专利名称：：诱导核受体tr3表达的强心苷类化合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物及其应用。技术背景TR3是一种人源NR4A1基因编码的孤儿核受体，目前克隆的鼠源基因包括Nur77(小鼠)和NGF-IB(大鼠)，它们与近年鉴定的另外两个近亲成员NOT-l和NOR-l组成一个引人注目的亚家族。TR3是一种立早基因，许多外界信号，包括各种生长因子(如神经生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、血清生长因子)、钙离子载体、KC1、佛波酯、视黄酸家族、Tax蛋白等都能诱导TR3的表达。TR3家族成员的结构具有较为独特的结构特征，其转录活性主要由N端的转录激活区AF1控制，C端配体结合区口袋状结构较浅，目前尚未发现内源或外源的配体结合于此区。TR3的功能主要通过转录水平或通过蛋白水平的修饰进行调控。作为转录因子，TR3可通过单体形式或同源二聚体或寡聚体形式，与视黄醇受体RXR形成异源二聚体形式，结合到特定DNA应答元件上，调控靶基因的转录活性，在细胞生长、分化和凋亡过程发挥重要作用。TR3的表达与细胞增殖和凋亡均有关系，在各种肿瘤中是一个关键的调控基因，同时，近年发现它可能与HBV感染引起的肝炎和肝癌有关，还可能参与动脉粥样硬化的调控。因而，TR3是人体内一个重要的耙基因。由于许多抗癌药、凋亡诱导剂以及某些中草药成分可通过调控TR3的表达和调控TR3的活性起作用，TR3作为一个非常有用的分子耙点用于筛选新的抗癌药物。TR3也是肝炎病毒蛋白作用的靶分子之一，肝炎病毒蛋白对于TR3转录因子蛋白正常调节功能的干扰，与慢性病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌的发生发展有密切关系。另外，TR3亚家族成员在血管壁高表达可能促进动脉粥样硬化发病，Nur77调控基因转录激活参与巨噬细胞炎症反应何血管平滑肌细胞增值；可以推测，Nur77位于细胞核内可能促进动脉粥样硬化，位于细胞核外时转录激活功能被抑制，可能抑制动脉粥样硬化病变进展。因此，调控核受体TR3表达的化合物，可能在核受体TR3相关的癌症、肝炎、动脉粥样硬化等疾病的预防和治疗中显示出广阔的前景。本发明要解决的技术问题之一是提供具有以下通式的能诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物其中R！为CH3、CHO或CH2OH;R2为H或OH;R3为H或OH;R4为糖类所组成的直链糖链或支链糖链。所述Ri最好为CHO，所述R2最好为H，所述R3最好为OH，所述糖类包括单糖、双糖、三糖、四糖、五糖、六糖中的一种或一种以上的组合。所述糖类更具体地包括葡萄糖(f3-D-glucose)、葡萄糖(a-D-glucose)、鼠李糖(a-L-rhamnose)、半乳糖(P-D-galactose)、半乳糖(a-D-galactose)、甘露糖(a-L-mannose)、阿拉伯糖(卩-D-arabinose)、阿拉伯糖(a-D-arabinose)、木糖((3-D-xylose)、木糖(a-D-xylose)、核糖(卩-D-ribose)、核糖(a-D-ribose)、来苏糖(卩-D-lyxose)、来苏糖(a-D-lyxose)、夫糖(a-D-fucose)中的一种或者一种以上的组合。所述糖类还包括6-去氧糖、2，6-二去氧糖、2-甲醚-6-去氧糖，3-甲醚-6-去氧糖、4-甲醚-6-去氧糖中的一种或者一种以上的组合。本发明的诱导核受体TR3(Nur77)表达的强心苷类化合物的特征还在于Ri为CHO，R2为H，R3为OH，R4为"-(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-0-"-(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷；或者R,为CHO，R2为H，R3为H，R4为a，L-鼠李糖基的化合物，化学
发明内容5名为19-醛基-毛地黄-3-0-C(，L-鼠李糖苷；或者R,为CHO，R2为H，R3为OH，R4为,6-去氧-2-(9-甲基-阿洛糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-0--去氧-2-0-甲基)-阿洛糖苷；或者R,为CHO，R2为H，R3为OH，R4为AD-6-去氧-古洛糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-古洛糖苷；或者为CHO，R2为H，R3为OH，R4为",D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者Ri为CH20H，R2为H，R3为H，R4为ct,L-鼠李糖基的化合物，化学名为坎纳醇-3-Oct-L-鼠李糖苷；或者R!为CH20H，R2为H，R3为OH，R4为y，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化学名为羊角拗醇-3-0-"-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者R,为CHO，R2为OH，R3为OH，R4为",D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化学名为12-羟基-毒毛旋花子-3-0-^D-6-去氧-阿洛糖苷；或者R,为CHO，R2为H，R3为OH，R4为/-6-去氧-2-6>-甲基-阿洛糖基的化合物，化学名为12-羟基-毒毛旋花子-3-0_"-(6-去氧-2-0>甲萄-阿洛糖苷。本发明要解决的另一技术问题是提供所述诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物在制备诱导核受体TR3表达的诱导剂中的应用。所述的应用的更进一步特征在于所述诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物在制备预防和治疗癌症、肝炎、动脉粥样硬化药物中的应用。本发明将植物桑科见血封喉属植物见血封喉U""'a^tox/can'flLesch)的干燥茎粉碎成粗粉，将其浸入提取溶剂中冷提或在提取溶剂中加热回流，然后过滤或离心等方法除去不溶物，再对所得提取溶液进行减压浓縮，之后应用多种分离手段进行分离得到一系列具有上述通式的强心苷类化合物。用于提取的溶剂可采用通常用于植物提取的溶剂，例如，可以单独或组合使用甲醇、乙醇等低级醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂及水。提取方法可采用常规方法，一般提取温度为20-100。C，较好为40-8(TC，总提取时间为1-48小时，较好为4-16小时。提取液，通过过滤除去不溶物，减压浓縮。将提取物分散于等体积的水中，依次用系统溶剂萃取法如先用氯仿萃取，再用正丁醇萃取。取正丁醇萃取部分，真空减压干燥，得丁醇萃取物。随后，用正相、反相、凝胶色谱法分离精制得到上述化合物。采用以单体化合物或者选择其中任意两个或多个化合物以不同比例进行组合，使之与适宜的赋形剂相结合，按照常规方法制成的散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、酊剂、膏剂、喷雾剂等剂型，用于制备TR3的诱导剂及制备预防和治疗TR3相关疾病如癌症、肝炎、动脉粥样硬化药物。口服给药可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，至少需要一种赋形剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等。除这些赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁、月桂醇硫酸钠、滑石粉等作为润滑剂，糊精、结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶等作为粘合剂，马铃薯淀粉、羟己基纤维素作为崩解剂。此外，还可以制成糖浆剂、乳剂、混悬剂等。对于这些剂型，可加入矫味剂、矫臭剂等。外用剂型包括栓剂、软膏剂、外用散剂、喷雾剂、灌肠剂、乳剂等。这里所使用的固体或液体添加剂是在本
技术领域：
内经常使用的。对于软膏剂，选用由水、脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、石蜡、液体石蜡、树脂、高级醇、塑料、表面活性剂组成的疏水性基质或亲水性基质等在内的添加剂。制成注射剂时，一般是用注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇、聚乙二醇等。必要时，还可以加入适宜的等张剂、助溶剂、抗氧化剂、防腐剂等。本发明所提供的一系列的强心苷类化合物，作为核受体TR3(Nm77)表达的诱导剂，由于现代研究表明核受体TR3的表达与多种人类疾病相关，因此本发明提供的强心苷类化合物可以作为诱导剂应用于制备预防和治疗与核受体TR3相关的人类疾病(如癌症、肝炎、动脉粥样硬化等)的药物。图1是实施例1所得的强心苷类化合物在不同浓度下对TR3的mRNA表达的影响图。图2是实施例1所得的强心苷类化合物在不同时间下对TR3蛋白质表达的影响图。具体实施方式以下通过具体实施例和附图进一步说明本发明的方案及效果，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例l本发明的强心苷类化合物及其制备取桑科植物见血封喉"MaAtox/can'"Lesch)的干燥茎6Kg，粗粉碎后用8倍量60%乙醇加热回流提取三次，每次两小时，浓縮提取液得到乙醇提取物300g。将该提取物混悬于6升水中，分别用等体积乙酸乙酯和正丁醇萃取三次。正丁醇部位(35g)应用硅胶柱色谱(-5.0x60cm)分离，并采用氯仿-甲醇-水系统梯度洗脱，得到5个馏分A-E。其中，馏分B(2.9g)经过开放ODS柱色谱(-3.0x40cm)分离，用40%甲醇洗脱，得到两个子馏分B1和B2。馏分B2(930mg)通过制备型反相高效液相RP-18柱色谱分离，流动相为35%甲醇，得到化合物2、3、4和5。馏分C(3.7g)经过开放ODS柱色谱(03.0x40cm)分离得到两个子馏分C1-C2，分别通过制备型高效液相纯化，馏分Cl用33c/。甲醇洗脱，得到化合物1和6;馏分C2用35c/。甲醇洗脱，得到化合物7、8和9。所得化合物结构如下表1所示表1:从见血封喉中分离得到的具有TR3诱导作用的强心苷类化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>4CHOHOH6-deoxy-/S,D-gulopyranosylCHOHOH6-deoxy-/,D-allopyfanosyl6CH2OHHHa，L-RhamnopyranosylCH2OHHOH6-deoxy-/,D-allopyranosyl8CHOOHOH6-deoxy-AD-allopyranosyl9CHOOHOHy-D-javopyranosyl化合物1-9的结构解析化合物l:白色无定形粉末，[a]l5+37.0°(c0.2,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示可能是强心苷类化合物。高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z587.2817[M+Na]+(calculatedforQoH440,。Na，587.2832)，确定其分子式为C3QH44O10。'HNMR(400MHz,気代吡啶)和13CNMR(100MHz,氖代吡啶)图谱显示甲型强心苷类化合物特征吸收信号内酯羰基(c5c174.4)，一个双键6.21，^117.7，175.6)，一个连氧亚甲基(<5H5.27,5.01,&73.6)，以及糖端基信号4.80,4100.8)，提示该化合物为单糖苷。在310.41(1H,s,H-19)和l.OO(3H，s,H-18)显示的两组质子信号，说明该强心苷母核两个角甲基其中一个被醛基化。在HMBC图谱中，两个重水可交换的活泼质子信号35.49,4.94分别与(584.4(C-14)，73.6(C-5)相关，提示母核的14位和5位分别被羟基化。在ROESY图谱中，相关信号OH-5/H-19,H-19/H-8y5，H-8"/H-18andH-12a/H-15a提示苷元的骈合方式为c&-A/B，/rara-B/C以及c&-C/D。另外，H-3质子显示为宽单峰，提示H-3处于平伏键。由于内酯环的自由旋转可以观观倒H-18/H-21和H-18/H-22的ROESY相关信号也说明H-17处于《位。以上结构信息表明该强心苷的苷元为毒毛旋花子苷元。糖部分的端基质子信号H-l'(lH,d,J^8.0Hz)的偶合常数提示单糖为"构型。根据HMBC图谱'，相关信号H-3/C-l'和H-l'/C-3提示糖连接在苷元3位；糖的2'位质子信号[33.39(lH，dd，8.8，8.0)]与甲氧基碳信号(<560.8)相关，并且C-2'(385.0)的化学位移向低场位移，均说明C-2'发生甲醚化。结合糖上质子的'H」HCOSY相关信号与邻位偶合常数以及碳的化学位移值，提示单糖部分为6-去氧-2-0甲基-葡萄糖。因此，化合物1被鉴定为毒毛旋花子-3-6-/-(6-去氧-2-0-甲基)-9物。化合物2:白色针状结晶(氯仿/甲醇)，熔点215-216°C，[a]g-45.5°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示可能是强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰w/z533[M-H]-，提示该化合物的分子量为534，结合1D-NMR推测分子式为C29H4209。进一步的二级质谱给出碎片离子387[M-H-146r，表明其结构中可能含有一分子去氧六碳糖。l3CNMR(100MHz，気代吡啶)中该化合物苷元部分的碳信号与毒毛旋花子苷元的信号比较，发现化合物2苷元部分少了一个连氧季碳，而相应的多了-个次甲基碳信号(329.8)，提示化合物2的苷元部分是5位尚未发生羟基化的19-醛基-毛地黄苷元。单糖部分的核磁数据提示该单糖可能是鼠李糖，经过酸水解并衍生化后进行GC分析，与L-鼠李糖一致。该化合物被鉴定为19-醛基-毛地黄-3-C^，L-鼠李糖苷。化合物3:白色针晶(氯仿/甲醇)，熔点155-156。C，[a]『-3.7。(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰m/z563[M-H]、提示该化合物的分子量为564，结合1D-NMR推测分子式为C3QH4401Q。进一步的二级质谱给出碎片离子385[M-H-178]—，提示该结构中可能含有一分子六碳糖。化合物3的碳谱数据与化合物l比较，发现这两个化合物苷元部分的碳信号基本一致，仅所连接单糖信号有所不同。根据糖上邻位氢的偶合常数、'H」HCOSY相关信号，以及糖的2'位质子信号与甲氧基碳信号的HMBC相关信号，确定化合物3中的单糖为y5-6-去氧-2-0-甲基-阿洛糖基。化合物3为毒毛旋花子-3-0-/-(6-去氧-2-6>-甲基)-阿洛糖苷。化合物4:白色针晶(氯仿/甲醇)，熔点188-189°C，[a]^7.8°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰m/z549[M-H].，提示该化合物的分子量为550，结合1D-NMR推测分子式为C29H4201(>。进一步的二级质谱给出碎片离f403[M-H-146;r,提示结构中可能含有一分子去氧六碳糖。与化合物1和3比较碳谱数据，发现这三个化合物的苷元部分碳信号基本一致，均为毒毛旋花子苷元。区别仅在于连接的单糖信号有所不同。根据糖上邻位氢的偶合常数、10"H-"HCOSY和ROESY相关信号确定该单糖种类为6-去氧-古洛糖基。化合物4为毒毛旋花子-3-OW-D-6去氧-古洛糖苷。化合物5:白色针晶(氯仿/甲醇)，熔点178-179。C，[oTb63.6°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰m々5的[M-H]-，提示该化合物的分子量为550，结合lD-NMR推测分子式为C29H420io。进一步的二级质谱给出碎片离子403[M-H-146]—，提示结构中结构可能含有一分子去氧六碳糖，与化合物1、3、4的碳谱数据相比较，发现这四个化合物的苷元部分碳信号基本一致，均为毒毛旋花子苷元，区别在于连接的单糖信号有所不同。根据糖上邻位氢的偶合常数、'H-'HCOSY和ROESY相关信号确定该单糖种类为6-去氧-阿洛糖基。化合物5为毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷。化合物6:白色无定形粉末，[og-74.5。(c1.0，甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰wA535[M-H]—，提示该化合物的分子量为536,结合1D-NMR推测分子式为C29H4409。进一步二级质谱给出碎片离子389[M-H-146]—，提示结构中含有一分子去氧六碳糖。13CNMR(100MHz,気代吡啶)的碳信号与化合物2比较，发现单糖部分的碳信号基本相同，苷元部分碳信号的区别19位醛基信号消失，而在365.4显示一个亚甲基碳信号，提示该化合物的10位被羟甲基取代。化合物6为坎纳醇-3-0-cx-L-鼠李糖苷。化合物7:白色针晶(氯仿/甲醇)，熔点167-168。C，[aff-《5。(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰m/z551[M-H]'，提示该化合物的分子量为552。结合lD-NMR推测分子式为C29H440u)。进一步二级质谱给出碎片离子峰405[M-H-146]'，提示结构中含有一分子去氧六碳糖。13CNMR(100MHz,気代吡啶)的碳谱数据与化合物5比较，单糖部分的碳信号基本一致，苷元部分碳信号的区别仅在于19位醛基信号消失，而在c565.4显示一个亚甲基碳信号，提示该化合物的10位被羟甲基取代。化合物7为羊角拗醇-3-CS5-D-(6-去氧)-阿洛糖苷。化合物8:白色针晶(氯仿/甲醇)，熔点225-226。C，[a]2D64.7°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰m/z565[M-H]—，提示该化合物的分子量为566。进一步二级质谱给出碎片离子峰419[M-H-146]—，提示结构中含有一分子去氧六碳糖，结合lD-NMR推测分子式为C29H420n。与化合物7的碳谱数据相比较，区别主要在于化合物7在339.6(C-12)的信号消失，而在374.2显示一个连氧次甲基碳信号，提示该化合物的苷元12位发生了羟基化。化合物8为12-羟基-毒毛旋花子-3-C^-D-6-去氧-阿洛糖苷。化合物9:白色针晶(氯仿/甲醇)，熔点201-202。C，[ag5.4°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反应呈阳性，提示为强心苷类化合物。ESI-MS(negative)给出准分子离子峰w/z579[M-H]—，进一步二级质谱给出碎片离子峰401[M-H-178]'，提示该化合物的分子量为566，提示结构含有--分子去氧六碳糖，结合lD-NMR推测分子式为C29H420n。与化合物3的碳谱数据相比较，区别主要在于化合物3在c539.5(C-12)的信号消失，而在374.2显示一个连氧次甲基碳信号，提示该化合物的苷元12位发生了羟基化。化合物9为12-羟基-毒毛旋花子-3-0-"-(6-去氧-2-0-甲基)-阿洛糖苷。化合物1-9的核磁数据参见表2-4。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>.34(1H，m)1.45(1H'm)1.36(1H,m)1.38(IH,m)121.77(1H,m)1.48(1H,m)1.73(1H,m)1.77(IH.m)1.35(1H,m)1.38(1H，m)1.31(1H,m)1.38(1H'm)152.05(1H，m)1.78(1H，m)2.03(1H，2.08(IH,m)1.85(1H，m)1.62(1H,m)1.80(1H,1.83(IH，m)162.04(2H，m)1.85(2H'itO2.03(2H,m)2.02(2H.m)172.77(1H,m)2.81(旧，m)2.77(1H，m)2.78(1Rm)181.00(3H,s)1.12(3H,s)1.00(3H，s)1.00(3H，s)1910.41(1H,s)9.60(IH，s)10.41(1H，s)I0.40(1H,s)215.27(IH，d，17.6)5.30(1H，d,18.2)5.26(1H，dd，18.0，1.2)5.28(IH.dd.17.9.1.0)5.01(1H，dd，18.0,1.2)5.03(1H,d，18.1)5.00(1H'dd,18.1,1.4)5.02(IH,dd,18.1'1.2)226.21(1H,brs)6.14(IH，brs)6.11(1H,brs)6.13(IH,brs)r4.80(1H'd，7.6)5.40(1H，d，5.6)5.31(1H,d,8.0)5.41(IH.d,8.0)2,3.39(1H,dd,8.8,8.0)4.52(1H,m)3.33(IH，dd，8.8,2.8)4.48(IH,dd.8.0.3.3>3'4.01(1H，dd'8.0,8.4)4.52(1H,m)4.66(1H，m)4.74(IH.t.3.2)4,3.62(1H,m)4.27(lH'm)3.59(1H,m)4.14(IH,bi.d'3.2)5'3.66(1H,m)4.27(1H，m)4.25(1H,m)4.60(IH,m)6,1.57(3H,d，5.2)1.68(3H，d，6.8)1.57(3H，d,6.0)1.57(3H,d,6.0)2-O-methylEther3.82(3H,s)3.37(3H,s)表4化合物5-9的'HNMR(400MHz，氘代吡啶)数据No568989n2.67(1H,m)1.93(IH，m)2.21(IH,m)1.80(IH,m)4.46(IH,brs)2.30(IH，m),1.85(1H，m)2.32(IH,m)1.80(lH'm)2.45(IH,m)1.44(IH,m)2.29(lH'm)U5(IH,m)1.55(IH,m)1.43(1H，2.40(IH,m)1.97(1H，m)1.97(lH，m)1.53(1H，m)4.22(IH，brs)2.15(1H，m)1.87(1H，m)2.58(1H,m)1.75(IH,m)1.52(lH，m)1.94(1H，1.52(IH,m)2.16(IH,m)1.88(1H'1.88(1H，m)1.50(IH，m)2.30(IH,m)1.90(IH，m)2.19(1H,m)1.78(IH,m)4.46(IH，brs)2.24(IH,m)，1.80(IH,m)2.27(IH,m)1.75(1H,m)2.30(1H,m)1.45(IH,2.23(IH，1.37(1H,m)1.57(1H,m)1.40(1H,m)2.67(IH,m)2.10(1H，2.10(IH,m)1.85(IH，m)4.46(IH,brs)2.32(IH，m),1.85(1H'm)2.32(1H，m)2.10(lH，m2.35(IH，m1.40(IH,m2.35(1H，ni)1.85(IH,m)2.10(IH,m)1.85(IH,m)2.67(IH,m)2.10(IH.m)2.10(IH.m)1.85(IH.m)4.46(IH，brs)2.32(IH.m),1.85(IH.m)2.32(IH.m)2.10(IH.m)2.35(IH.m)1.40(IH.m)2.35(IH.m)1.85(IH.m)2.10(IH.m)1.85(iH.m)14121.75(1H，1.37(1H，m)m)1.50(1H,m)1.40(1H，m)1.72(1H，m)1.37(1H，m)3.66(1H,m)3.66(1H.m)152.08(1H,1.85(1H,m)m)1.88(1H，m)1.62(1H,m)2.10(1H，m)1.86(1H,m)1.85(2H'm)1.85(2H,m)162.00(2H，im)1.91(2H，m)2.11(2H,m)2.10(2H'm)2.10(2H，m)172.75(1H,:m)2.81(1H，m)2.80(1H,m)3.69(1H，m)3.69(1H.m)181.00(3H，s)0.98(3H，s)1.00(3H，s)1.22(3H，s)1.22(3H's)1910.38(1H，s)4.07(1H,d,10.8)3.74(1H,d，10.8)4.43(1H，d,11.2)3.96(1H.d,11.2)10.42(1H，s)10.42(1H，s)5.265.3021(1H,dd,18.0，1.2)5.33(1H,d，18.2)(1H,dd.18.0,1.2)5.23(1H,d,18.0)5.23(1H.d.18.0)5.005.03(IH,d'18.1)5.005.09(1H,d,18.0)5.09(1H,d,18.0)(1H,dd，18.0,1.4)(1H,dd'18.0,1.4)226.11(1H,brs)6.12(1H,brs)6.13(1H，brs)6.23(1H，brs)6.23(lH.brs)1'5.33(1H,d，8.0)5.29(1H,d,5.6)5.37(1H,d,8.0)5.34(1H，d,8.0)5.31(1H.d,8.0)2'3.90(1H,dd，8.0，2.8)4.55(1H'm)3.92(1H，dd,8.0,2.8)3.90(IH,dd,8.0,2.8)3.33(1H.dd.8.8.2.8)3'4.61(1H，t,2.8)4.55(1H,m)4.63(1H,t,2.8)4.62(1H'm)4.66(IH,m>4'3.66(1H，dd'9.2'2.8)4.30(1H'm)3.66(1H,dd,9.2,2.8)3.66(1H'dd,8.4,2.0)3.59(IH.m)5'4.23(1H,rn)4.30(1H,m)4.30(1H，m)4.30(1H'm)4.25(1H,m>6'1.58(3H,d，6.0)1.63(3H,d，6.8)1.58(3H，d'6.0)1.57(3H，d,6.0)1.57(3H，d.6.0):-(9-methylEther3.37(3H，s)实施例2实施例1所得的强心苷类化合物对TR3mRNA表达的影响我们采用RT-PCR进行分析。NIH-H460肺癌细胞接种于6孔板中(5xl05cells/we11)，贴壁培养过夜，并且饥饿12h后，加药培养。按总RNA提取试剂盒说明提取并纯化细胞系的总RNA。并按照逆转录试剂盒说明将细胞总RNA的mRNA转录成cDNA。PCR条件20|iL体系中cDNA4^L，10xPCRbuffer，25mmo1/LMgCl2，10mmo1/LdNTPs，每次加TR3引物10fimo1/L，ra《酶lU，反应在PCR仪中进行。94。C4min,94。C30sec，56。C30sec，72。C30sec，35个循环。PCR引物序列TR3上游5'-TCATGGACGGCTACACAG-3'，下游5'-GTAGGCATGGAATAGCTC-3';p-actin上游5'-CTGGAGAAGAGCTACGAG-3'，下坊,5'-TGATGGAGTTGAAGGTAG-3'。实验结果显示强心苷类化合物可以诱导TR3mRNA的表达，并且具有一定的量效关系。图1是实施例1所得的强心苷类化合物在不同浓度下对TR3的mRNA表达的影响图。其中，化合物2、1、4、6在lpM浓度下即可诱导TR3mRNA的表达，活性强度与阳性对照药TPA相当，提示上述强心苷类化合物为TR3的诱导剂。实施例3:本发明强心苷类化合物对TR3蛋白质表达的影响我们采用WesternBlotting方法进行蛋白质分析。RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。制备10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝胶。将蛋白样本转移至硝酸纤维膜上，电转条件为100mA通电2h。杂交按Westernblottingkit说明进行。将膜置暗盒中X光片曝光。实验结果显示强心苷类化合物可以诱导TR3蛋白的表达。图2是实施例1所得的强心苷类化合物在不同时间下对TR3蛋白质表达的影响图。分别测定化合物2、4、5在2,3,6,9小时下诱导TR3蛋白质的农达的情况，由图中可见，上述强心苷化合物在6小时内即可诱导TR3蛋白质的表达，进一步提示它们为TR3的诱导剂。实施例4:本发明强心苷类化合物的体外抑瘤实验我们采用MTT法测试化合物对肿瘤细胞的抑制作用。选融合度在80%，对数期生长的细胞，用胰酶消化，转移，离心，去上清液，用新配制的含10%FBS(灭活的小牛胎血清)的DMEM培养液混悬。各种细胞以1.0><104万/孔接种于96孔培养板均同时依次加入5个不同稀释度的待筛样品药液,每个稀释度重复3个孔，同时平行做相同浓度的溶剂对照，及不加药的阴性对照，37。C培养72小时，MTT染色，DMSO脱色，测定OD57Q，计算肿瘤生长抑制率IR(%)=(空白OD平均值-给药组OD平均值)/空白OD平均值xl00。实验结果参见表4.结果显示，实施例1中的9个强心苷类化合物对人体的7种肿瘤细胞非小肺癌细胞H-460，A549与Calu-6;前列腺癌细胞LNCaP;乳腺癌细胞MCF-7;结肠癌细胞SW-480;宫颈癌细胞Hela的增殖具有不同程度的抑制作用。表5:实施例1的强心苷类化合物的体外抑瘤实验数据化合物IC50±SD(nM)H460LNCaPMCF-7SW-480HelaA549Calu-6强心苷总提物10.6pg/ml9.7兆/ml7.8貼/ml8.5jig/ml6.7pg/ml9.3Mg/ml4.5(ig/ml130.3土4.4115.5=23.348.5土0.9103.0土1.499.7士9.867.1士45.8619.0±195.052.4±3.628.2土1.961.6±8.537.0±4.724.8士13.5345.5士10.6321.5土2.989.0±2.934.1土0.476.3±2.367.9士15.048.3士8.3331.0±81.3415.0土1.847.6±5,223.4土3.364.0±0.644.9土1.925.8士8.0207.0土90.419.6二4.769.7±29.341.0土1.877.6±76.159.1±8.032.2±15.9221.3±13.6610.8±5.442.8±17.337.0土2.265.8土46.527,7±10.17-6±5.863,3±47,775.8±0.421.9士2.015.2±1.543.6±34.711.5丄6.78.3士3.967.5±9.68215.0±60.8688.5±275437.0±140990.5±41.7493.0±95.1450.7丄24.42893丄536981.6±16.1478.5土235.5123.0±7.1239.5±70259.7±75.6238.0丄31.1>5()(1实施例5:毒毛旋花子-3吞/-(6-去氧-2-0-甲萄-葡萄糖苷片剂的制备取强心苷毒毛旋花子-3-0-^(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷1g与微晶纤维素27g及硬脂酸镁2g混合，混合物用单冲压片机打成直径6mm，重量300mg的片。本片剂中每片含强心苷10mg。实施例6:毒毛旋花子-3-0{(6-去氧-2-0-甲萄-葡萄糖苷颗粒剂的制备取毒毛旋花子-3-0-A(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷1g与玉米淀粉29g混合，加水制成软材，过12目筛进行造粒，干燥后得到颗粒剂。本颗粒剂中，每300mg中含强心苷10mg。实施例7:毒毛旋花子-3-0+(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷胶囊剂的制备取强心苷毒毛旋花子-3-C^-(6-去氧-2-0甲萄-葡萄糖苷1g与乳糖"g、硬脂酸镁2g混合，以每300mg填充肠溶胶囊。本肠溶胶囊剂屮，每个胶囊含强心苷10mg。实施例8:坎纳醇-3-0-a-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-0-Z-D-6去氧-古洛糖苷混合物胶囊剂的制备取坎纳醇-3力-(x-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-C^-D-6去氧-古洛糖苷各1g与乳糖36g、硬脂酸镁3g混合，以每500mg填充胶囊。本胶囊剂中，每隔胶囊含强心苷25mg。实施例9:坎纳醇-3力-a-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-6>-/-D-6去氧-古洛糖苷混合物糖浆剂的制备17取坎纳醇-3-0-a-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-C^-D-6去氧-古洛糖苷各1g加水300ml溶解，加入橙皮苷4ml，加单糖降至1000ml得糖浆剂。本糖浆剂lml中含强心苷2mg。实施例10:实施例5、6、8和9的样品诱导荷瘤大鼠C6脑胶质瘤凋亡的作用大鼠肿瘤接种后次日将动物随机分组，分为治疗组51(实施例5低剂量组)、治疗组52(实施例5高剂量组)、分为治疗组61(实施例6低剂量组)、治疗组62(实施例6高剂量组)、分为治疗组81(实施例8低剂量组)、治疗组82(实施例8高剂量组)分为治疗组91(实施例9低剂量组)、治疗组92(实施例9高剂量组)和对照组(给药生理盐水)。采用量瘤径的评价方法动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周2-3次，每次测量同时还需称鼠重。肿瘤体积的计算公式为V4/2xaxp其中a、b、c分别表示长宽高。按公式求得抑瘤率抑瘤率％=[(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)]/对照组肿瘤体积]xl00%。实验结果显示治疗组与生理盐水对照组相比，肿瘤体积明显减小，治疗组的抑瘤率分别为73.5%、86.1%、77.2%、89.2%、61.1%、70.0%、60.1%和70.9%。(见表6)。表6各组移植瘤的体积测定结果组别动物数(只)成瘤数(个)移植瘤平均体积(mm3)抑瘤申.对照组1010112.3±65.2-治疗组51101029.8±12.3**73.5%治疗组52101015.6±2.7**86.1%治疗组61101025.6±14.1**77.2%治疗组62101012.1±0.5**89.2%治疗组81101043.7±9.0**61.1%治疗组82101033.7±5.7**70.0%治疗组91101044.8±12.2**60.1%治疗组92101032.7±10.9**70.9%18SEQUENCELISTING<no>暨南大学<120>诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物及其应用<130>101164<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>为检测TR3mRNA的表达而设计的TR3上游引物<400>1tcatggacggctacacag18<210>2<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>为检测TR3mRNA的表达而设计的TR3的下游引物<400>2gtaggcatggaatagcte18<210>3<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>e-actin上游引物<400>3ctggagaagagctacgag18<210>4<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>e-actin下游引物<400>4tgatggagttgaaggtag18权利要求1、诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，具有以下通式其中R1为CH3、CHO或CH2OH；R2为H或OH；R3为H或OH；R4为糖类所组成的直链糖链或支链糖链。2、根据权利要求1所述的诱导核受体TR3表达的强心^类化^物，丄U力征在于所述R,为CHO。3、根据权利要求1所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，其特征在于所述R2为H。4、根据权利要求1所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，其特征在于所述R3为OH。5、根据权利要求1所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，其特征在于所述糖类包括单糖、双糖、三糖、四糖、五糖、六糖中的一种或一种以上的组合。6、根据权利要求5所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，其特征在于所述糖类包括葡萄糖(卩-D-glucose)、葡萄糖((x-D-glucose)、鼠李糖(a扁L-rhamnose)、半乳糖(卩-D-galactose)、半乳糖(a-D-galactose)、甘露糖(a-L-mannose)、阿拉伯糖(卩-D-arabinose)、阿拉伯糖(a-D-arabinose)、木糖((3-D-xylose)、木糖(a-D-xylose)、核糖(卩-D-ribose)、核糖(a-D-ribose)、来苏糖(卩-D-lyxose)、来苏糖(a-D-lyxose)、夫糖(a-D-fucose)中的一种或者一种以上的组合。7、根据权利要求5所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，其特征在于所述糖类包括6-去氧糖、2,6-二去氧糖、2-甲醚-6-去氧糖，3-甲醚-6-去氧糖、4-甲醚-6-去氧糖中的一种或者一种以上的组合。8、根据权利要求1所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，其特征在于R^为CHO，R2为H，R3为OH，R4为,(6-去氧-2-O-甲基)-葡萄糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-0-^(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷；或者R,为CHO，R2为H，R3为H，R4为a，L-鼠李糖基的化"物，化':〔'名为19-醛基-毛地黄-3-0-a，L-鼠李糖苷；或者Ri为CHO，R2为H，R3为OH，R4为"-6-去氧-2-0-甲基-阿洛糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-0-"-(6-去氧-2-0-甲萄-阿洛糖苷；或者R,为CHO，112为H，&为OH，R4为AD-6-去氧-古洛糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-古洛糖苷；或者为CHO，R2为H，R3为OH，R4为^，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化学名为毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者R,为CH20H，R2为H，R3为H，R4为a,L-鼠李糖基的化合物，化学名为坎纳醇-3-0会L-鼠李糖苷；或者R,为CH20H，R2为H，R3为OH，R4为A，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化学名为羊角拗醇-3-0-^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者R4为CHO，R2为OH，R3为OH，R4为P，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化学名为12-羟基-毒毛旋花子-3-C^-D-6-去氧-阿洛糖苷；或者R,为CHO，R2为H，R3为OH，R4为"-6-去氧-2-0-甲基-阿洛糖基的化合物，化学名为12-羟基-毒毛旋花子-3-0-^(6-去氧-2-0-甲基)-阿洛糖苷。9、权利要求1至8任意一项所述的诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物在制备诱导核受体TR3表达的诱导剂中的应用。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述诱导核受体TR3农达的强心苷类化合物在制备预防和治疗癌症、肝炎、动脉粥样硬化药物屮的应用。全文摘要本发明涉及诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，具有以下通式其中R<sub>1</sub>为CH<sub>3</sub>、CHO或CH<sub>2</sub>OH；R<sub>2</sub>为H或OH；R<sub>3</sub>为H或OH；R<sub>4</sub>为糖类所组成的直链糖链或支链糖链。本发明所述的强心苷类化合物，能够诱导核受体TR3表达，从而可以作为诱导剂应用于制备预防和治疗癌症、肝炎、动脉粥样硬化等药物。文档编号A61P9/00GK101323634SQ20081002777公开日2008年12月17日申请日期2008年4月29日优先权日2008年4月29日发明者何加友,姚新生,姜苗苗,雪张,张晓坤,毅戴,曾锦章,王光辉申请人:暨南大学