检湖!)试齐!j(AmershamPharmaciaBiotechInc.,Piscataway，NJ)目测观察1:4000稀释度的免疫反应性蛋白质。数据表示为按照P-肌动蛋白标准化的蛋白质条带的相对密度。利用Histogram定量测定这些条带的强度。参考文献本说明书中提及的所有专利和出版物表明了本发明所属领域技术人员的水平。如同各出版物证明且单独表明纳为参考的程度一样，所有专利和出版物均纳入本文作为参考。专利和专利申请美国专利号5,631,348美国专利号6,669,938美国专利号RE37,462美国专利号6,750,329美国专利号6,599，505美国专利号6,214,974美国专利号5,624,827美国专利号5,053,226出版物AminHM，McDonnellTJ,MedeirosJ等，Characterizationof4mantlecelllymphomacelllines(4种外套细胞淋巴瘤细胞系的特征鉴定).ArchPatholLabMed.2003;127:424-431。BackerMV,BackerJM.TargetingendothelialcellsoverexpressingVEGFR-2:selectivetoxicityofShiga-liketoxin-VEGFfusionproteins(革巴向过表达VEGFR-2的内皮细胞志贺样毒素-VEGF融合蛋白的选择性毒性).BioconjugChem.2001;12:1066-1073。BellamyWT,DaltonWS,GleasonMC,GroganTM,TrentJM.Developmentandcharacterizationofamelphalan-resistanthumanmultiplemyelomacellline(美法仑耐受人多发性骨髓瘤细胞系的开发与特征鉴定).CancerRes.1991;51:995-1002。BrionesJ，TimmermanJM,HilbertDM,LevyR.BLySandBLySreceptorexpressioninnon-Hodgkin'slymphoma(非霍奇金淋巴瘤中BLyS和BLyS受体的表达).ExpHematol.2002;30:135-141。Chen，G.,Zou,M.J.，Peng,S.,Wang,J.X.Cloning,expressionandactivitydeterminationoftherecombinanthumansolubleBlymphocytestimulatoranditstwomutants(重组人可溶性B淋巴细胞刺激物及其两种突变体的克隆、表达和活性测定).ShengWuHuaXueYuShengWuWuLiXueBao(Shanghai).2002;34(6):731-6。Chen,G.,Peng,S.,Zou,M.，Xu，H.,Xu,D.，Wang,J.ConstructionandfunctionoftwoCysl46-mutantswithhighactivity,derivedfromrecombinanthumansolubleBlymphocytestimulator(衍生自重组人可溶性B淋巴细胞刺激物的两种高活性Cysl46突变体的构建和功能).2004;136(l):73-9。Chen,G.,Du，H.，Zhang,Z.，Peng,S.,Xu,D.,Wang,J.PrimaryimmuneeffectsofeukaryoticexpressionplasmidsencodingtwohyperactivemutantsofhumansolubleBlymphocytestimulator(编码人可溶性B淋巴细胞刺激物的两种超反应性突变体的真核表达质粒的基础免疫作用).J.Clin.Immunol.25(5):445-51。CraxtonA，MagalettiD,RyanEJ,ClarkEA.Macrophage-anddendriticcell-dependentregulationofhumanB-cellproliferationrequirestheTNFfamilyligandBAFF(人B细胞增殖的巨噬细胞和树突细胞依赖性调节需要TNF家族配体BAFF).Blood.2003;101:4464-4471。DoRK,Chen隱KiangS.MechanismofBLySactioninBcellimmunity(BLyS在B细胞免疫力中的作用机制).CytokineGrowthFactorRev.2002;13:19-25。DuzkaleH,PagliaroLC，RosenblumMG等，Bonemarrowpurgingstudiesinacutemyelogenousleukemiausingtherecombinantanti-CD33immunotoxinHuM195/rGel(利用重组抗-CD33免疫毒素HuM195/rGel的急性骨髓性白血病骨髓冲洗研究).BiolBloodMarrowTransplant.2003;9:364-372FossFM.Interleukin-2fusiontoxin:targetedtherapyforcutaneousTcelllymphoma(白介素-2融合毒素真皮T细胞淋巴瘤的靶向治疗).AnnNYAcadSci.2001;941:166-176FrankelA,TaggeE,ChandlerJ等，IL2-ricinfusiontoxinisselectivelycytotoxicw'加toIL2receptor-bearingtumorcells(IL-2-蓖麻毒蛋白融合毒素在体外对携带IL-2受体的肿瘤细胞有选择性细胞毒性).BioconjugChem.1995;6:666-672。GreensteinS，KrettNL，KurosawaY等，CharacterizationoftheMM1.1humanmultiplemyeloma(MM)celllines:Amodelsystemtoelucidatethecharacteristics,behavior,andsignalingofsteroid-sensitiveand-resistantMMcells(MMl.l人多发性骨髓瘤(MM)细胞系的特征鉴定阐明类固醇敏感和耐受的MM细胞的特征、性能和信号转导的模型系统).ExpHematol2003;31:271-282。HahneM，KataokaT,SchroterM等，APRIL,anewligandofthetumornecrosisfactorfamily,stimulatestumorcellgrowth(APRIL,——禾中月中瘤坏死因子家族的新配体能刺激肿瘤细胞生长).JExpMed.1998;188:1185-1190。HaleML.Microtiter-basedassayforevaluatingthebiologicalactivityofribosome-inactivatingproteins(评估核糖体灭活蛋白的生物学活性的微滴定试验).PharmacolTo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发明内容不难知道本发明可以利用目前已有的或以后开发的过程、机器、生产、物质的组成、方式、方法或步骤来执行与本文所述相应实施方式基本相同的功能或达到基本相同的结果。因此，附加的权利要求书的范围应包括这种过程、机器、生产、物质的组成、方式、方法或步骤。权利要求1.一种包含与治疗剂缀合的BLyS多肽的组合物。2.如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述治疗剂进一步定义为细胞毒剂、化疗剂、抗体、细胞因子、促凋亡剂或血管生成抑制剂中的一种或多种。3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述细胞毒剂包括肽、多肽或小分子。4.如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述组合物还定义为融合蛋白。5.如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述BLyS多肽包含B-细胞靶向结构域。6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述BLyS多肽包含D-E受体识别环。7.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述BLyS多肽和细胞毒剂化学缀合。8.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述细胞毒剂包含白树毒蛋白分子。9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述白树毒蛋白分子位于所述BLyS多肽的5'。10.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述细胞毒剂选自蓖麻毒蛋白A、白喉毒素、相思豆毒蛋白、商陆毒蛋白、天花粉蛋白、曲古克淋、异株泻根毒蛋白、紫茉莉抗病毒蛋白、大麦核糖体失活性蛋白(BRIP)、商陆抗病毒蛋白(PAP)、皂草素、丝瓜蛋白、假单胞菌外毒素和木鳖子皂苷。11.如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含重组多肽。12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还定义为包含在药学上可接受的载体中。13.—种含有权利要求1所述组合物的宿主细胞。14.一种治疗患B-细胞增殖性疾病的个体的方法，所述方法包括给予该个体治疗有效量的权利要求1所述组合物。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述B-细胞增殖性疾病选自B-细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B-细胞前淋巴细胞性白血病、免疫细胞瘤/淋巴浆细胞性淋巴瘤(+/-瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、外套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴样组织(MALT)型边缘区B-细胞性淋巴瘤、脾边缘区B-细胞淋巴瘤(+/-绒毛状淋巴细胞)、毛细胞性白血病、弥散性大B-细胞性淋巴瘤、纵膈(胸腺)大B-细胞性淋巴瘤、血管内大B-细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤(多发性骨髓瘤)、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、无痛性骨髓瘤、郁积性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、浆细胞性白血病、非分泌性骨髓瘤、浆细胞瘤、孤立性骨浆细胞瘤、髓外桨细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病(HCD)、免疫球蛋白沉积病、全身性轻链病、原发性淀粉样变性、霍奇金病、非霍奇金病、狼疮和关节炎。16.—种选择性靶向表达BLyS受体的细胞的方法，所述方法包括使该细胞与有效量的权利要求1所述组合物接触。17.—种监测患B-细胞增殖性疾病的个体治疗的方法，所述方法包括给予该个体治疗有效量的权利要求1所述化合物。18.—种具有封装在合适容器中的权利要求l所述组合物的试剂盒。19.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述组合物包含在药学上可接受的载体中。20.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，适当等分所述组合物以递送至个体。全文摘要本发明涉及能与BLyS受体结合并递送细胞毒剂(例如细胞毒性肽)的靶向BLyS多肽。在具体的方面，所述细胞毒剂包含r白树毒蛋白的至少一部分。这些组合物可用于治疗、预防B-细胞增殖性疾病和/或监测其治疗。文档编号A61P35/00GK101132813SQ200680003470公开日2008年2月27日申请日期2006年2月1日优先权日2005年2月1日发明者L·陈,M·-A·刘,M·G·罗森布拉姆申请人:研究发展基金会