专利名称：体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程中用组织工程再造，器官的方法，具体涉及一种体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨以修复大节段骨缺损、股骨头坏死等大块骨缺损的治疗方法。
背景技术：
目前能够用于临床的组织工程产品主要局限于几种皮肤和软骨的组织工程产品，品种和数量都非常有限，行使的功能和结构也相对简单。而临床最常见的长骨大段骨缺损是长期困扰临床医疗的难点和热点问题，其修复与重建自然成为骨组织工程研究领域最重要的主攻方向之一。但是大块组织工程骨的体内成骨过程非常复杂，是一个包括应力刺激下的涉及多种生长分化调节因子作用的骨种子细胞在支架材料内的迁移、增殖、和分化等一系列复杂有序的过程。而这些功能的行使是以血供重建为前提和保障的，迅速和有效的血供能为大块组织工程骨内部的种子细胞提供及时和充足的营养，包括各种生长分化调节因子，同时带走局部代谢所产生的废物。一般认为细胞在血管周围150-200um内才能通过弥散来保持存活，如果不能建立内在的血液循环，组织工程只能限于构建较薄而小的组织。而目前的血管化技术存在不少的问题，利用宿主体内的血管进行血管化，不仅受到局部血管条件的限制，还因为血管的长入需要一定的时间，且会增加机体额外创伤，从而制约了大块组织工程组织的构建。因此，组织工程骨的血管化问题就成为骨组织工程由基础向临床应用过渡的亟待解决的关键性技术难题，引起了广泛的关注。
生长因子对种子细胞增殖、迁移、分泌、分化活性起着至关重要的作用，而目前常用的细胞生长因子载体缓释系统存在载体的突释和持续稳定释放、降解过程中产生的分解物对细胞产生不利影响以及多因子的协同释放机制等问题尚未解决。尽管组织工程研究已深入到基因水平，但由于基因治疗普遍存在的有效性和/或安全性等问题而难以走向临床应用。
总之，大块组织工程骨血管化以及生长因子持续稳定的释放等关键性技术难题至今未找到理想的解决办法，使其临床应用受到了严重限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种为解决临床长骨大段骨缺损、股骨头坏死等长期面临的困难提供一种新的方法。以来源广泛的天然滨珊瑚或其生物衍生材料珊瑚羟基磷灰石为支架材料，根据骨缺损情况进行加工塑形，复合自体骨髓基质干细胞后形成具有高渗透性三维孔隙结构的生物活性复合物，应用临床使用的泵系统进行组装，通过少量的灌注营养液，微量生长因子的协同有序的高效作用，采用自体骨髓基质干细胞复合生物相容性良好的支架材料，具有安全高效，操作简单，成本低廉的优点。
本发明是这样来实现的(一)骨髓基质干细胞(BMSC)的提取、分离和培养其方法步骤如下(1)骨髓基质干细胞的提取无菌条件下，于髂后上棘处骨穿针穿刺，预肝素化处理的注射器抽出骨髓约10ml。
(2)骨髓基质干细胞的分离和扩增培养将含有1％肝素抗凝剂的骨髓置于离心管中，加入约为骨髓体积1∶1～2∶1的无血清培养基，在1000r/min离心10min，弃去上清液，用PBS缓冲盐清洗2～3次，去除上层脂肪和组织液，将下面细胞层(含BMSCs的混合物)用完全培养基再悬，吸入培养皿中，加入完全培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱进行培养。培养约2-3w，80％融合后用质量浓度为0.25％胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA混合液消化，终止消化后进行细胞传代，继续培养扩增至第三代细胞。
(二)珊瑚复合人工骨的制备根据管状骨缺损的大小和形状，将天然滨珊瑚(NC)加工成内径2mm未贯通的圆桶状，超声清洗，高压蒸汽消毒后备用。用含自体血清的完全培养基将第三代BMSC制成10×106/ml细胞悬液。注射器吸取BMSC悬液滴入NC，确保NC完全浸润且不渗漏，使成BMSC-NC复合物。置于37℃体积分数为5％的CO2孵育箱中5小时后，加入含自体血清的完全培养基培养。BMSC-NC复合物体外培养5天，待BMSC与NC贴附牢固后再回植入骨缺损处。
(三)灌注系统的建立将圆桶状的BMSC-NC复合物直接嵌入骨缺损处采用适当方式固定。在此基础上安装双泵组成的灌注系统，术后闭合创口。整个系统分别由体内和体外使用的双泵系统联合组成，体内使用的泵系统为皮下植入式给药装置(如KL-II型，陕西省科联新技术开发中心)；体外使用的泵系统为便携式微量注射泵(如AJ5805型，上海安洁电子设备有限公司)。皮下植入式给药装置由注射座和硅橡胶导管二部分组成，管的一头插入呈圆桶状的未贯通的复合有BNSC的NC中央。插入到NC内的导管的插入部分有多个侧孔。管道的另一头为埋植在左侧臀部皮下的注射座。灌注药物时，由有经验的医护人员执行，首先找准穿刺窗口，然后消毒皮面，将针头通过皮肤垂直刺入注射座，直到针头与泵体底部接触，再开始注入药物。针头与体外的AJ5805便携式微量注射泵相连通，该注射泵是一种操作方便、便于携带的给药装置，由于其推注速度可以调控，如使用10ml一次性注射器的流量范围在0.1ml/h～20ml/h，故可实现持续、缓慢低剂量地输入含自体血清的培养液以及rhBMP-2、rhbFGF等细胞因子。
根据公式总的灌注量＝复合物中完全浸润的液体量+管道系统中滞留的液体量。根据低浓度的rhbFGF能促进BMSC的增殖与活力，并能诱导支架材料周围组织毛细血管向NC-BMSC复合物内长入，因此，灌注rhbFGF的浓度始终维持在2ng/ml；根据极低剂量的rhbFGF(1-2ng/ml)与小剂量的rhBMP-2(10-25ng/ml)联合应用能够产生相互协同的最佳成骨效应，采取每天rhBMP-2(10-25ng/ml)和rhbFGF(1-2ng/ml)联合给药。通过体外便携式微量注射泵调控灌注速度，实现灌注与复合物周围组织吸收之间的平衡。
本发明以来源广泛的天然滨珊瑚或其生物衍生材料珊瑚羟基磷灰石为支架材料，可根据骨缺损情况进行加工塑形，复合自体骨髓基质干细胞后形成具有高渗透性三维孔隙结构的生物活性复合物，植入长骨大节段缺损处，应用便携式微量泵联合皮下植入式给药装置将含有自体血清、生长因子rhbFGF、RHBMP-2的细胞培养液持续微量稳定地灌注到复合物中央，及时供应早期营养，并通过rhbFGF诱导周围组织毛细血管向复合物内长入，促进复合物快速血管化。重要的是通过便携式微量泵调控灌注速度，可使灌注营养的速度与周围组织吸收的速度一致，实现灌注系统——复合物——周围组织之间的微循环通路，不仅将代谢废物排除，还能通过生长因子rhbFGF、RHBMP-2发挥协同高效的诱导成骨作用，促进成骨的速度和质量，为种子细胞提供理想的代谢微环境。由于支架材料可生物降解，最终实现骨缺损形态和功能的重建。本发明应用临床使用的泵系统进行组装，通过少量的灌注营养液，微量生长因子发挥协同高效作用。
本发明的优点是
1、可解决两个关键问题。由于灌注的营养液中含有诱导血管生成的细胞因子，不仅可以保证大块组织工程骨种子细胞的早期营养，而且通过rhbFGF能够诱导周围组织血管向NC移植物内长入，实现大块组织工程骨的快速血管化，促进后期血供的重建；细胞生长因子以一定的浓度持续/间断持续微量缓慢的灌注，因而可实现细胞生长因子在损伤局部持续/间断持续微量稳定的缓释效果。
2、安全高效。由于采用自体血清，可避免异种或异体血清的副作用。细胞生长因子的成分、配方以及释放量和速度可以人为地调控，故可实现生长因子rhBMP-2、rhbFGF间的协同诱导成骨的高效应。既可减少细胞生长因子的用量，节约经费，又可避免单次给药剂量过大的副作用。
3、通过NC三维相通的孔道，为BMSC提供营养，同时推动局部代谢产生的废物向外周溢出，被皮下组织吸收。这样就建立起一个“三维微循环通路”，为种子细胞提供类似于生理状态的理想的代谢微环境。
4、符合临床应用的实际需要，操作可行性强。可根据情况适时更换微量注射泵上使用的一次性注射器及输液针管，加之皮下植入式给药系统全部安装在体内，该装置的注射座位于皮下，每次进针给药前仅需简单的皮肤消毒即可，因而操作方便，能最大限度地保证无菌操作，避免感染；便携式微量注射泵可以随身携带，便于患者活动；活动所提供的适量应力刺激加上生物体本身复杂微妙的微环境更有利于成骨。
具体实施例方式
以该方法修复山羊胫骨干大节段骨缺损为例1、羊BMSC的培养与扩增分别抽取山羊自体骨髓，采用1％戊巴比妥钠0.3ml/kg静脉麻醉，速麻安、阿托品肌肉注射复合麻醉。双侧髂骨处备皮后严格无菌条件下用16号骨穿针穿刺抽取红骨髓10ml，将含有1％肝素抗凝剂的骨髓置于离心管中，加入约为骨髓体积1∶1～2∶1的无血清培养基，在1000r/min离心10min，弃去上清液，用PBS清洗2～3次，去除上层脂肪和组织液，将下面细胞层(含BMSCs的混合物)用完全培养基再悬，吸入培养皿中，加入完全培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱进行培养。培养约2-3w，汇合成单层后用质量浓度为0.25％胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA混合液消化，终止消化后进行细胞传代，继续培养扩增至第三代细胞。
2、珊瑚复合人工骨的制备根据山羊胫骨解剖资料数据，将天然滨珊瑚(NC)加工成长25mm，外径12mm，内径2mm未贯通的圆桶状，超声清洗，高压蒸汽消毒后备用。用含自体血清的完全培养基将第三代BMSC制成10×106/ml细胞悬液。注射器吸取BMSC悬液滴入NC，确保NC完全浸润且不渗漏，使成BMSC-NC复合物。置于37℃体积分数为5％的CO2孵育箱中5小时后，加入含自体血清的完全培养基培养。BMSC-NC复合物体外培养5天，待BMSC与NC贴附牢固后再回植入骨缺损处。
3、羊胫骨干骨缺损模型的建立健康中国青山羊，12个月龄，体重14.5-15.5kg的成年山羊。左后肢前外侧弧形切开皮肤，沿胫前肌与胫骨间隙分开进入。于胫骨外侧8孔重建钢板内固定，除第4、5孔外，骨折远近段各三枚螺钉固定。环行剥离并切除胫骨中段骨膜，于钢板第3、4及5、6孔之间分别以线锯锯断胫骨，移除游离骨段，大段骨缺损动物模型构建完成(骨与骨膜缺损长度2.5cm)。术后肌肉注射普鲁卡因青霉素80万u/d，高蛋白青饲料圈养，术后14d拆线。
4、单纯材料组(对照组)将健康中国青山羊胫骨干骨缺损模型9只，分别将NC直接嵌入骨缺损处。
5、灌注系统的建立准备健康中国青山羊9只，建羊胫骨干骨缺损模型，将圆桶状的未贯通的复合有BNSC的NC直接嵌入骨缺损处，在此基础上安装双泵组成的灌注系统，整个系统分别由体内和体外使用的双泵系统联合组成，体内使用的泵系统为皮下植入式给药装置；体外使用的泵系统为便携式微量注射泵。皮下植入式给药装置由注射座和硅橡胶导管二部分组成，管的一头插入呈圆桶状的未贯通的复合有BNSC的NC中央。插入到NC内的导管长20mm，管道的插入部分有多个侧孔。管道的另一头为埋植在左侧臀部皮下的注射座。灌注药物时，由有经验的医护人员执行，首先找准穿刺窗口，然后消毒皮面，将针头通过皮肤垂直刺入注射座，直到针头与泵体底部接触，再开始注入药物。针头与体外的便携式微量注射泵相连通，该注射泵是一种操作方便、便于携带的给药装置，由于其推注速度可以调控，如使用10ml一次性注射器的流量范围在0.1ml/h～20ml/h，故可实现持续、缓慢低剂量地输入含自体血清的培养液以及rhBMP-2、rhbFGF等细胞生长因子。
结果1一般情况采用每天rhBMP-2(25ng/ml)t rhbFGF(2ng/ml)联合给药。通过体外便携式微量注射泵调控灌注速度，实现灌注与复合物周围组织吸收之间的平衡。动物术后1W完全站立，2W可自由活动。其中有一只山羊因放养不当，针头滑落一次，经及时消毒，并更换一次性无菌针管和灌注液后继续灌注。连续观察各实验动物手术切口周围组织均无红肿、渗出等炎性表现。
2灌注情况2.1体外灌注情况在体内灌注给药前，经体外灌注含或不含有细胞因子的含自体血清的完全培养基，观察到灌注的液体能均匀渗透整个复合物支架，当灌注量超过2.6ml整个支架被完全浸润，并逐渐溢出。
2.2体内灌注情况每天每次5ml的灌注液体量持续20小时给完，持续微量缓慢灌注的超过2.6ml的部分液体逐渐被皮下组织吸收，因而，未观察到复合物支架周围液体潴留而出现的肿胀、渗出等现象，伤口愈合良好。
2.3 X线观察术后8W x线观察显示8只羊近同构模型组织工程骨周围形成骨痂，并与胫骨缺损部分融合；对照组术后8W所有羊都观察到支架材料大部分降解、吸收。HE染色进行组织学分析，实验组大量骨组织形成，对照组织见纤维组织生长分别于术后1d，2W，8W，进一步通过骨缺损植入物OD(光密度)值的测定，观测实验组骨形成，实验组与对照组植入材料OD指数组间比较，1d时统计结果无显著性差异(P＞0.05)；2W时统计结果差异具有显著意义(P＜0.05)；8W时统计结果差异非常显著(P＜0.01)。
权利要求
1.体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法，其特征在于方法步聚如下(一)骨髓基质干细胞的提取、分离和培养(1)骨髓基质干细胞的提取无菌条件下，于髂后上棘处骨穿针穿刺，预肝素化处理的注射器抽出骨髓；(2)骨髓基质干细胞的分离和扩增培养将含有1％肝素抗凝剂的骨髓置于离心管中，加入约为骨髓体积1∶1～2∶1的无血清培养基，在1000r/min离心10min，弃去上清液，清洗2～3次，去除上层脂肪和组织液，将下面细胞层用完全培养基再悬，吸入培养皿中，加入完全培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱进行培养，培养2-3w，汇合成单层后用质量浓度为0.25％胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA混合液消化，终止消化后进行细胞传代，继续培养扩增至第三代细胞；(二)珊瑚复合人工骨的制备根据管状骨缺损的大小和形状，将天然滨珊瑚加工成内径2mm未贯通的圆桶状，超声清洗，高压蒸汽消毒后备用，用含自体血清的完全培养基将第三代BMSC制成10×106/ml细胞悬液，注射器吸取BMSC悬液滴入NC，确保NC完全浸润且不渗漏，使成BMSC-NC复合物，置于37℃体积分数为5％的CO2孵育箱中5小时后，加入含自体血清的完全培养基培养，BMSC-NC复合物体外培养5天，待BMSC与NC贴附牢固后再回植入骨缺损处；(三)灌注系统的建立将圆桶状的BMSC-NC复合物直接嵌入骨缺损处采用适当方式固定，在此基础上安装双泵组成的灌注系统，术后闭合创口，整个系统分别由体内和体外使用的双泵系统联合组成，体内使用的泵系统为皮下植入式给药装置；体外使用的泵系统为便携式微量注射泵，皮下植入式给药装置由注射座和硅橡胶导管二部分组成，管的一头插入呈圆桶状的未贯通的复合有BNSC的NC中央，插入到NC内的导管的插入部分有多个侧孔，管道的另一头为埋植在左侧臀部皮下的注射座，针头与体外的便携式微量注射泵相连通，实现持续、缓慢低剂量地输入含自体血清的培养液以及rhBMP-2、rhbFGF细胞因子。
全文摘要
一种体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法，其特征在于方法步聚如下1.骨髓基质干细胞的提取、分离和培养；2.珊瑚复合人工骨的制备；3.灌注系统的建立。本发明的优点是1.不仅解决大块组织工程骨快速血管代的难题，还可实现生长因子在损伤局部持续或间断持续微量稳定的缓释；2.具有安全高效、操作简单、成本低廉的优点。
文档编号A61L27/02GK101091804SQ20071013750
公开日2007年12月26日 申请日期2007年7月18日 优先权日2007年7月18日
发明者戴江华, 罗军, 戴闽 申请人:戴江华