专利名称：：抗家畜口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属遗传工程
技术领域：
，具体涉及一种抗家畜口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法。技术背景国际兽疫局将口蹄疫(Foot-and-mouthdisease)列为A类传染病之首。家畜口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。预防接种是控制该病毒的主要手段。在各种预防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果稳定等优点具有广阔的应用前景。与口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)免疫原性密切相关的是其外壳蛋白VP1基因，该蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位。目前较为成熟的口蹄疫病毒基因工程疫苗，即将口蹄疫病毒主要抗原表位与一个大分子载体蛋白相连，构成一个融合蛋白，进而有效地诱导动物产生免疫应答。但是现有的基因工程疫苗仍然存在一些问题需要解决，如需要二次免疫问题。
发明内容本发明的目的是在基因水平上改进原有疫苗，提出一种高效、安全可靠的口蹄疫病毒多肽疫苗及其制备方法。本发明提出的口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，是以截短的e-半乳糖苷酶作为抗原载体蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽连接在该载体蛋白的c末端而构成的融合蛋白；其中，口蹄疫病毒的抗原多肽由Thelper刺激因子序列(简称Th序列)和2个抗口蹄疫病的作用单位中的一个重复串联组成，每个作用单位由口蹄疫病毒VP1蛋白中多个具有抗原性的氨基酸肽段串联组成，在各个氨基酸肽段连接处有氨基酸多肽作为接头。为了保证抗原表位能够更好地诱导动物机体的免疫应答，必须加入一定的载体蛋白组成融合蛋白，e-半乳糖苷酶全长基因一直被认为是较好的选择。但是载体基因太大，无形中降低了抗原表位基因在融合基因中的比例，相应地也降低了目的蛋白在融合蛋白中的含量，势必对免疫原性造成一定影响。本发明中，将pWR590中e-半乳糖苷酶的590个氨基酸，截短310个氨基酸后，作为新载体pWR280，记为SEQ.ID.NO.l，抗原多肽连接在该载体的C-末端。实验表明，以pWR280作为载体蛋白而构建的抗口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，比以pWR590为载体蛋白构建的多肽疫苗，具有更好的免疫效果。本发明中，口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段是指VP1蛋白中2140、141160、200213位氨基酸肽段(分别表示为:VP1(21-40)、VP1(141-160)、VP1(200-213))，并且可以前后浮动适当个数的氨基酸残基，如采用3551、134158、141158、135144、188209位氨基酸肽段(分别记为:VP1(35-51)、VP1(134-158)、VP1(141-158)、VP1(135-144)、VP1(188-160));口蹄疫病毒抗原表位中的氨基酸序列部分具有保守性，如141160中RGD位点，而非保守部分以流行株序列为依据；通常2140AA可替代1-2个氨基酸；141160AA可替代1-5个氨基酸；200"213AA可替代l-3个氨基酸，其原则是这些氨基酸肽段均具有抗原性。将VP1(21-40)或者其中浮动适当个数氨基酸残基的肽段，记为X;将VP1(141-160)或者其中浮动数适当个数的氨基酸残基的肽段，记为Y;将VP1(200-213)或者其中浮动数适当个数的氨基酸残基的肽段，记为Z。每个作用单位可以由X、Y、Z所代表的肽段中任何两个肽段经重复串联组成，例如X-Y-X，X-X-Y，Y-X-Y，Y-Y-X，Y-Z-Y，Y-Y-Z，Z-Z-Y,Z-Y-Z，X-Z-X，Z-X-Z，Z-Z-X或X-X-Z等，肽段连接处有一些氨基酸多肽作为接头。如在具体实施例中，上述序列组成141160AA—2140AA_141160AA的串联结构作为一个作用单位。并在141160AA—2140AA—141160AA的抗原多肽结构中，肽段连接处加入一些氨基酸多肽作为接头，如后述实施例中采用前后两个接头分别是2个和11个氨基酸，其中前一接头的2个氨基酸为Pro-Gly,后一接头的11个氨基酸为Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg。本发明中，所述的抗原多肽的结构为P-T-P，这里P为一个作用单位，T为Th序列，Th序列与作用单位P之间也加有氨基酸多肽接头。在实施例中，在Th序列的两侧加入的接头，分别是D(Leu-Lys)和E(Lys-Leu)两个二肽接头。为了进一步提高目的蛋白在融合蛋白中的比率，增强疫苗的免疫原性，本发明将上述2个作用单位重复，同时中间又增加了Thelper刺激因子序列。实施例中将口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的C端，构成融合蛋白，其结构示意图如l所示；其中FMDV抗原多肽的结构示意图如图2所示；在在具体实施例中0型FMDV抗原多肽的结构如图3所示。本发明中，实施例中所采用载体蛋白的序列为SEQIDNOl.，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQIDN0.2。所采用的串联结构的FMDV抗原基因序列为SEQIDN0.3,其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQIDN0.4。T辅助细胞刺激因子的基因序列为SEQIDN0.5，其编码的抗原多肽序列为SEQIDN0.6。本发明中，一个作用单位中，优选抗原基因的两端各有一个拷贝的编码141160或138160位氨基酸的DNA序歹lj，中间是一个拷贝的编码2140位氨基酸的DNA序歹U;连接这些序列的两个接头分别是2个和11个氨基酸。在2个作用单位之间是t辅助细胞刺激因子，它的两侧分别是2个氨基酸的接头。在基因水平上将2个作用单位和t辅助细胞刺激因子组成的融合基因连接在截短的e-半乳糖苷酶的C端，表达获得融合蛋白。该融合蛋白具有下列特点(1)在基因水平上，载体蛋白基因大小为852bp，抗原基因大小为480bp，整个融合基因大小约为1.33Kb。(2)在蛋白水平上，载体蛋白包含了P-半乳糖苷酶从第1个氨基酸开始约284位氨基酸肽段，抗原蛋白为上述的重复的串联单位，整个融合蛋白分子量约为50Kda。本发明还提出了上述抗家畜口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组和融合蛋白的表达等，其步骤如下化学合成法合成编码口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段的DNA序列和t辅助细胞刺激因子的基因序列，在dna水平上连接成完整的抗原基因。将现有的pWR590载体中LacZ蛋白缺失310个氨基酸，构成新载体pWR280，用以表达融合蛋白。将(1)中完整的抗原基因插入表达质粒载体，并转入大肠杆菌菌株。将菌株置于细菌培养基中，培养温度在3(tc到37'c之间，培养时间8至10小时。然后收集菌体；将收集的菌体破碎，离心收集表达的融合蛋白；将融合蛋白处理乳化，配置成本发明有关的多肽疫苗。本发明提出的新型疫苗用于免疫易感动物，预防口蹄疫的发生。考虑到使疫苗发挥最大的免疫效应以及保持最长的效应持续期，我们提出以某一型口蹄疫病毒基因序列为依据构建的疫苗最适合用于预防该型口蹄疫。即以0型FMDV基因序列为依据构建的疫苗最适合用于预防0型FMDV;以A型FMDV基因序列为依据构建的疫苗最适合用于预防A型FMDV;以Asial型FMDV基因序列为依据构建的疫苗最适合用于预防Asial型FMDV;该新型疫苗的又一特征是具有交叉保护作用。即以某一型内某一毒株的口蹄疫病毒基因序列为依据构建的疫苗广泛适用于在各种易感动物中预防同型口蹄疫病毒不同毒株的感染。本发明提出的疫苗在制备过程中，采用了化学合成，基因克隆与序列测定、序列分析、基因重组等基因工程技术与方法。并用SDS—PAGE蛋白检测方法，Westernblotting及猪抗病毒能力检测等免疫学方法检测了该疫苗的功效。实施例中，以pWR280为载体蛋白构建抗O型口蹄疫病毒多肽疫苗。其结果如下SDS—PAGE电泳检测证明表达获得的融合蛋白分子量与预期一致(见图1)。图中条带"l"是重组质粒转化JM101的蛋白表达条带；可见表达出一分子量为50KD的蛋白质条带"1"是重组质粒转化JM101的蛋白表达条带；可见表达出一分子量为50KD的蛋白质条带；条带"2"是空白质粒pWR280转化JM101的蛋白表达条带；条带"3"是JM101的蛋白表达条带；条带"4"是蛋白质分子量marker。Westernblotting检测证明该融合蛋白具有很强的抗原性，能与0型口蹄疫病毒标准抗体发生特异的抗原抗体反应。图中条带"1"1是图1中条带"1"电转移到硝酸纤维膜分别与0型口蹄疫病毒标准抗体发生抗原抗体特异的免疫反应条带。条带"2"和"3"与图1中条带"2""3"对应，之间无特异性的抗原抗体反应。结果见图2。用该疫苗免疫猪，取免疫猪血清，用细胞中和方法测定特异性抗体的滴度，结果见表1。用该疫苗免疫猪，一定时间后以O型口蹄疫病毒进行攻击。结果证明该疫苗对猪具有较好的保护效果，保护率为100%，保护效果见表l。图1为抗口蹄疫病毒疫苗结构示意图。图2为FMDV抗原多肽的结构示意图。其中，(a)"X"、"Y"、"Z"肽段来源于同一型口蹄疫病毒VP1序列，"X"、"Y"、"Z"肽段分别代表口蹄疫病毒O型VP1蛋白的2140、141160、200213三个氨基酸肽段，或者口蹄疫A、亚洲一型病毒表面的相应氨基酸肽段。(b)"M"是"Pro-Gly"二肽接头，"N"是"Gln-Phe-GIu-Leu-Glu-Phe-Met陽Val-Pro-Ser-Arg"i"—肽接头，"D"是"Leu-Lys"二肽接头，"E"是"Lys-Leu"二肽接头。图3为实施例中O型FMDV抗原多肽的结构示意图。图4为多肽疫苗的蛋白表达图。图中条带"1"是重组质粒转化JM101的蛋白表达条带；可见表达出一分子量为50KD的蛋白质条带；条带"2"是空白质粒pWR280转化JM101的蛋白表达条带；条带"3"是JM101的蛋白表达条带；条带"4"是蛋白质分子量marker。图5为多肽疫苗的融合蛋白的性能检测。图中条带"l"l是图l中条带"l"电转移到硝酸纤维膜分别与O型口蹄疫病毒标准抗体发生抗原抗体特异的免疫反应条带。条带"2"和"3"与图1中条带"2""3"对应，之间无特异性的抗原抗体反应。可见该融合蛋白能与O型口蹄疫病毒发生特异的免疫反应。具体实施例方式下面以抗O型口蹄疫病毒多肽疫苗为例进一步具体描述本发明。化学合成VP1基因中编码2140、141"160位氨基酸片段的DNA序列，串联成为141"160AA—2140AA_141160AA的一级结构(SEQ.ID.N0.3)。合成T辅助细胞刺一级结构串联成完整的抗原基因，见图2(a)所示。也可以制成如图2(b)所示的抗原基因。将pWR590载体中LacZ基因在基因水平上缺失930个碱基，构成新载体pWR280,用以表达融合蛋白。将完整的抗原基因插入载体pWR280将质粒载体pWR280以限制性内切酶酶切，将完整的抗原基因与载体基因混合，在T4Ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA，转化大肠杆菌JM101菌株的感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37t:倒置过夜。随意挑取转化子，分别以酶切鉴定，DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计相符。将此克隆命名为pWR280-O-AU。将pWR280-O-AU以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37'C下通气培养8_10小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟。超声后5000rpm离心20分钟收集包涵体。并配成油乳剂，即可获得一种新型的抗家畜口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗。该疫苗所涉及的融合蛋白SDS—PAGE电泳检测结果表明融合蛋白在大肠杆菌JM101中得到高效表达结果(附图3)，Westernblotting检测结果表明该融合蛋白具有很强的抗原性，能与0型口蹄疫病毒标准抗体发生特异的抗原抗体反应(附图2)。该疫苗免疫猪后检测FMDV特异性抗体的滴度，结果表明该融合蛋白诱导猪产生高滴度的抗O型口蹄疫病毒的特异性抗体，见表l。抗0型口蹄疫病毒能力检测结果见表2，保护率为100%。表1免疫后猪后FMDV特异性抗体的滴度和融合蛋白对猪的免疫保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明涉及的基因序列及其编码的氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>SEQIDNO.4:N端一VPSRVSNKRGDLQVLAQKAERALP一C端SE(JIDNO.5:SEQIDNO.6:N端-ISISEIKGVIV服IETILF-C端权利要求1、一种抗口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，其特征在于以截短的β-半乳糖苷酶作为抗原载体蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的C末端，构成融合蛋白，其中，所述的抗原多肽是由Th刺激因子序列和抗口蹄疫病的2个作用单位中的一个重复串联组成，每个作用单位由口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段串联组成，各个氨基酸的肽段连接处有氨基酸多肽作为接头；所述的截短的β-半乳糖苷酶是指β-半乳糖苷酶从第1位氨基酸开始的280个氨基酸肽段，其序列为SEQ.ID.NO.1，记为pWR280，或者是β-半乳糖苷酶从第1位氨基酸开始的约280个氨基酸肽段的同源序列。2、根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段是指VP1蛋白中2140、141160、200213位氨基酸肽段，分别表示为VP1(21-40)、VP1(141-160)、VP1(200-213)，并且可以前后浮动适当个数的氨基酸残基。3、根据权利要求2所述的多肽疫苗，其特征在于将VP1(21-40)或者其中浮动适当个数氨基酸残基的肽段，记为X;将VP1(141-160)或者其中浮动适当个数的氨基酸残基的肽段，记为Y;将VP1(200-213)或者其中浮动数适当个数的氨基酸残基的肽段，记为Z，则所述每个作用单位的串联结构形为X-Y-X，X-X-Y，Y-X-Y，Y-Y-X，Y-Z-Y，Y-Y-Z，Z-Z-Y，Z-Y-Z，X-Z-X，Z-X-Z，Z-Z-X或X-X-Z。4、根据权利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于所述抗原多肽采用如下串联结构形式Y-M-X-N-Y—D—T一E—Y-M-X-N-Y，或者Y-M-Z-N-Y—D—T一E—Y-M-Z-N-Y，其中，"M"是"Pro-Gly"二肽接头，"N"是"Gln陽Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val陽Pro-Ser-Arg"~|^—肽接头，"D"是"Leu-Lys"二肽接头，"E"是"Lys-Leu"二肽接头。5、根据权利要求3或4所述的多肽疫苗，其特征在于所述的"X"、"Y"、"Z"肽段中的氨基酸作如下调整"X"中替代l-2个氨基酸，"Y"中替代l-5个氨基酸，"Z"中替代1-3个氨基酸。6、一种权利要求l-5之一所述的口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组及融合蛋白的表达，其特征在于具体步骤如下(1)化学合成法合成编码口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段的DNA序列和T辅助细胞剌激因子的基因序列，在DNA水平上连接成完整的抗原基因；(2)将现有的pWR590载体中LacZ蛋白截短310个氨基酸，构成新载体pWR280，用以表达融合蛋白；(3)将步骤(1)得到的中完整的抗原基因插入表达质粒载体pWR280，并转入大肠杆菌菌株；(4)将菌株置于细菌培养基中，培养温度在3(TC到37'C之间，培养时间8至10小时，然后收集菌体；(5)将收集的菌体破碎，离心收集表达的融合蛋白；(6)将融合蛋白处理乳化，配置成本发明有关的多肽疫苗。全文摘要本发明属于遗传工程
技术领域：
，具体为一种抗家畜口蹄疫病毒工程多肽疫苗及其制备方法。本发明的多肽疫苗以截短的β-半乳糖苷酶pWR280作为抗原载体蛋白，以化学合成法合成编码口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段的DNA序列和T辅助细胞刺激因子的基因序列，在DNA水平上连接成完整的抗原基因。将该抗原基因插入载体pWR280。新构建的基因工程菌经发酵，超声破菌获得的包涵体制备成疫苗。该疫苗安全性好，效果显著，对家畜有理想的保护效果。文档编号A61K39/125GK101314036SQ20081003656公开日2008年12月3日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者严维耀,刘明秋,晔焦,郑兆鑫申请人:复旦大学