具有抗癌性能的化合物的制作方法

专利名称：：具有抗癌性能的化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及诱导细胞凋亡并具有抗癌性能的化合物。技术背景本说明书中对于文献、行为或知识的引用或讨论并非承认该文献、行为或知识或其任意组合在优先日时构成公知的知识的一部分，或已知与本说明书涉及的问题的解决相关。现在，数百万人与癌症相伴或己患癌症。每年超过1百万的人患有癌症。任何人任何年龄都有可能患癌；不过，约77%的确诊的患癌年龄一般在55岁以上。男人三种最常见的癌症为前列腺癌、肺癌和结肠癌。女人易患的三种常见癌症为乳腺癌、肺癌和结肠癌。癌症发展时体内部分细胞的生长失去控制。尽管有许多种癌症，这些癌症的发生都是由于异常细胞的生长失去了控制。正常的体细胞的生长、分裂或死亡是有顺序的。在人生命的早期，正常的细胞分裂得很快，直至成年。之后，体内大部分细胞的分裂只是为了替换老化或死亡的细胞，以及修复伤痕。由于癌细胞持续生长和分裂，这和正常的细胞不同。癌细胞不仅不死亡，而且它们比正常细胞的寿命长，并持续形成新的异常细胞。当这些细胞妨碍重要器官的正常功能或遍布全身而破坏重要系统时，可以杀死这些细胞。越早发现癌症并进行治疗，越容易延长寿命数年。由于DNA的破坏，癌细胞得到了发展。火多数情况下，DNA破坏时身体能够修复。在癌细胞内，破坏的DNA没有被修复。人能够遗传受损的DNA，这就解释了遗传性的癌症。很多时候，人的DNA在一些环境如吸烟的环境时受到破坏。改变人的生活方式可以降低大多数癌症的风险，例如，戒烟和良好的饮食习惯。当癌细胞生长和替换正常组织时，癌细胞经常转移到身体的其它部位。这种称之为转移的过程在癌细胞进入身体血液或淋巴器官时发生。细胞扩散到血液中的原位肿瘤细胞仅在一些特定的器官、而不是所有的器官生长。至少有200种不同的癌症。这些癌症几乎可以在任何器官、流体或组织中发展。不同类型的癌症表现差异很大。这就是癌症患者为什么治疗需要根据特定的癌症进行。治疗癌症主要的四种方法为外科手术、辐射、化疗和生物疗法。也有激素疗法如三苯氧胺和器官移植如骨髓移植。根据癌症的种类和不同阶段，治疗也不一样。癌症的阶段指的是癌症的进展及肿瘤是否从原位扩散。如果癌症被限制在一个位置并没有扩散，治疗的手段可以是手术治疗。如果癌症不能用手术除去，则治疗的方法可以选择辐射、化疗或两者。一些癌症需要结合手术、辐射和化疗。手术和辐射疗法用于治疗局部癌的治疗，而化疗用于治疗癌细胞已经转移(扩散)到体内其它部分的癌症。根据癌症的类型和发展阶段，化疗可以用于癌症的治愈，以防止癌细胞的扩散，从而减慢癌症的生长，以及用于杀死可能会扩散到体内其它部分的癌细胞，或者用于减轻癌症症状。化疗的副作用取决于药物的类型、药量和治疗时间。最常见的副作用是恶心和呕吐、脱发、感染机会增加，以及疲劳。这些副作用可能是不舒服的或者令人情绪烦躁。不过，大多数的副作用可以通过药物、照料或改变治疗计划得到控制。不过，现实中仍然需要副作用较小的化疗药物用于治疗癌症以改进现有的治疗方法。番茄红素番茄红素，一种开链的不饱和类胡萝卜素，没有维他命A的活性，存在于许多水果和蔬菜中。番茄红素为红色、脂溶性的色素，可以使得西红柿、番石榴、玫瑰果、西瓜和粉红葡萄柚呈现红色。番茄红素证实为一种抗氧化剂。在身体内，番茄红素沉积在肝脏、肺、前列腺、结肠和皮肤上。体内番茄红素的浓度趋向高于所有其它类胡萝卜素(其约占人体血清中所有类胡萝卜素的50%)。研究表明，如果西红柿加工成果酱、果汁、果泥和调味番茄酱，其中的番茄红素更容易被体内吸收。西红柿中发现的番茄红素的化学形式在加工时由于温度的变化而发生转换，从而更容易被体内吸收。在美国的饮食中，西红柿是第四种最常用的新鲜蔬菜和最常消费的罐装蔬菜。流行病学数据表明增加西红柿的消费和降低心血管疾病和前列腺癌之间有关联。正在进行的初始研究表明番茄红素和降低黄斑变性疾病、血清脂质氧化、以及肺、膀胱、子宫颈、皮肤、消化道、乳腺和前列腺癌的发生有关系。研究正在考查番茄红素的其它潜在功效。生育酚磷酸酯维生素E被认为具有改善健康的多种有益性能，包括抗氧化性能。一般认为维生素E包括8种不同的形式ct、P、Y、S生育酚和ci、3、Y、S生育三烯酚。生育酚和生育三烯酚不同，因为生育酚有饱和的叶绿基侧链，而不是不饱和的异戊二烯基侧链。该四种形式和色原垸醇基团(三种a、两种p和Y、一种S)上的许多甲基不同。在国际专利申请WO03/026673中，其公开说明增加维生素的贮存水平，包括生育酚磷酸酯，对减轻或治疗癌症有好处，其中生育酚可以影响细胞黏附。不过，该专利申请没有公开引起细胞死亡的生育酚磷酸酯，或者a生育酚和S、Y生育酚之间的活性差异。生育酚磷酸酯已经在国际专利申请WO2004/064831公丌，该公丌认为生育酚磷酸酯具有和抑制单核细胞/巨噬细胞增殖、光滑肌细胞的增殖、CD36受体表达和氧化LDL吸收相关的性能。实施例仅仅表明了对细胞生长的抑制，且没有公开细胞死亡。而且，该申请没有治疗癌症或a生育酚和S、Y生育酚之间的活性差异。国际专利申请WO00/16772和WO03/039461教导了自然生成的a、e、y、S生育酚和a、P、y、S生育三烯酚具有抗癌活性。不过，a生育酚没有抗癌活性。而且，这些申请公开了生育酚类化合物的过磷酸酯衍生物可以用于治疗癌症。试图关联自由生育酚的吸收和癌症发生之间的关系的人体试验和考査通常是非决定性的，自由生育酚不是癌症治疗的临床选择。现实仍需要癌症的改进治疗方法。
发明内容现已令人惊异的发现，7，8-二甲基-6-羟基色原烷和8-甲基-6-羟基色原烷(S和Y羟基色原烷)的磷酸酯衍生物可以使得细胞凋亡，从而能够用于治疗癌症，但是5，7，8-三甲基-6-羟基色原烷(ct羟基色原垸)没有这种性能。已经证实，将一种或多种抗癌试剂与7，8-二甲基-6-羟基色原烷和8-甲基-6-羟基色原烷(s和y羟基色原烷)的磷酸酯衍生物结合使用，使用较低浓度的抗癌试剂就能有效的杀死癌细胞。一方面，本发明提供了一种减轻症状、治疗或预防癌症的方法，该方法包括给已患有癌症或可能患癌症的患者服用含有一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物的有效量的药物制剂，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。另一方面，本发明提供了一种诱导细胞凋亡的方法，该方法包括给细胞投入含有--种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物的有效量的药物制剂，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。再一方面，本发明提供了一种减轻症状、治疗或预防癌症的方法，该方法包括给已患有癌症或可能患癌症的患者投药有效量的药物制剂，其中该药物制剂包括(a)—种或多种抗癌试剂；以及(b)—种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原垸选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原垸及其混合物。再一方面，本发明提供了一种诱导细胞凋亡的方法，该方法包括给细胞投入含有一种或多种抗癌试剂和一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物的有效量的制剂，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。再一方面，本发明提供了一种增加番茄红素功效的方法，该方法包括将番茄红素和一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物联合使用，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原垸及其混合物。再一方面，本发明包括一种药物制剂，该制剂含有有效量的番茄红素和有效量的一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原垸选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。进一步，本发明提供了一种增加抗癌试剂功效的方法，该方法包括将抗癌试剂和一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物联合使用，其屮羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。合适的抗癌试剂的例子为三苯氧胺。再-'方面，本发明提供了一种用于诱导细胞凋亡的药物制剂，该制剂含有一种或多种抗癌试剂和一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。进一步，本发明提供了一种用于减轻症状、治疗或预防癌症的药物制剂，该制剂含有一种或多种抗癌试剂和一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原垸及其混合物。进--步，本发明提供了一种或多种抗癌试剂和一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物与合适的载体或稀释剂在制备减轻症状、治疗或预防癌症的药物制剂中的应用，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。再一方面，本发明提供了一种用于诱导细胞凋亡的药物组合物，该组合物含有有效量的一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原垸选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-e-羟基色原垸及其混合物。进一步，本发明提供了有效量的一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物与合适的载体或稀释剂在制备减轻症状、治疗或预防癌症的药物制剂中的应用，其中羟基色原垸选自7，8-二甲基-6-羟基色原垸、8-甲基_6-羟基色原烷及其混合物。抗癌疗法经常包括使用细胞毒素试剂的鸡尾酒。剂型中可以含有其它药物化合物，该药物化合物不影响羟基色原烷磷酸酯衍生物的活性。在一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物给药前、给药时或给药后，可以服用其它的药物化合物。这种合适的其它的药物化合物的例子包括紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、三苯氧胺和链霉菌。此处使用的术语"有效量"指的是足以诱导细胞凋亡或减轻症状、治疗或预防癌症的量。本领域的普通技术人员应该知道适合本发明的抗癌试剂。此处使用的术语"抗癌试剂"包括但不限于所有的促凋亡化合物，以及烷基化物试剂、抗代谢试剂、免疫试剂、影响信号转导通路的化合物和其它的化疗试剂。优选的，一种或多种抗癌试剂为番茄红素或三苯氧胺。此处使用的术语"羟基色原烷"指的是色原垸的羟基衍生物。和本发明相关的羟基色原烷衍生物为7，8-二甲基-6-羟基色原烷和8-甲基-6-羟基色原垸，包括对映异构体或外消旋体。更加优选的，羟基色原烷选自s和y母育酚及其混合物。母育酚包括6-羟基-2-甲基色原烷(参考下述结构式)衍生物的s和y异构体，其中r1、r2和r3可以是氢或甲基，即y-7，8-二甲基和5-8-甲基衍生物。在牛育酚中，R4被4，8，12-三甲基十三烷基取代，2、4和8位(参看*)可以是R或S活性或外消旋的立体异构体。在生育三烯酚中，R4被4，8，12-三甲基十三垸基-3，7，11-三烯取代，2位可以是R或S立体活性的或外消旋的。此处使用的术语"磷酸酯衍生物"指的是磷酸化的电子转移试剂的酸性形式，磷酸酯包括金属盐如钠、镁、钾和钙，以及其它任何衍生物，其中磷酸酯质子被其它取代基如乙基或甲基或磷脂酰基取代。不过，该术语不包括过磷酸酯。术语包括磷酸酯的衍生物，特别是磷酸化反应得到的衍生物，以及每个单独的磷酸酯衍生物。例如，该术语包括单-生育酚磷酸酯(TP)和双-生育酚磷酸酯(T2P)的混合物，以及单独的TP和T2P。国家专利申请PCT/AU01/01475公开了合适的混合物。优选的，一种或多种电子转移试剂的一种或多种磷酸酯衍生物选自单-生育酚磷酸酯、双-生育酚磷酸酯、单-生育三烯酚磷酸酯、双-生育三烯酚磷酸酯及其混合物。特别优选的，一种或多种电子转移试剂的一种或多种磷酸酯衍生物选自一种或多种单-生育酚磷酸酯、双-生育酚磷酸酯、单-生育三烯酚磷酸酯、双-生育三烯酚磷酸酯的混合物。在一些情况下，有必要使用具有其它性能如增加的水溶性的磷酸酯衍生物，如磷脂。磷脂酰衍生物为有机磷酸酯的氨甲基衍生物。这些衍生物可以通过具有R1R2N(CH2)nOH结构的胺制备，其中n为l到6的整数，R1和R2为氢或碳数为3或更少的短烷基链。R1和R2可以相同或不同。磷脂酰衍生物是这样制备的用磷酸酯实体替换电子转移试剂的羟基质子，然后用胺取代磷酸酯实体，从而得到电子转移试剂的磷脂酰衍生物，其中的胺选自如乙醇胺或N，N'二甲基乙醇胺。磷脂酰衍生物的一种制备方法是使用碱性溶剂如吡啶或三乙胺和磷的氯氧化物制备中坚产物，该中间产物然后和胺的羟基反应，产生相应的磷脂酰衍生物，如P胆酰P生育酚二氢磷酸酯。在一些情况下，可以使用电子转移试剂的磷酸酯衍生物的络合物的附加性能，如改进的稳定性或输送能力。术语"磷酸酯衍生物的络合物"指的是一种或多种电子转移试剂的磷酸酯衍生物和一种或多种络合剂的反应产物，其中络合剂选自两性表面活性剂、阳离子表面活性剂、具有氮官能团的氨基酸和国际专利申请PCT/AUOl/01476(并入本申请作为参考)中公开的富含这些氨基酸的蛋白质。富含这些氨基酸的蛋白质例如含有至少l/62精氨酸、1/83组氨酸或l/65赖氨酸，各种形式的酪蛋白就属于这类蛋白质。其它的实例包括胰岛素、副甲状腺激素(PTH)、胰高血糖素、降血钙素、促肾上腺腺皮质激素(ACTH)、泌乳刺激素、抗干扰素-a、-p和，，促黄体生成激素(LH)(也称之为促性腺释放激素)、卵泡刺激素(FSH)和落刺激因子(CSF)。氨基酸成分的大部分实例列在下表中。蛋白质中的氨基酸胰岛素arghislys氨基酸110522占整个氨基酸的比例1/221/551/55PTHarghislys845051/1701/17胰髙血糖素180arg161/11his41/45lys101/18降血钙素93arg61/16his31/31]ys5]/19蛋白质中的氨基酸氨基酸占整个氨基酸的比例促肾上腺皮质激素41arg31/14his11/41lys41/10泌乳刺激素220arg121/18his91/13lys111/11干扰素-a和0133arg71/19his21/83lys71/19干扰素-Y166arg81/21his21/83lys211/8LH92arg51/18his21/46lys71/13FSH129arg51/26his21/65lys91/14CSF144arg61/24蛋白质中的氨基酸氨基酸占整个氨基酸的比例his31/48lys61/24GH域A0D960416arg21/8优选的络合剂选自精氨酸、赖氨酸和三取代胺，分子式例如为-NRfR3其中，W选自直链或支链C6-C22混合烷基及其羰基衍生物；R2和R3各选自H、CH2C00X、CH2CH0HCH2S03X、CH2CH0HCH20P03X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2S03X或CH2CH2CHOHCH2OPO:,X，如果R2和RS不都是H，则X是H、Na、K或链烷醇胺；以及R1是RCO时，则W可为CH3，W可以是(CH2CH2)N(C2H40H)-H2CHOP03，或者R2和R3都可以是N(CH2)2N(C孔OH)CH2COO-。优选的络合剂包括精氨酸、赖氨酸或亚氨基二丙酸月桂酯，其中碱性氮中心和磷酸酯络合形成稳定的络合物。羟基色原烷的磷酸酯衍生物可以通过多种剂型给人或动物投药，这些剂型如补充物、肠进料、肠胃外剂型、栓剂、口服剂型、气雾剂、眼剂、肺和鼻的给药剂型、皮肤给药如皮肤贴和膏剂。例如，羟基色原烷的磷酸酯衍生物可以通过口服或肠胃外给药的剂型给药。这些剂型包括药片、粉末、咀嚼片、胶囊、口服悬浮液、悬浮液、乳液或流体、儿童剂型和肠进料。剂型可以进一步包括在剂型制备中常用的添加剂，如淀粉或聚合物粘结剂、甜味剂、着色剂、乳化剂、包衣和类似物。其它合适的添加剂对于本领域技术人员来说是显而易见的。在一实施例中，剂型的肠衣和国际专利申请PCT/AU01/01206中公开的一样，该专利申请的内容并入此作为参考。在另一实施例中，剂型为口服剂型，和国际专利申请PCT/AU02/01003中公开的一样，该专利申请的内容并入此作为参考。优选的，治疗对象为动物。特别优选的，治疗对象为哺乳动物。最优选的的，哺乳动物为人。本发明不同实施例/技术方案可以参考下述，其中图1显示的是实例1的结果。图2显示的是实例2中对前列腺癌细胞学(DU-145)的效果。图3显示的是实例3中对MCF-7乳腺癌细胞增殖的效果。图4显示的是实例4中不同Y生育酚磷酸酯的相关活性。具体实施方式本发明不同实施例/技术方案可以参考下述非限制性的实例进行说明。实例1本研究将不同形式的生育酚(a，e和Y)和它们的磷酸化的化合物通过ADM和BASF对比抑制鼠大动脉光滑肌细胞(朋5￥0增殖的功效或性能。腿，96孔板(MTS活细胞试验)，6孔板(真实细胞计数试验)DMEM/F12培养基-GIBC0/生命技术，磷酸盐缓冲液(PBS),肽牛血清(FBS)，鼠大动脉光滑肌细胞(RASMCs)p:6-8细胞应用有限公司巻细胞浓度测定96单水溶液(MTS)-Promega,胰岛素/EDTA溶液(R-001-100)-Chemicon,胰岛素中和溶液(R-002-100)-Chemicon，乙醇*血球计,台盼蓝(在PBS中为0.5免w/v)a、e、Y生育酚磷酸酯异构体的混合物(单-生育酚磷酸酯和双-生育酚磷酸酯)旌鼠大动脉光滑肌细胞增殖-MTS试验a、P、Y生育酚和其磷酸化对应物的效果在RASMC中进行评价。每个化合物总共进行三种浓度的测试，即100、500和1，000ug/ml。鼠大动脉光滑肌细胞(RASMC)在96孔板(5，000细胞/孔)中的生长培养基中接种，并保持在37°C，59&C02中。24小时后，除去生长培养基，用DMEM/F12基础培养基替换。为了同步细胞，细胞为饥饿48小时的血清。然后用生长培养基及多种方法替换基础培养基，再持续4天。然后在100%乙醇(用于a-T、a-TP、Y-T和S-T)或100%乙酸(用于Y-TP和5-TP)中制成贮存液，然后稀释为最终浓度，最终乙醇浓度不超过0.1%，最终的乙酸浓度不超过0.02%。在这些试验条件下，这些载体的浓度没有大幅度的改变RASMC的增殖。每个试验重复8次。在试验末期，20ul的MTS试剂加入到每个孔中，在37。C，5%。02中培养近1小时后，读取490nm处的吸光率。CellTiter96Aqueous增殖试验是增殖试验中测定活细胞数目的色度方法。CellTiter96Aqueous由新型的四唑化合物(3_(4，5-二甲基噻唑-2-基)_5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS)溶液和电子偶联剂(硫酸酚嗪甲酯；PMS)组成。MTS由细胞生物还原成lll休aorinazan)产品，该产品溶于组织培养基中。Formazan在490rnn处的吸光率宽裕通过96孔板直接测定，吸光率和细胞数目成比例(即吸光率较大，活细胞数目较大)。结果和结论图1显示了由真实细胞计数评价的RASMC增殖在S和y-生育酚及其磷酸化对应物上的抑制百分比。结果证实，y和S-生育酚磷酸酯混合物诱导了RASMC模型(仅有10%的细胞和染色剂结合说明90%的细胞凋亡了)中的凋亡(细胞死亡)。而且，该结果表明y和S-生育酚磷酸酯混合物诱导了主要的细胞凋亡，而非磷酸化的形式没有诱导。和其它测试的类似物相比，ADM和BASF两者中的S-生育酚磷酸酯具有最大的功效。效果也是依赖于剂量的。对于在RASMC中没有诱导细胞凋亡的a-生育酚磷酸酯，其效果也是不同的，其通过控制的机理防止了过量细胞的增殖。通过a-生育酚磷酸酯，RASMCs没有繁殖，所有的细胞是健康和活的(通过染色剂吸收观察到的)。不过，在y和S-生育酚磷酸酯的情况下，RASMCs没有繁殖，剩下的细胞不是活的。这表明作用的机理不同。实例2本研究分别和一起对照了番茄红素和y-生育酚磷酸酯混合物对前列腺癌细胞的效果。材料和方法i^存潘應游荐养。DU-145前列腺癌细胞从AmericanTypeCultureCollection(Manassas,Virginia,USA)购买。jit存细胞在Dulbecco，s改性的Eagle培养基(DMEM)和的补充5%FBS(肽牛血清，GibcoBRL，GrandIslandNY)(GibcoBRL，GrandIslandNY)中培养，条件为潮湿的空气中含有5%C02、温度为37°C。细胞一周进行1-2次的次培养。^^f仝长试1^。通过用胰岛素/维尔烯处理，细胞在贮存板中胰蛋白酶化，加入等体积的无酚红RPMI-1640(GibcoBRL，GmndIslandNY)及补充的5%右旋糖酐活性碳处理的肽牛血清(DCFCS)。通过血球计，细胞重悬浮的细胞计数为0.1xl05细胞/m1,并平铺成单层，以0.5ml的整数倍放置在24孔的塑料培养基皿(Costar，CorningUSA)中。24小时后，细胞用合适浓度(参考表格)的y-牛育酚磷酸酯混合物(Y-TP)(VitalHealth)和番茄红素(Sigma)处理，或用番茄红素和无酚红RPMI培养基1640稀释的Y-TP及补充的5%DCFCS联合处理。培养基每隔3-4天更换。联合处理中含有的番茄红素和Y-TP的比例为1:l分子量/质量，其中番茄红素的变化范围为5ug/ml-40ug/ml。^^虜^#"。细胞用0.9%NaCl清洗两次，除去非黏附的死细胞，然后细胞用5-15分钟溶于0.5ml的2.5mMH印es缓冲液/1.5M的MgCl2，力i]两滴zap-oglobinII细胞溶解试剂(BeckmanCoulter,CoulterCorpUSA)。释放的细胞核悬浮在isotonIII(BeckmanCoulter,CoulterCorp，USA)，用Coulter计数器计数，颗粒尺寸设置为〉5um。所有细胞数分成三份。结果用平均士标准误差计算。P-值用单独的样品T-测试(通过标准软件包SPSS)测定。结果结果列在下表及相应的附图中。表l:从12天的Y-生育酚磷酸酯混合物得到的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2:从12天的番茄红素得到的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:从8天的番茄红素和Y-生育酚磷酸酯混合物得到的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>图2显示的是从上述三个表格(T"TP混合物(GTP-0805)、番茄红素(2pg/ml)及其组合在前列腺癌细胞系(DU-145))上得到的、以活细胞减少的百分比表示的结果。继结果表明，番茄红素和Y-生育酚磷酸酯混合物的组合仅仅在8天内对于杀死前列腺癌细胞有效。而且，结果显示，在组合中非常低的浓度的番茄红素比单独的番茄红素更有效的杀死前列腺癌细胞。结果也表明Y-生育酚磷酸酯混合物是有效的细胞凋亡试剂。实例3考査了Y-TP混合物、该混合物与三苯氧胺、常用的抗癌药物的组合对乳腺癌(MCF-7)细胞系的体外效果。旌^存:^^0^;^^0MCF-7人体乳腺癌细胞由K.Osborne博士提供的，传代数为390。贮存细胞在Dulbecco's改性的Eagle培养基(DMEM)(GibcoBRL，GrandIslandNY)、补充的5XFBS(肽牛血清，GibcoBRL，GrandIslandNY)(GibcoBRL，GrandIslandNY)和10-8M雌二醇的单层培养基中生长，条件为潮湿的空气中含有5%C02、温度为37°C。17-e雌二醇(细胞周期激活剂)溶于乙醇中，并在培养基中稀释1:10，000。细胞通过悬浮在0.069&胰岛素/0.02%EDTA(PH7.3)中每周进行次培养。^^T主长^^。通过用胰岛素/维尔烯处理，细胞悬浮在贮存板中，加入等体积的无酚红RPMI-1640(GibcoBRL,GrandIslandNY)及补充的596右旋糖酐活性碳处理的FCS(DCFCS)。通过血球计，细胞重悬浮的细胞计数为0.1xl05细胞/ml，并平铺成单层，以0.5ml的整数倍放置在24孔的塑料培养基皿(Costar，CorningUSA)中。24小时后，细胞用合适浓度三苯氧胺、番茄红素Y-TP混合物、T(VitalHealth)或其组合进行处理，含有或不含有用无酚红RPMI培养基1640及补充的5%DCFCS稀释的雌二醇。培养基每隔3-4天更换。联合处理中含有的番茄红素和Y-TP的比例为1:1分子量/质量，其中番茄红素的变化范围为5ug/ml-40ug/ml。潘應#教。细胞用0.9%NaCl清洗两次，除去非黏附的死细胞，然后细胞用5-15分钟溶于0.5ml的2.5raMH印es缓冲液/l.5M的MgCl2，加两滴zap-oglobinII细胞溶解试剂(BeckmanCoulter,CoulterCorpUSA)。释放的细胞核悬浮在isotonIII(BeckmanCoulter,CoulterCorp,USA),用Coulter计数器计数，颗粒尺寸设置为〉5um。所有细胞数分成三份。结果用平均士标准误差计算。P-值用单独的样品T-测试(通过标准软件包SPSS)测定。驢图3显示的是不同剂量的三苯氧胺(Tam)、Y-T(y_TOC)、单独的Y一TP(Y_TP混合物)和y-TP混合物与三苯氧胺(10、)对MCF-7乳腺癌细胞增殖的效果，不含雌二醇(-E)。和最高剂量的三苯氧胺相比，Y-TP混合物和最低剂量的三苯氧胺(10-^)的组合有较大的抑制效果，这表明有协调效果。继体外结果表明，y-生育酚磷酸酯混合物单独使用或与试剂如三苯氧胺组合，都对抗增殖和促凋亡活性。而且，结果显示，在组合中非常低的浓度的番茄红素比单独的番茄红素更有效的杀死前列腺癌细胞。结果也表明y-生育酚磷酸酯混合物是有效的细胞凋亡试剂。y-生育酚磷酸酯混合物对乳腺癌MCF-7细胞系很有效。对于乳腺癌相比，y-生育酚磷酸酯混合物较低的浓度就和三苯氧胺一样有效。和三苯氧胺(低剂量)一起有协同效应。此外，y-生育酚磷酸酯混合物以剂量依赖的方式抑制了癌细胞的生长。实例4在本实例中，考査了y-生育酚磷酸酯(y-T、y-TP、y-T2P和y-TPM)对MCF-7乳腺癌细胞的体外活性。7教嚴虜潘應^长姿斧.*细胞在附加有10%FBS的Du〗becco，s改性的Eagle培养基(DMEM)、75ci^的塑料组织细胞烧瓶中生成单层，条件为含有5%C02和95X空气的潮湿空气，温度为37°C。细胞通过悬浮在0.06%胰岛素/0.02%EDTA(pH7.3)中每两周进行次培养。My-7教蘼蘑潘蘑,潜遭试避^75试避入细胞在DMEM中胰蛋白酶化(在次培养时进行)，补充10先FBS。通过血球计，细胞重悬浮细胞数至0.1xl()5细胞/ml。细胞在l，OOO细胞/孔接种，或通过向96-孔细胞培养基板中加入100ul的细胞悬浮液接种。在开始试验前，细胞过夜，然后进行同步(用饥饿24小时的血清)。细胞同步后，用在100%乙醇(2、5、10、15、20、30&50pg/ml)中制备的合适浓度的试剂处理细胞，加入到RPMI培养基1640中，补充10X右旋糖酐活性碳处理的肽牛血清(DCFCS)。暴露于细胞的最终乙醇浓度不超过1%。72小时后，孔板用MTS试剂(如实例1所述)培养1小时。孔板用分光光度计在490nm处读板。每个测试的化合物重复8次(不同浓度如下所示)试剂縮写GT:Y-生育酚；GTP二Y-生育酚磷酸酯；GT2P=Y-双-生育酚磷酸酯；GTPM=Y-生育酚磷酸酯混合物(GTP和GT2P的组合)。请注意0ug/ml表示使用对照载体(即1%乙醇)。进行如下试验-单独的GT(noE)，浓度为O，2，5，10，15,20，30&50ug/ml-单独的GTP(noE)，浓度为0，2，5，10，15，20,30&50ug/ml-单独的GT2P(noE)，浓度为0，2，5，10，15，20，30&50lig/ml-单独的GTPM(noE)，浓度为0，2，5，10，15，20，30&50ug/ml驢结果列入下述表格和图4中。试剂0125GT0-6.10415.68536.36GTP07.325.6244.807GT2P07.2834.9131.07GTPM00.92724.92923.11浓度1068.68925.10239.47152.0681556.8243.51253.12673.2172079.76664.71964.55798.113082.74381-8198.43112,1975062,622109.928126.506127.996龃结果表明，GTPM是最有效的抗癌试剂，接着是GT2P、GTP，GT的效果最差，活性有限。结果表明，用Y-生育酚磷酸酯处理细胞时，癌细胞有极大的降低，这表明GTP、GT2P和GTPM可以治疗或减慢癌症的进展和形成。本发明中使用的词语"组成"不限制本发明声明排除其它任何改变或添加物。对本发明的改变和改进对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。这些改变和改进包含在本发明的范围内。权利要求1.一种减轻症状、治疗或预防癌症的方法，该方法包括给已患有癌症或可能患癌症的患者服用含有有效量的一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物的药物制剂，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷(δ)、8-甲基-6-羟基色原烷(γ)及其混合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的--种或多种羟基色原烷的磷酸酯衍生物选自单-生育酚磷酸酯、双-生育酚磷酸酯、单-生育三烯酚磷酸酯、双-生育三烯酚磷酸酯及其混合物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的羟基色原烷的磷酸酯衍生物为单-生育酚磷酸酯和双-生育酚磷酸酯的混合物。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的羟基色原垸的磷酸酯衍生物为单-8-甲基-6-羟基生育酚磷酸酯(Y)与双-8-甲基-6-羟基生育酚磷酸酯(Y)的混合物。5.根据权利要求1所述的方法，其中进一步包括服用一种或多种其它药物化合物的步骤，该其它药物化合物对羟基色原烷的磷酸酯衍生物的活性没有负面影响。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的其它药物化合物选自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、三苯氧胺、链霉菌和其混合物。7.—种减轻症状、治疗或预防癌症的方法，该方法包括给已患有癌症或可能患癌症的患者服用有效量的药物制剂，该药物制剂包括(a)—种或多种抗癌试剂；以及(b)—种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物的药物制剂，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原垸及其混合物。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的抗癌试剂为番茄红素或三苯氧胺。9.一种增加番茄红素功效的方法，该方法包括将番茄红素和一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物联合使用，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原垸及其混合物。10.—种增加抗癌试剂功效的方法，该方法包括将抗癌试剂和一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物联合使用，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。11.一种药物制剂，含有有效量的番茄红素和有效量的一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原垸、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。12.有效量的一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物及其混合物和合适的载体或稀释剂在制备减轻症状、治疗或预防癌症的药物中的应用，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。13.有效量的抗癌试剂、一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物及其混合物和合适的载体或稀释剂在制备减轻症状、治疗或预防癌症的药物中的应用，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。14.一种用于诱导细胞凋亡的药物组合物，其中该组合物含有有效量的一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。15.—种用于减轻症状、治疗或预防癌症的药物制剂，其中该制剂含有一种或多种抗癌试剂与有效量的一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原垸及其混合物。16.—种诱导细胞凋亡的方法，该方法包括服用有效量的一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原垸选自7，8-二甲基-6-羟基色原垸、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。17.—种诱导细胞凋亡的方法，该方法包括服用一种或多种抗癌试剂和一种或多种羟基色原垸的一种或多种磷酸酯衍生物，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。全文摘要本发明公开了一种减轻症状、治疗或预防癌症的方法，该方法包括给已患有癌症或可能患癌症的患者服用有效量的药物制剂，该药物制剂含有一种或多种羟基色原烷的一种或多种磷酸酯衍生物的药物制剂，其中羟基色原烷选自7，8-二甲基-6-羟基色原烷、8-甲基-6-羟基色原烷及其混合物。文档编号A61K31/352GK101232879SQ200680006930公开日2008年7月30日申请日期2006年3月3日优先权日2005年3月3日发明者E·奥古,R·吉安内罗,S·M·韦斯特申请人:生命健康科学有限公司