专利名称：：一种稳定的巴曲酶药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，更具体地涉及稳定的巴曲酶水溶液。技术背景巴曲酶(Batroxobin)是一种从巴西矛头蛇(SoWi^os毒液中分离纯化出来的蛋白分子，可以作为一种止血药的主要成分，大剂量使用时还具有降纤作用。上世纪六七十年代，瑞士素高(SolcoBasleLtd.)公司将含有该成分的提取物制成药物，并上市销售，商品名为Reptilase,该药物在中国也已经用于临床实践十多年了(商品名立止血@)。中国专利申请(申请号031160549)公开了一种基因重组方法，在甲醇酵母(Pichiapastoris)中分泌表达重组巴曲酶(RecombinantBat皿obin)蛋白。目前生物提取的含该成分的药物都采用冻干粉针剂型，临床使用时再用少量注射用水溶解。但是，冻干粉针剂的生产成本高，而且临床使用不便。生物提取巴曲酶，或通过基因重组方法获得的重组巴曲酶，若制成水针剂，又都极其不稳定。人血白蛋白是目前国内外制剂中的常用成分，但是使用人血白蛋白作为保护剂时，增加了引入外源性病毒的潜在危险，并且增加生产成本。因此，本领域迫切需要提供一种巴曲酶组合物，所述的组合物水溶液状态下也很稳定。
发明内容本发明旨在提供稳定的巴曲酶组合物。本发明的另一个目的是提供上述稳定的巴曲酶组合物的制备方法。本发明的再一个目的是提供上述稳定的巴曲酶组合物的用途。在本发明的第一方面，提供了一种含巴曲酶的组合物，它包括活性浓度从lKU/ml到2000KU/ml的巴曲酶，并且含有水解明胶作为稳定剂。更佳地，所述的组合物具有以下稳定性所述的组合物被配制(如稀释)成或复溶成lKU/ml巴曲酶水溶液后，在37'C下放置20天，含量保持不变。在另一优选例中，所述组合物中巴曲酶的活性浓度为l一400KU/ml。在另一优选例中，所述的组合物为液体形式。在另一优选例中，所述的组合物为注射剂，并且具有以下稳定性配制(如稀释)成lKU/ml巴曲酶水溶液后，在37'C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul经抗凝处理的人标准血浆能在60土20秒内凝固。在另一优选例中，所述的抗凝处理是加入抗凝剂，如肝素、水蛭素等。在另一优选例中，所述的组合物为固体形式。在另一优选例中，所述的组合物为冻干粉剂、喷雾干燥粉剂，并且具有以下稳定性当所述冻干粉剂、喷雾干燥粉剂复溶形成巴曲酶lKU/ml水溶液后，在37。C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul经抗凝处理的人标准血浆能在60土20秒内凝固。在另一优选例中，所述组合物中水解明胶的含量为O.l—5重量份，而所述组合物的干重为100重量份。更佳地，水解明胶的含量为0.5—3重量份。在另一优选例中，所述组合物还含有选自下组的辅助性稳定剂L一谷胱甘肽、甘氨酸、和/或海藻糖，所述的辅助性稳定剂的含量为1X10—4—2重量份L一谷胱甘肽、0.02—0.l重量份甘氨酸、禾卩/或0.02—0.l重量份海藻糖。在另一优选例中，所述的辅助性稳定剂的含量为1X10—3—0.1重量份L一谷胱甘肽、0.03—0.07重量份甘氨酸、和/或0.03—0.07重量份海藻糖。在另一优选例中，所述的组合物被配制(如稀释)成或复溶成水溶液后，PH为6.0±1.5。在另一优选例中，所述的组合物还含有缓冲剂，等渗等张调节剂，和抑菌剂。在另一优选例中，所述的组合物中包括1—8重量份磷酸钠盐，7—9X10—3重量份氯化钠，0.l—5重量份水解明胶，和l一5重量份三氯叔丁醇。在另一优选例中，所述的组合物包括2—5重量份磷酸钠盐，7.5—8.8X10—3重量份氯化钠，IX10—3—0.1重量份L一谷胱甘肽，0.5—3重量份水解明胶，和2—4重量份三氯叔丁醇。在另一优选例中，所述的组合物包括l一8重量份磷酸钠盐，7.5—8.8X10—3重量份氯化钠，1X10—4—2重量份L一谷胱甘肽0.1—5重量份水解明胶，l一.5重量份三氯叔丁醇，和0.02—0.1重量份甘氨酸，和/或0.02—0.1重量份海藻糖。在另一优选例中，所述的组合物包括2—5重量份磷酸钠盐，0.75—0.88重量份氯化钠，1X1(T3—0.1重量份L一谷胱甘肽0.5—3重量份水解明胶，2—4重量份三氯叔丁醇，和0.03—0.07重量份甘氨酸，和/或0.03—0.07重量份海藻糖。在本发明的第二方面，提供了上述组合物的制备方法，它包括步骤将巴曲酶和作为稳定剂水解明胶混合，从而上述的组合物。在本发明的第三方面，提供了一种上述组合物的用途，所述的组合物用于制备止血的药物。据此，本发明提供了一种巴曲酶组合物，所述的组合物水溶液状态下也很稳定。具体实施方式发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现巴曲酶与一定量的水解明胶混合成的组合物，在液体状态下能保持巴曲酶的生物学活性。发明人还发现在所述的溶液中加入一些对重组巴曲酶生物学活性起保护作用、且不与重组巴曲酶药理作用产生拮抗的缓冲盐、抗氧化剂、等渗等张调节剂和抑菌剂等，巴曲酶的稳定性能更佳。由此制得的组合物可以作为肌肉、静脉注射以及外用喷雾用物质。如本文所用，巴曲酶可是本领域熟知的提取物或基因重组蛋白，优选基因重组巴曲酶。如本文所用，1KU是取0.lml的人标准血浆于标准血凝仪(C2000-4血凝仪，北京普利生仪器有限公司)检测杯中，37。C预温3分钟，加入经适量稀释的待测定的巴曲酶溶液O.lml，计时，如果血浆在60士20秒凝固，则每lml该待测溶液中就含一个克氏单位(KU)的巴曲酶。如本文所用，"重量份"或"重量份数"可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如lmg、lg、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由l重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量=(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)X100%。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分3的含量为10%，组分b为90。/。。如本文所用，本发明的组合物被配制成lKU/ml巴曲酶水溶液，是指①若本发明的组合物为lKU/ml巴曲酶水溶液，直接使用；②若本发明的组合物为〉lKU/ml巴曲酶水溶液，则用水对其进行稀释，使成为lKU/ml巴曲酶水溶液；③若本发明的组合物为固态形式(如冻干粉剂或喷雾干燥粉剂)，则用水复溶，使其成为lKU/ml巴曲酶水溶液。如本文所用，辅助性稳定剂是指除水解明胶以外的其它稳定剂，它可以是本领域常用的稳定保护剂，例如但不限于，甘氨酸、海藻糖、乳糖、蔗糖、和/或麦芽糖。也可以是本领域常用的抗氧化抗聚集剂，例如但不限于谷胱甘肽(GSH)、维生素C、乙二氨四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)、聚山梨醇酯(如，Tween-20、Tween-80)等。本发明的组合物中的辅助性稳定剂优选L一谷胱甘肽、、甘氨酸、禾B/或海藻糖。其中可以含有1X10—J—2重量份L一谷胱甘肽，较佳地为1X10—3—0.1重量份；可以含有0.02—0.1重量份甘氨酸，较佳地为0.03—0.07重量份；可以含有0.02—0.1重量份海藻糖，较佳地为0.03—0.07重量份。水解明胶是本发明组合物中的必要物质，其含量为0.l—5重量份，较佳地为O.5—3重量份，更佳地为1一2重量份。本发明提供的组合物，当水溶液中巴曲酶规格为lKU/ml时，37'C下放置20天，经抗凝处理的人标准血浆能在60士20秒内凝固。较佳地，放置30天，经抗凝处理的人标准血浆能在60士20秒内凝固。更佳地，放置40天，经抗凝处理的人标准血浆能在60土20秒内凝固。本发明提供的组合物中还包括缓冲体系，所述的缓冲体系选自但不限于醋酸一醋酸盐缓冲对、磷酸一磷酸盐缓冲对、或Tris—盐酸缓冲对，优选磷酸一磷酸盐缓冲对。本发明提供的组合物中包括l一8重量份磷酸盐，较佳地是2—5重量份。本发明的组合物所形成的溶液pH为6.0±1.5，较佳地pH为6.O土l.O，更佳地pH为6.0±0.5。本发明提供的组合物中还可以包括等渗等张调节剂、鳌合剂、表面活性剂、抑菌剂等。可以使用本领域常规的等渗等张调节剂，例如但不限于氯化钠(NaCl)、丙酮酸钠(NaPyr)、葡萄糖，其中优选氯化钠。本发明的组合物中可以含有7一9X10—3重量份氯化钠，较佳地为7.5—8.8X10—3重量份。可以使用本领域常规的抑菌剂，例如但不限于苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对轻基苯甲酸丁酯、苯酚、三氯叔丁醇、或柳硫汞。优选三氯叔丁醇。本发明的组合物中可以含有l一5重量份三氯叔丁醇，较佳地为2—4重量份。本发明提供的组合物可以是固态形式也可以是液体形式。所述的固态形式为冻干粉剂、喷雾干燥粉剂。所述的液体形式是注射剂。优选注射剂或液体喷雾剂。本发明提供的组合物为注射液时，它包括O.l—5mg/ml的水解明胶；较佳地为0.5—3mg/ml，更佳地为1—2mg/ml。本发明提供的注射液，巴曲酶规格为lKU/ml时，37。C下放置20天，经抗凝处理的人标准血浆能在60土20秒内凝固。较佳地，放置30天，经抗凝处理的人标准血浆能在60土20秒内凝固。更佳地，放置40天，经抗凝处理的人标准血桨能在60士20秒内凝固。本发明提供的注射液pH为6.0土1.5，较佳地pH为6.0±1.0，更佳地pH为6.0±0.5。本发明提供的注射液可含有10—50mM磷酸盐，较佳地为15—30mM。本发明提供的注射液中还可以包括等渗等张调节剂、还原剂、鳌合剂、表面活性剂、抑菌剂等。其中等渗等张调节剂氯化钠的含量为0.7%—0.9%(mg/100ml)，较佳地为0.75—0.88%;抗氧化抗聚集剂谷胱甘肽的含量为含有1X10—5—0.2mML—谷胱甘肽，较佳地为1X10—4—0.OlmM;抑菌剂三氯叔丁醇的含量为l一5mg/ml，较佳地为2—4mg/ral。可以使用本领域常规的方法得到本发明的组合物，将巴曲酶与水解明胶混合。可以使用本领域常规的方法获得固态形式的本发明组合物。也可以将巴曲酶与水解明胶溶解于注射用水中得到溶液形式的本发明组合物。一种优选的方式，是将巴曲酶、水解明胶、缓冲体系、等渗等张调节剂、还原剂、鳌合剂、表面活性剂、和抑菌剂溶解于注射用水中得到溶液形式的本发明组合物。本发明提供的组合物可用于制备止血剂。可以将液体形式的本发明组合物直接进行肌肉或静脉注射或液体喷雾剂；也可将固态形式的本发明组合物复溶于注射用水中进行肌肉或静脉注射或液体喷雾剂。本发明的主要优点在于1、本发明提供的组合物可以使其中的巴曲酶在液体状态下较长时间地保持生物活性。2、本发明提供的组合物中所含有的稳定剂没有引入外援性病毒的潜在危险。3、本发明提供的组合物制备成本低，且使用方便。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。制备实施例l一7制备巴曲酶液体制剂将构造的巴曲酶甲醇酵母工程菌株(CCTCCNo:M203006)上罐发酵，经过一系列层析纯化步骤，获得高纯化的基因重组巴曲酶与含有下表中的各辅料组分的注射用水溶液混合，得到重组巴曲酶液体制剂。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>v代表该组配方选择了本辅料。试验实施例8缓冲体系筛选发明人设计了七组制剂处方，各处方中成分如下表，分别考察这七组处方在不同缓冲体系下，重组巴曲酶的生物活性以及制剂的基本性能(外观、色泽、澄明度、pH)等情况。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>一—v代表该组配方选择了本辅料。各组辅料的使用量是本领域重组蛋白质类药物制剂处方中通常使用的剂量如甘露醇为4%;醋酸盐、磷酸盐和Tris-HC1缓冲体系均为20niM;人血白蛋白为0.5%。缓冲体系筛选的结果根据动物试验的结果，确定的制剂规格为lKU/ml/瓶。1KU的含义是取0.lml的人标准血浆于标准血凝仪(C2000-4血凝仪，北京普利生仪器有限公司)检测杯中，37t预温3分钟，加入经适量稀释的待测定的巴曲酶溶液0.lral，计时，如果血浆在60士20秒凝固，则每lml该待测溶液中就含一个克氏单位(KU)的重组巴曲酶。下面是重组巴曲酶在上述七组处方中，存放于37'C下，经过72小时后的结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>>196s表示超出血凝仪的最大量程仍没有凝血发生。由于每组配方中重组巴曲酶的活性浓度均为1KU/ml，也就是说在0小时(稀释完成时)时，将100ul含重组巴曲酶的某一配方的溶液同100ul的经抗凝处理的人标准血浆混合，在37"C下，能在60土20秒内凝固。考察重组巴曲酶各组配方溶液中的活性变化情况就可以初步判断稳定性状况，选择最适合的缓冲体系。上表的数据显示，尽管初始时凝血时间都比较接近，并且都符合60±20秒范围，但在72小时后，不加保护剂的配方l、2、4、6凝血时间都大大超出60士20秒范围，并且1、2、4三组配方都>196(超出血凝仪的最大量程仍没有凝血发生)。加入保护剂的三组配方中，只有配方5凝血时间超出60±20秒范围，说明在pH7.4条件下，即使加入保护剂，重组巴曲酶也容易丧失活性。结果表明，配方3、7的溶液中重组巴曲酶的活性在72小时仍符合60±20秒范围，但两组相较，在加入保护剂的情况下，以磷酸盐缓冲pH6.0为体系的配方7比以醋酸盐缓冲pH5.0体系的配方3要稳定。实施例9一15稳定性测试实施例根据上述缓冲体系的筛选结果，选用pH6.0的磷酸盐缓冲作为基本缓冲体系，同时加入各种不同的稳定保护剂进行稳定性考察。参见实施例l一7的配方组成实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例7磷酸钠盐缓冲20mMpH6.0VVVVV氯化钠0.85%VVVVVVL一谷胱甘肽O.OOOlmMVV水解明胶lmg/mlV—一————甘氨酸5%一—一—海藻糖5%一——一—水解明胶0.lmg/ml一一一一—水解明胶2mg/ml—一一—一V甘氨酸3.4%一———一三氯叔丁醇3mg/ml一.—画一—一—v代表该组配方选择了本辅料。37'C稳定性实验结果实施例l一7的重组巴曲酶制剂规格均为lKU/ml，也就是说在各个检测点，将100ul含重组巴曲酶的某一配方的溶液同100ul的经抗凝处理的人标准血浆混合，在37°〇下，能在60土20秒内凝固。超出范围的均算不合格。在进行制剂稳定性试验时，将原液稀释至活性浓度为lKU/ml进行。实施例l一7的重组巴曲酶制剂存放在37'C下，于各个检测点的凝血时间(秒)。见下表(天)071421286090120150180实施例169.671.874.28075.175.073.876.481.782.0实施例252.0100.2实施例36792.5实施例471.199.2实施例567.770.271.873.769.467.868.768.972.473.7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>>196s表示超出血凝仪的最大量程仍没有凝血发生。结果表明，使用水解明胶作为保护剂，可以使重组巴曲酶显示出较高的稳定性，能在37。C下稳定100天以上。实施例16稳定性测试实施例采用实施例7中的配方，保存高浓度的重组巴曲酶原液(重组巴曲酶蛋白浓度为2.5mg/ml)。将层析纯化获得的重组巴曲酶溶液，通过G25脱盐层析柱更换重组巴曲酶的缓冲体系，以检验该配方对保护重组巴曲酶原液或高浓度的重组巴曲酶效果。具体操作如下步骤1:用组成如实施例7中的各组分和含量的辅了配制的溶液平衡G25层析柱约4个柱床体积；步骤2:按1/4柱床体积的量上重组巴曲酶溶液，进行脱盐层析处理，收集流出液的吸收峰部分，此时重组巴曲酶溶液就转变成了平衡G25层析柱的实施例7配方形成的溶液。步骤3:测定蛋白浓度，同时测定活性，作为0时间点的重组巴曲酶溶液稳定性试验的初始值(1.02mg/ml,200KU/ral)。步骤4:将步骤3中获得的重组巴曲酶溶液分装为200ul/瓶，放置37i:。分别在如下表中所列的时间点取样，按2000X倍稀释后，用血凝仪测定凝血时间，以判断重组巴曲酶的稳定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从实际测定结果可以看出，配方7中的组分不仅对稀释后重组巴曲酶稳定性保存有利，对保存高浓度(活性)的重组巴曲酶也非常有效。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种含巴曲酶的组合物，其特征在于，它包括活性浓度从1KU/ml到2000KU/ml的巴曲酶，并且含有水解明胶作为稳定剂。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为液体形式。3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为注射剂，并且具有以下稳定性配制成lKU/ml巴曲酶水溶液后，在37'C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul经抗凝处理的人标准血浆能在60±20秒内凝固。4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为固体形式。5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为冻干粉剂、喷雾干燥粉剂，并且具有以下稳定性当所述冻干粉剂、喷雾干燥粉剂复溶形成巴曲酶lKU/ral水溶液后，在37。C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul经抗凝处理的人标准血浆能在60土20秒内凝固。6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中水解明胶的含量为O.l—5重量份，而所述组合物的干重为100重量份。7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有选自下组的辅助性稳定剂L一谷胱甘肽、甘氨酸、和/或海藻糖，所述的辅助性稳定剂的含量为1X10—4—2重量份L一谷胱甘肽、0.02—0.1重量份甘氨酸、和/或0.02—0.1重量份海藻糖。8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物被配制成或复溶成水溶液后，pH为6.0士1.5。9.一种如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，它包括步骤将巴曲酶和作为稳定剂水解明胶混合，从而形成权利要求1所述的组合物。10.—种如权利要求1所述的组合物的用途，其特征在于，所述的组合物用于制备止血的药物。全文摘要本发明公开了一种含有巴曲酶的组合物，它包括0.1-5重量份的水解明胶。本发明公开的组合物即使以液体状态保存也具有高度稳定性及生物学活性。文档编号A61P7/04GK101274096SQ20071003867公开日2008年10月1日申请日期2007年3月29日优先权日2007年3月29日发明者文张,曹之舫,潘学工,陈佩新,黄秀东申请人:上海万兴生物制药有限公司