透明质酸在制备用于改善皮肤、眼和粘膜的保护功能的组合物中的用途的制作方法

专利名称：：透明质酸在制备用于改善皮肤、眼和粘膜的保护功能的组合物中的用途的制作方法透明质酸在制备用于改善皮肤、眼和粘膜的保护功能的组合物中的用途本发明涉及透明质酸在制备用于改善皮肤、眼和粘膜，特别是上和下呼吸道以及肠粘膜的保护功能的组合物中的用途。呼吸道粘膜和肠粘膜、皮肤和眼覆盖有表面上皮，所述表面上皮形成连续的覆盖物，并且构成物理保护屏障，其效能依赖于攻击因子和该上皮所拥有的众多防御机制之间的平衡。在这些机制中，表面上皮在诸如下列的防御机制中起着关键作用炎症反应、免疫应答、电解质的跨上皮运输和具有抗感染活性的分子的分泌。这些功能中的大多数要求维持细胞的相互作用和极性。上皮的任何改变可以导致这些防御机制的机能障碍。因此，在急性或慢性支气管炎症现象的过程中，与众多传染物(细菌、病毒等)或非传染物(颗粒、大气或职业污染)的吸入相关的粘膜纤毛转运效能的改变，可以引起上皮屏障的完整性的改变，并且导致呼吸上皮的在程度上或多或少的损伤。这些损伤可以从上皮屏障的连接性的丧失到完全的上皮脱屑之间变化。在损伤后呼吸上皮的表面的上皮再形成起初依赖于受损区域周围细胞的扩展和迁移(Zahm等人，AmJRespirCellMolBiol1991,5242~248；H6rard等人，AmJRespirCellMolBiol1996，15:624_632)。这种上皮再形成应当伴随上皮屏障的防御功能的恢Μ.ο上皮细胞的连接复合物也在维持上皮的完整性中起着主要作用。上皮的屏障功能通过三种主要类型的连接复合物来确保1)紧密连接和中间连接，其形成细胞间锚定带，2)桥粒，其位于基细胞和表面圆柱状细胞之间的界面处，和3)通讯连接，其为细胞内信号的转导途径。紧密连接形成了调节离子和分子经细胞旁间隙进行通过的选择性屏障。在电子显微镜术下，注意到紧密连接在两个相邻细胞的质膜的外层之间形成一系列融合点。通过冷冻断裂，这些膜接触区看起来为围绕每个细胞的顶端的连续网状物的形式。这个网状物由膜蛋白质(密蛋白和闭合蛋白)的聚合物构成，这些蛋白质本身与细胞质蛋白质相连接，在所述细胞质蛋白质中尤其发现有紧密连接蛋白质(Z0-1至3)。闭合蛋白、密蛋白以及ZO-I通常是细菌毒素的靶标，这导致紧密连接的组构和功能的改变(Coraux等人，AmJRespirCellMolBiol2004，5:605_612)。在连接复合物中，通讯连接牵涉分子从一个细胞传递至另一个细胞。它们由连接蛋白的等级化装配构成，所述连接蛋白聚集成六聚体单元即连接子。每个连接子与邻近细胞的连接子相联合，从而形成2至4nm的通道，其允许小尺寸的分子通过。除了确保上皮的保护作用的这些连接复合物外，为了防止通过吸入的微生物而发生的建群和感染，呼吸上皮由于具有杀菌活性的肽和分子的产生而保持无菌环境。在由呼吸上皮细胞所分泌的这些抗菌剂中，已显示，白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)能够引起革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的死亡。尽管紧密连接的防御功能的改变最初是感染过程的后果，但还承认伴随感染的显著炎症可以是上皮屏障的渗透性发生变化的起因。细胞因子代表了在免疫和炎症过程期间由非常大量的经激活的细胞所释放的低分子量的可溶性多肽分子家族。在这些细胞因子中，白介素8(IL-8)在炎性疾病和传染病中是增加的。IL-8对于嗜中性粒细胞的化学吸引能力构成了适合于大多数病理学情况的防御机制，但是由嗜中性粒细胞所放大的应答可以加剧呼吸上皮的防御功能的改变(Tirouvanziam等人，AmJRespirCellMolBiol,2000，2:121_127)。因此，在上皮受到攻击之后这些防御功能的恢复是在维持上皮的屏障功能中的重要步骤，并且因此阐明出能够促进这种恢复的分子代表了重大的利害关系。目前，对于上皮受到的攻击所进行的治疗尤其在于症状治疗支气管扩张药、抗炎药、抗生素、粘膜调节剂。法国专利FR2847818描述了透明质酸、其制备方法以及其在尤其关于上呼吸道的呼吸疾患具有治疗活性的组合物中的应用。该专利中所描述的透明质酸具有至多IO5Da的分子量。该透明质酸尤其在治疗上呼吸道的呼吸疾患(修复呼吸上皮)的情况下使用。专利US6，806，259描述了分子量为50，000至200，000道尔顿的的透明质酸的制齐U。这种制剂作为用于使人类皮肤柔滑的营养补充剂通过口服途径进行施用。申请US2006/166930涉及包含乙酰化透明质酸的药物组合物，其用于治疗眼干燥。乙酰化透明质酸的分子量优选地是10，000至1，000,000道尔顿。专利US5，166,331描述了两种透明质酸级分，一种具有50，000至100,000的分子量(hyalastine)并且用于瘢痕形成，和另一种具有500，000至730，000的分子量(hyalectin)并且用于眼内和关节内注射。申请DE10360425涉及分子量为50，000至10，000,000道尔顿的透明质酸、透明质酸的盐和/或其衍生物在制备用于治疗眼和/或鼻并发症的药物组合物中的用途。使用透明质酸的这些文献无一描述了在上皮受到攻击后连接复合物的防御功能的恢复，并且迄今为止，仅细胞因子例如TGF-β或糖皮质激素被描述为能够增加细胞间粘附分子的表达。本发明的目的之一是具有30，000至45，000道尔顿的低分子量的透明质酸用于刺激这样的机制的用途，所述机制牵涉防御功能的恢复，并且具有在源于物理、化学或微生物学因子的攻击的情况下保护呼吸粘膜、肠粘膜、皮肤或眼和/或改善呼吸粘膜、肠粘膜、皮肤或眼的保护功能的活性。本发明的另一个目的是提供包含透明质酸的药物组合物，其用于制备用于预防病理学状态例如哮喘、呼吸性变态反应、呼吸窘迫综合征的药物。本发明的另一个目的是提供包含透明质酸的美容组合物，其用于在皮肤的功能和结构性紊乱的情况下改善皮肤的保护功能，或者在眼病症的情况下改善眼的保护功能。本发明的另一个目的是提供包含透明质酸的食品组合物，其用于在消化性病症的情况下改善肠粘膜的保护功能。因此，本发明涉及至少一种分子量为30，000至45，000道尔顿，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐在制备组合物中的用途，所述组合物用于在发生攻击的情况下保护和/或恢复上和下呼吸道粘膜、肠粘膜、皮肤或眼的完整性，所述攻击源于物理、化学或微生物学因子，并且在所述攻击中牵涉上皮细胞，特别是上皮细胞的连接复合物。当低于30，000道尔顿时，透明质酸变得是炎症性的(US5，166，331)，而当超过45，000道尔顿时，透明质酸丧失其活性。表述“相应的盐”是指钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、钡盐、锶盐、镁盐、铝盐、铵盐或取代的铵盐。表述“呼吸粘膜”是指上和下呼吸道的上皮，其是假复层的，并且由纤毛细胞、杯状细胞、基细胞、刷细胞和神经内分泌细胞以及绒毛膜构成，所述绒毛膜是非常血管化的并且包含众多弹性纤维。表述“上呼吸道”包括鼻腔、咽和喉，和表述“下呼吸道”包括气管、支气管和细支气管。表述“肠粘膜”是指消化道的内部部分，并且包括-从胃开始由在其顶表面边缘水平上经由紧密连接而彼此相连的细胞单层形成的上皮；在该上皮层中包括有将粘液分泌到腔内的外分泌细胞以及将激素释放到血液中的内分泌细胞，_固有层，这是松弛的结缔组织层，其非常富含毛细血管和淋巴毛细管、针对能够穿过上皮的微生物的防御系统的白细胞和其他细胞，-粘膜肌层，这是可以通过收缩来修饰上皮的褶皱的平滑肌细胞的薄层。表述“物理因子”一般是指能够引起损伤或疾病的能量来源。这些尤其是噪声、振动、辐射(电离性的，例如X和Y射线，或者光学的，例如紫外辐射、激光辐射和红外线灯)、波(例如，微波或射频波)以及极端温度和压力。表述“化学因子”是指化学产品(非危险性的、危险性的、非CMR(致癌性、诱变性、生殖毒性(canc6rog6nemutagenesreprotoxiques))危险性的、CMR危险性的)以及在大气污染中所包含的化合物(灰尘，SO2,NOx,CO,重金属，挥发性有机化合物，氟，盐酸等，温室效应气体例如C02、CH4,N2O,CFC、HFC、PFC和SF6,以及其他物质例如臭氧、有机氯化合物(二噁英类和呋喃类)、HAP(多环芳香烃)，等等)。表述“微生物学因子”是指空气、食物和饮用水中存在的因子，尤其是细菌、原生动物、病毒和真菌，并且可以是各种疾病的起因。根据一个优选的实施方案，上文所定义的透明质酸另外还包含化合物B，所述化合物B选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。根据一个优选的实施方案，上文所使用的透明质酸的浓度为0.lg/Ι至4g/l，和优选地0.2至lg/1。低于和高于这个浓度，透明质酸就会变得无活性。根据另一个优选的实施方案，本发明涉及上文所定义的至少一种透明质酸在制备用于治疗和/或预防由源于物理、化学或微生物学因子的攻击而引起的病理学状态的药物中的用途。根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及上文所定义的透明质酸在制备美容和食品组合物中的用途。根据另一个实施方案，上文所定义的透明质酸用于制备用于预防病理学状态例如哮喘、呼吸性变态反应、呼吸窘迫综合征的药物，其中所牵涉的上皮细胞是上和下呼吸道粘膜的细胞。哮喘是支气管的疾病，其在发作时导致在吸入空气，尤其是在将空气从肺中呼出方面的困难。所述发作可以通过各种不同的因素例如体力、湿度或灰尘或者其他变应原例如大气污染物来触发。呼吸性变态反应是由变应原例如螨虫触发的疾病，所述螨虫是造成儿童中的70-80%的变应性哮喘的原因。在室内环境的其他肺变应原(pneumallergSnes)(通过呼吸途径侵入生物体中的变应原)中，家养动物(猫、犬、啮齿动物)、蟑螂、霉菌是呼吸性变态反应的常见来源。在室外环境中，还可以牵涉大气污染物、大气霉菌。职业变应原也可以是造成致敏和呼吸性变态反应的原因(最常见的来源面粉、实验室动物、胶乳等)。呼吸窘迫综合征是由于急性肺损害而引起的危及生命的呼吸窘迫。它由各种不同因素引起，例如误吸了烃类，吸入了刺激性化合物(氯、NO2、烟、臭氧、高浓度的氧、金属烟、芥子气)，除草剂例如百草枯或阿片样物质(例如海洛因、吗啡、右丙氧芬或美沙酮)。下面的实施例1显示了，本发明的透明质酸引起通讯连接的功能性增加，并因此使得能够预防尤其由大气污染物引起的疾病。根据另一个实施方案，上文所定义的透明质酸用于制备用于在皮肤的功能和结构性紊乱的情况下改善皮肤的保护功能的组合物，所述皮肤的功能和结构性紊乱尤其是皱纹、细小皱纹(ridule)、皮肤的张力和弹性的减少、皮肤脱水、其中所涉及的上皮细胞是皮肤细胞的病症。皮肤的功能和结构性紊乱是缓慢的、进行性的、在遗传上经编程的过程和皮肤每天所遭受的袭击(其导致皮肤的衰老)的结果。皱纹是由于表皮和真皮的褶皱而出现在皮肤表面上的线状条纹。细小皱纹是比皱纹更不明显的条纹，并且更特别地是指在眼角处形成的(鱼尾纹)并且比其他在面部上出现的皱纹更浅的皱纹。表述“皮肤的张力”是指松弛、下垂的皮肤。表述“皮肤的弹性”是指松开的皮肤。表述“皮肤脱水”是指不再保留足够水的皮肤，这使得皮肤丧失其结构。根据另一个实施方案，上文所定义的透明质酸用于制备用于在消化性病症的情况下改善肠粘膜的保护功能的组合物，所述消化性病症特别是胃肠炎、缺血性坏死和肠粘膜溃疡，其中所牵涉的上皮细胞是肠粘膜的细胞。所述消化性病症包括可以涉及消化道的所有器官的多重症状。所观察到的消化性障碍源于这些器官的机能障碍。胃肠炎是特征在于大量液状粪便剧烈且频繁地排出的炎症性感染。缺血性坏死是由血管化不足而引起的凝固性坏死，其导致所存在的细胞元件的木乃伊化。肠粘膜溃疡导致肠粘膜由于肠上皮的侵袭而受到破坏。根据另一个实施方案，上文所定义的透明质酸用于制备用于在眼病症的情况下改善眼的保护功能的组合物，所述眼病症特别是水应激(stresshydrique)、眼干燥、角膜损伤和角膜病变，其中所牵涉的上皮细胞是眼的细胞，尤其是角膜的细胞。表述“水应激”是指眼球缺乏水。如果眼泪在某些重要组分例如皮脂中缺乏或者它们的产生不足，那么泪液膜可能降解。那么就会在角膜上形成干点，这引起眼干燥的症状痒、烧灼感、异物感和一般不适。表述“角膜损伤”是指由磨损或摩擦(其通常是由于眼中的创伤或异物)而引起的角膜上皮的表面缺陷。术语“角膜病变”是指具有创伤、化学、感染或遗传起源的涉及角膜的所有疾病。角膜的疾病是非常众多的，并且表现为透明度的丧失，这根据损伤的原因和部位可以导致或多或少完全的和长久的视力丧失。在另一个方面，本发明涉及具有下述通式(I)的化合物组合在制备药物中的用途(Α,B)(I)其中A是如上所定义的透明质酸，B选自维生素，特别是抗坏血酸和维生素E或生育酚，所述药物用于治疗和/或预防由攻击而引起的病理学状态，所述攻击源于物理、化学或微生物学因子，并且在所述攻击中牵涉上皮细胞，特别是上皮细胞的连接复合物。所述维生素包括水溶性维生素例如维生素Bl(硫胺素)、B2(核黄素)、B3(烟酰胺)、B5(泛酸)、B6(吡哆醇)、B8(生物素)、B9(叶酸)、B12(钴胺素)、C(抗坏血酸)、PP(烟酸)，以及脂溶性维生素例如维生素A(视黄醇)、D(麦角钙化醇)、E(生育酚)、K1(叶绿醌)和K2(甲基萘醌)。维生素C以及维生素E在尤其用于皮肤治疗的配方的情况下发挥抗氧化剂的作用。在另外一个方面，本发明涉及药物组合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的浓度包含至少一种分子量为30，000至45，000，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐，以及与之相联合的药学上可接受的载体。根据一个优选的实施方案，上文所定义的药物组合物另外还包含化合物B以及与之相联合的药学上可接受的载体，所述化合物B选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。根据另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含上文所定义的通式(A，B)的化合物以及与之相联合的药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，上文所定义的药物组合物被配制成用于以50mg/天至300mg/天，优选地IOOmg/天至200mg/天的剂量通过局部途径进行施用，或者以0.66mg/kg/天至4mg/kg/天，优选地1.33mg/kg/天至2.66mg/kg/天的剂量通过口服途径进行施用。根据另一个实施方案，上文所定义的药物组合物以肠溶包衣型形式存在。表述“肠溶包衣型形式”是指以肠溶包衣型载体的形式存在的组合物，即保护透明质酸不受胃的酸性的影响。生理学上稳定的肠溶包衣型媒介物选自肠溶包衣型微颗粒剂、包有薄膜的肠溶包衣型微颗粒剂、肠溶包衣型纳米颗粒或纳米球、肠溶包衣型微球、肠溶包衣型微胶囊、肠溶包衣型颗粒剂、包有薄膜的肠溶包衣型颗粒剂、肠溶包衣型脂质体、包有薄膜的肠溶包衣型脂质体、肠溶包衣型冻干片(Iyoc)、包有薄膜的肠溶包衣型冻干片、在肠溶包衣中的渗透泵、树胶剂、肠溶包衣型类球体、肠溶包衣型小球体、包有薄膜的肠溶包衣型类球体、包有薄膜的肠溶包衣型小球体、包有薄膜的肠溶包衣型片剂、包有薄膜的肠溶包衣型明胶胶囊。根据另一个方面，本发明涉及美容组合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的浓度包含分子量为30，000至45，000，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐，以及与之相联合的美容学上可接受的载体。根据一个优选的实施方案，上文所定义的美容组合物另外还包含通式B的化合物以及与之相联合的美容学上可接受的载体，所述通式B的化合物选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。根据另外一个方面，本发明涉及美容组合物，其包含通式(A，B)的化合物以及与之相联合的美容学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，上文所定义的美容组合物被配制为以Img/天至300mg/天，优选地4mg/天至150mg/天的剂量通过局部途径可施用的。美容组合物的实例在下面的实施例3中呈现。在另一个方面，本发明涉及食品组合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的浓度包含分子量为30，000至45，000，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐。根据一个优选的实施方案，上文所定义的食品组合物另外还包含通式B的化合物，所述通式B的化合物选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。在另一个方面，本发明涉及包含上文所定义的通式(A，B)的化合物的食品组合物。在一个优选的实施方案中，上文定义的食品组合物被配制为以50mg/天至300mg/天，优选地IOOmg/天至200mg/天的剂量通过口服途径可施用的。食品组合物的实例在实施例5中呈现。在一个优选的实施方案中，上文所定义的食品组合物以肠溶包衣型形式存在。肠溶包衣型食品组合物可以以肠溶包衣型片剂、明胶胶囊、囊剂或颗粒剂的形式存在。附图描述图1描绘了连接蛋白质ZO-I的免疫定位。在汇合的细胞区域中，根据细胞与或不与透明质酸一起温育，ZO-I的定位并无差别；但当将细胞与透明质酸(A，B)—起温育时，由ZO-I所形成的网状物更密集。相反地，在位于培养物外周且去分化的细胞水平上，观察到与未与透明质酸一起温育的细胞(C)相比较，当将细胞与透明质酸一起温育⑶时，ZO-I的表达更明显且更连续。对于闭合蛋白这种连接蛋白质观察到相同的表达谱。图2描绘了透明质酸的浓度(横坐标轴)对于蛋白质ZO-I和闭合蛋白的膜表达(纵坐标轴)的影响。白色的柱相应于闭合蛋白，而灰色的柱相应于Z0-1。星形符号标明了相对于没有透明质酸的对照而言统计学上显著的差异(P<0.05)。图3描绘了透明质酸(横坐标轴)对于通讯连接的功能性(纵坐标轴)的影响。白色的柱相应于没有透明质酸的对照，而灰色的柱相应于5mg/ml的透明质酸。星形符号标明了相对于对照而言统计学上显著的差异(P<0.05)。图4描绘了透明质酸的浓度和呼吸上皮细胞的培养时间(横坐标轴)对于跨上皮电阻(纵坐标轴)的影响。依照时间和透明质酸的浓度，观察到跨上皮电阻的显著增加(P<0.02)。图5描绘了透明质酸的浓度(横坐标轴)对于皮肤细胞的蛋白质闭合蛋白的表达(纵坐标轴)的影响。所述图相应于过氧化物酶活性的表达强度的测量。所述值是3个点的平均值。图6描绘了透明质酸的浓度(横坐标轴)对于皮肤细胞的蛋白质ZO-I的表达(纵坐标轴)的影响。所述图相应于过氧化物酶活性的表达强度的测量。所述值是3个点的平均值。图7描绘了透明质酸的浓度(横坐标轴)对于肠细胞的蛋白质闭合蛋白的表达(纵坐标轴)的影响。所述图相应于过氧化物酶活性的表达强度的测量。所述值是3个点的平均值。图8描绘了透明质酸的浓度(横坐标轴)对于肠细胞的蛋白质ZO-I的表达的影响。下面的图相应于过氧化物酶活性的表达强度的测量。所述值是3个点的平均值。实验部分实施例1对于呼吸上皮细胞通过使用本发明中所描述的透明质酸而增加了在维持上皮完整性中所牵涉的蛋白质的表达的实例在包含DMEM/F12培养基的限制环(anneauxderestriction)中培养呼吸上皮细胞，所述DMEM/F12培养基补充有抗生素、生长因子，并且具有不同浓度的透明质酸(0.1、1、5或10mg/ml)或者在不存在透明质酸的情况下。当汇合时，撤去限制环，以便允许在培养区域外周处的细胞进行迁移。然后，固定细胞，随后相继地与抗ZO-I或抗闭合蛋白抗体，随之与生物素化的抗体，和最后与偶联至AlexaFluor488的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)一起进行温育。在使得能够防止光漂白的溶液中，将所述制备物放置在载玻片上，并且借助于放大倍数为x40的荧光显微镜进行观察，以便显现蛋白质ZO-I和闭合蛋白的细胞定位。在另一系列实验中，对于细胞培养物进行两次不同的提取总蛋白质的提取和膜蛋白质的提取，以便通过Western印迹技术来评估ZO-I和闭合蛋白的表达。通过测量跨上皮电阻来评估紧密连接的功能性将呼吸上皮细胞在具有双区室(这使得能够测量上皮电阻)的培养皿中进行培养。借助于双电极每24小时进行这种测量，所述双电极使得能够在培养室的顶部培养基和底部培养基之间建立恒定的电压。感应电流的测量使得能够计算出细胞层的电阻。跨上皮电阻的增加表明功能性紧密连接的存在。使用电视显微镜术和FRAP(荧光漂白恢复)技术来评估通讯连接的功能性测量荧光探针经由通讯连接的扩散。(AbaciM等人，BiotechnolJ,2007,250-61；TedelindS,EurJEndocrinol2003,149:215-221)结果透明质酸对于防御蛋白质的表达的影响通过免疫细胞化学来评估的Z0-1和闭合蛋白的表达在汇合的细胞区域中，根据细胞与或不与透明质酸一起温育，Z0-1的定位并无差另Ij。相反地，在位于培养物外周且去分化的细胞水平上，观察到与未与透明质酸一起温育的细胞相比较，当将细胞与透明质酸一起温育时，ZO-I的表达更明显且更连续(图1)。对于闭合蛋白这种连接蛋白质观察到相同的表达谱。通过Western印迹来评估的Z0-1和闭合蛋白的表汰在浓度渐增的透明质酸存在下连接蛋白质ZOl和闭合蛋白在膜水平上的表达率显示在图2中。依照在透明质酸不存在下测量的蛋白质的量，来表示在透明质酸存在下测量的蛋白质的量。所呈现的值相应于4次实验的平均值士标准误差。当将细胞在浓度为1和5mg/ml的透明质酸存在下进行温育时，观察到蛋白质ZOl的表达的显著增加(P<0.05)。当将细胞在浓度为lmg/ml的透明质酸存在下进行温育时，也注意到闭合蛋白的表达的显著增加(P<0.05)。通讯连接的功能件的分析通过测量荧光分子的细胞间扩散，评估了通讯连接的功能性。图3显示了，在透明质酸(5mg/ml)存在下呼吸上皮细胞的温育引起扩散指数的显著增加(ρ<0.05)，这表明通讯连接的功能性的增加。实施例2对于皮肤细胞通过使用本发明中所描述的透明质酸而增加了在维持细胞接近中所牵涉的蛋白质的表达的实例将来自整形外科的外植体的正常人角质形成细胞(正常人表皮角质形成细胞(NormalHumanEpidermalKeratinocyte;NHEK))在补充有生长因子例如EGF(表皮生长因子)(0.25ng/ml)、25yg/ml垂体提取物(Invitrogen37000015)、25μg/ml庆大霉素(SigmaG1397)的SFM培养基(Invitrogen17005075)中于37°C在5%CO2下温育24小时，然后去除培养基并且在本发明的透明质酸分子存在或不存在(对照)下放置所述细胞。所测试的透明质酸浓度为0.lmg/ml、lmg/ml和5mg/ml。在37°C和5%CO2下温育72小时后，去除培养基，然后用磷酸盐缓冲液漂洗细胞，随后立即在-80°C下冷冻。提取由所述细胞表达的总蛋白质，然后与偶联至检测系统的抗ZOl抗体(Cliniscience33-9100)和抗闭合蛋白抗体(Cliniscience33_1500)相接触，所述检测系统涉及与过氧化物酶相缀合的二抗。在过氧化物酶的底物存在下着色的表现提供了关于根据培养基中存在的HA的量标志物ZOl和闭合蛋白表达的信息。在图4和5中，当细胞与本发明的透明质酸一起温育时，观察到连接蛋白质闭合蛋白和ZO-I表达的增加。应当指出，对于闭合蛋白在0.lmg/ml的浓度下和对于蛋白质Z0-1在lmg/ml的浓度下获得了最大表达。当皮肤与低分子量的HA相接触(这使得能够增加细胞之间的粘聚力)时，皮肤(其为最暴露于环境的多重攻击的器官之一)可以能够更好地抵抗各种攻击例如大气污染实施例3包含本发明的分子的用于皮肤的美容组合物由下述配方来描述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4对于肠细胞通过使用本发明中所描述的透明质酸而增加了在维持细胞接近中所牵涉的蛋白质的表达的实例将人结肠细胞(上皮人类高加索人结肠腺癌R51，Caco-2)在补充有非必需氨基酸(Invitrogen11140-035)、2mM谷氨酰胺(Invitrogen25030024)、50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素(Invitrogen15070063)、10%胎牛血清(FCS,Invitrogen10270098)的MEM培养基(Invitrogen21090-022)中于37°C在5%CO2下温育24小时，然后去除培养基并且在本发明的透明质酸分子存在或不存在(对照)下放置所述细胞。所测试的透明质酸浓度为0.lmg/ml、lmg/ml禾口5mg/ml。在37°C和5%CO2下温育72小时后，去除培养基，然后用磷酸盐缓冲液漂洗细胞，随后立即在-80°C下冷冻。提取由所述细胞表达的总蛋白质，然后与偶联至检测系统的抗ZOl抗体(Cliniscience33-9100)和抗闭合蛋白抗体(Cliniscience33_1500)相接触，所述检测系统涉及与过氧化物酶相缀合的二抗。在过氧化物酶的底物存在下着色的表现提供了关于根据培养基中存在的HA的量标志物ZOl和闭合蛋白表达的信息。在图6和7中，看起来连接蛋白质闭合蛋白和ZOl的表达通过本发明的透明质酸的存在而受到调节。在高浓度的透明质酸时闭合蛋白以更大的量进行表达，而关于蛋白质Z01，在0.lmg/ml的浓度下观察到最大表达。通过摄入低分子量的透明质酸而引起的消化道细胞之间的接触例如使得能够增加连接蛋白质的表达，这表明由上皮屏障所执行的防御功能的加强。实施例5包含本发明的分子的用于肠粘膜的食品组合物由下述配方来描述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求至少一种分子量为30,000至45,000道尔顿，优选地40,000道尔顿的透明质酸或其相应的盐在制备组合物中的用途，所述组合物用于在发生攻击的情况下保护和/或恢复上和下呼吸道粘膜、肠粘膜、皮肤或眼的完整性，所述攻击源于物理、化学或微生物学因子，并且在所述攻击中牵涉上皮细胞，特别是上皮细胞的连接复合物。2.根据权利要求1的透明质酸的用途，另外还包括化合物B，所述化合物B选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。3.根据权利要求1或2的透明质酸的用途，以0.lg/Ι至4g/l，优选地0.2至lg/Ι的浓度。4.根据权利要求1-3之一的透明质酸的用途，其特征在于，所述组合物是用于治疗和/或预防由源于物理、化学或微生物学因子的攻击而引起的病理学状态的药物。5.根据权利要求1-3之一的透明质酸的用途，其特征在于，所述组合物是美容组合物或食品组合物。6.根据权利要求1-4之一的透明质酸的用途，所述用途为用于制备用于预防病理学状态例如哮喘、呼吸性变态反应、呼吸窘迫综合征的药物，其中所述上皮细胞是上和下呼吸道粘膜的细胞。7.根据权利要求1-3和5之一的透明质酸的用途，所述用途为用于制备用于在皮肤的功能和结构性紊乱的情况下改善皮肤的保护功能的组合物，所述皮肤的功能和结构性紊乱尤其是皱纹、细小皱纹、皮肤的张力和弹性的减少、皮肤脱水，其中所述上皮细胞是皮肤的细胞。8.根据权利要求1-3和5之一的透明质酸的用途，所述用途为用于制备用于在消化性病症的情况下改善肠粘膜的保护功能的组合物，所述消化性病症特别是胃肠炎、缺血性坏死和肠粘膜溃疡，其中所述上皮细胞是肠粘膜的细胞。9.根据权利要求1-3和5之一的透明质酸的用途，所述用途为用于制备用于在眼病症的情况下改善眼的保护功能的组合物，所述眼病症特别是水应激、眼干燥、角膜损伤和角膜病变，其中所述上皮细胞是眼的细胞，尤其是角膜的细胞。10.药物组合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的浓度包含至少一种分子量为30，000至45，000，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐，以及与之相联合的药学上可接受的载体。11.根据权利要求10的药物组合物，其另外还包含化合物B以及与之相联合的药学上可接受的载体，所述化合物B选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。12.根据权利要求10或11的药物组合物，其被配制成用于以50mg/天至300mg/天，优选地IOOmg/天至200mg/天的剂量通过局部途径进行施用，或者以0.66mg/kg/天至4mg/kg/天，优选地1.33mg/kg/天至2.66mg/kg/天的剂量通过口服途径进行施用。13.根据权利要求10-12之一的药物组合物，其为肠溶包衣型形式。14.美容组合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的浓度包含分子量为30，000至45，000，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐，以及与之相联合的美容学上可接受的载体。15.根据权利要求14的美容组合物，其另外还包含通式B的化合物以及与之相联合的美容学上可接受的载体，所述通式B的化合物选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。16.根据权利要求14或15的美容组合物，其被配制为以Img/天至300mg/天，优选地4mg/天至150mg/天的剂量通过局部途径可施用的。17.食品组合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的浓度包含分子量为30，000至45，000，优选地40，000道尔顿的透明质酸或其相应的盐。18.根据权利要求17的食品组合物，其另外还包含通式B的化合物，所述通式B的化合物选自维生素，特别是抗坏血酸、维生素E或生育酚。19.根据权利要求17或18的食品组合物，其被配制为以50mg/天至300mg/天，优选地IOOmg/天至200mg/天的剂量通过口服途径可施用的。20.根据权利要求17-19之一的食品组合物，其为肠溶包衣型形式。全文摘要本发明涉及透明质酸在制备用于改善皮肤、眼和粘膜，特别是上和下呼吸道以及肠粘膜的保护功能的组合物中的用途。文档编号A61P1/04GK101801391SQ200880106313公开日2010年8月11日申请日期2008年7月4日优先权日2007年7月23日发明者A·布里辛,E·皮谢勒,J-M·赞姆,M·米利奥申请人:农业工业研究发展公司;国家健康医学研究所