结合到生物可降解的纳米粒子的金属络合物及其应用的制作方法

专利名称：结合到生物可降解的纳米粒子的金属络合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗细菌和真菌感染的金属络合物。更特别地，本发明涉及结合 到用于治疗细菌和真菌感染的、生物可降解的物质中的金属络合物。尤其更特别地，本发明 涉及结合到用于治疗细菌和真菌感染的、生物可降解的纳米粒子的金属络合物。
背景技术：
银由于其抗微生物特性而应用良久。该项应用先于对其机制的科学或医学理解。 例如，古希腊人和罗马人使用银质硬币以维持水的纯净性。今天，银仍然由于同样的目的被 NASA用于太空飞船。1800年以前，已经使用硝酸银治疗多种医学病症。今天，仍然广泛应 用硝酸银溶液，在给予婴儿后以预防淋病性眼炎。自从十九世纪的至少后叶，银已以多 种不同形式应用于治疗和预防许多类型的细菌相关性疾患。其它治疗，例如将银箔应用于术后伤口以预防感染，在欧洲作为医疗实践幸存进 入二十世纪八十年代，并且硝酸银仍然用作局部抗微生物剂。在二十世纪六十年代，开发了 非常成功的烧伤治疗银络合物，示于下式1的磺胺嘧啶银。在商业上已知为Silvadene Cream 1 %，该络合物保留一种对于预防二度和三度烧伤的感染最有效的治疗作用。磺胺嘧 啶银已经显示对于多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有良好的抗微生物特性。相信银在 浅表伤口区域中的缓释是愈合过程的原因。对于手术创伤大鼠的研究显示，硝酸银和磺胺 嘧啶银对辅助愈合过程均有效。通过使用这些普通的银抗微生物剂，减少伤口的炎症和肉 芽产生，尽管这些现象的全部机制尚不明白。
0007]最常见的肺部疾患之一是肺炎，其是导致工业化国家中由于感染原因的主要死 因。医院获得性肺炎(HAP)和呼吸机相关性肺炎(VAP)是影响多至25%的所有重症监护 病房病人，且伴有高达70%死亡率的医院感染的主要死因。典型的疗法包括静脉使用广谱 抗生素。然而，多重耐药微生物引起越来越多量的导致治疗失败的医院感染。由于经由吸 入路径沉积于肺可导致比通过静脉给药可达到的要高得多的药物浓度，经由吸入路径传递 现有的抗微生物剂是有吸引力的。引起HAP和VAP的生物体是各种各样的(varied)，但是 包括假单胞菌属(Pseudomonas)耐药菌株和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 耐甲氧西林菌株(MRSA)。这些病原体也为那些见于CF患者的病原体。因此，在HAP和VAP 患者中有效的新抗微生物剂很可能也在CF患者治疗中具有效用。呼吸感染，包括肺炎，最初用全身抗微生物剂治疗，尽管最近已经将抗微生物剂配 制用于经喷雾直接传递至肺。虽然雾化抗微生物剂是公认为用于囊性纤维化患者的治疗形 式，由于有效的全身治疗的可用性，它们并不常规用于治疗急性肺炎。然而，随着多重耐药 微生物的出现，对作为辅助疗法的雾化抗微生物剂的兴趣增加。临床前的动物研究已经证 明，当将雾化抗微生物剂喷入纳米粒子中以实现更高和更持久的浓度时，其功效增强。
吸入是对多种肺病患者的常用的给药技术。除了经由吸入传递的抗哮喘药物，例如β 2-激动药、皮质类固醇和抗胆碱能药外，抗生素为使用该途径传递的第二位最常传递 的治疗剂，特别是用于治疗囊性纤维化。吸入疗法对于治疗肺病的优点是，直接在作用部 位给药，并且作为结果，药物起效的滞后时间短，所需的治疗剂比较少，并且全身性副作用 减少。三种不同类型的装置常用于呼吸道给药喷雾器、具有计量剂量刻度的加压吸入器 (pMDI)和干粉吸入器(DPI)。喷雾器典型地用于使药物溶液和有时是药物悬浮液烟雾化以便于吸入。该类系统 主要用于不允许使用其它系统的患者气道严重阻塞或协调不力的情形。这样一种类型的患 者是不能操控其它装置的婴幼儿。此外，喷雾器用于不能或尚未与其它装置类型，例如PMDI 和DPIs —起配制的药物，例如抗生素、抗真菌剂、酶和粘液溶解剂。尽管其有优点并广泛应 用于传递β 2-激动药和抗胆碱能药物，经由喷雾的吸入疗法的缺点是药物在靶位区域的 低沉积功效。然而，通过设计一种适当的装置并配制，并且通过开发一种透彻理解的喷雾工 作原理，可以非常有效的手段传递宽范围剂量的药物。在许多具有最佳的可吸入组合物的 情形下，可吸入的部分大于约50%是可行的。以此效率，药物的气雾剂传递已经成为普通肺 病的更具吸引力的一线疗法。近年，有越来越多的兴趣在于生物可降解的聚合物领域，因为它们已经用作药物 传递系统。该项研究的主要部分包括生物可降解的纳米粒子聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸) (PLA)和聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)，因为它们已由FDA批准。PGA已自20世纪70 年代被用于生物可降解的缝合材料。近期的研究已经揭示，将商业上可获得的抗癌症药物，例如紫杉醇(Paclitaxel) (IUPAC命名β _ (苯甲酰氨基)-α -羟基-，6，12b-双(乙酰氧基)_12_ (苯甲酰氧基)_2a， 3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a, 12b_ 十二氢-4，11- 二羟基 _4a，8，13，13-四甲基 ~5~ 氧 代-7，11-桥亚甲基-IH-环癸(3，4)苯并(l，2-b)氧杂环丁烷_9_基酯，(2aR- (2a- α , 4- β , 4a- β , 6- β , 9- α ( α -R*, β—S氺)，11_ α，12—α，12a_ α， 2b_ α ))-苯丙酸)，荷载入PLGA纳米粒子用于药物传递。该药物的一个缺点是其疏水性， 导致该药物在体内吸收缓慢。然而，将紫杉醇荷载入PLGA则导致其功效增强。此主要是由 于增加了制备的纳米粒子的亲水性。用于生物医学应用的另一个现有的药物传递系统是具有氨基酸酯侧链的聚氨基 磷腈。该类化合物最终降解为生物学友好的产物，包括磷酸酯和氨。使用至今的两个主要 的聚氨基磷腈为聚(二(乙基甘氨酸基(glycinato))磷腈)(PEGP)和聚(二(乙基丙氨 酸基(alaninato))磷腈)(PEAP)。尽管该项技术的状况如本文所描述的那样，但还是需要更进一步地提供用于治疗 细菌和真菌感染的、结合到生物可降解的纳米粒子的金属络合物。发明简述总的来说，本发明的一个方面是提供用于治疗细菌和真菌感染的化合物，所述化 合物包含结合到聚合物或其它纳米粒子的金属络合物。本发明的另一个方面是提供用于治疗细菌和真菌感染以及其它抗微生物应用的 金属络合物，其中所述金属络合物是银(I)盐、银(I)大环金属络合物、银(I)N-杂环碳烯 或其混合物。
在本发明的又个方面，银(I)大环金属络合物是 其中每个R独立选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸、肽或为不存在，其中 XpX2和X3独立或者为硫或者为氮，且当XpX2或X3为硫时，则R为不存在，其中包含碳、Rm 和Xh的大环配体表示L，其中Y选自N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br和1，或可表示1^， 和其中Y表示L，那么抗衡阴离子选自NO,、OAc-、SCN-、BFp OTf、SO;、Cl\ Br"和Γ。本发明的再一个方面，银(I)N-杂环碳烯是 其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。在本发明的还一个方面，银(I)N-杂环碳烯是 其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。在本发明的另一个方面，银(I)N-杂环碳烯是
8 其中Rh可选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X选自N03、 0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。在本发明的又一个方面，在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法包括以下步 骤给予有效量的、结合到生物可降解的聚合物纳米粒子的银⑴金属盐。在本发明的另一个方面，在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法包括以下步 骤给予有效量的大环银(I)络合物，所述大环络合物包含 其中每个R独立选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸、肽或为不存在，其中 XpX2和X3独立或者为硫或者为氮，且当XpX2或X3为硫时，则R为不存在，其中包含碳、Rh 禾口 Xh的大环配体表示L，其中Y选自N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br和1，或可表示1^， 和其中Y表示L，那么抗衡阴离子选自NO,、0Ac\ SCN-、BFp OTf、SO;、Cl\ Br"和Γ。本发明的一个方面，在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法包括以下步骤给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。在本发明的另一个方面，在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法包括以下步 骤
给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。在本发明的又另一个方面，在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法包括以下步 骤给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中Rh可选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X选自N03、 0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。在本发明的另一个方面，在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法包括以下步 骤给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中礼__4可选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且其中X选自N03、 0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 禾口 I。附图详述

图1为具有显示50%概率为热椭圆体的碘化1-己基-3-甲基-4，5_ 二氯咪唑鐺 盐前体的阳离子部分的代表性结晶结构。
图2是荷载式17银(I)碳烯络合物的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球(L-tyrosine polyphosphate nanospheres)的扫描电子显微镜图像；图3是空白L-酪氨酸多磷酸盐纳米球的扫描电子显微镜图像；图4A为表示来自式17银(I)碳烯络合物荷载的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球的动 态激光光散射的直径分布的图；图4B为表示来自空白L-酪氨酸多磷酸盐纳米 球的动态激光光散射的直径分布的 图；图5为表示在PBS中37°C下孵育7天后的、从约Img的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球 的式17银(I)碳烯络合物累积释放的图；图6A是喷雾后L-酪氨酸多磷酸盐纳米球的使用10倍目镜的光学显微镜概图；图6B是喷雾后L-酪氨酸多磷酸盐纳米球的使用63倍目镜的光学显微镜概图；图6C是喷雾后在磷酸缓冲液中L-酪氨酸多磷酸盐纳米球的使用63倍目镜的光 学显微镜概图(在该溶液中观察不到纳米球)，在图的右下部分可观察到空气/水界面；图7A表示小鼠的治疗方案，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) PAM57-15感染一个小 时后的小鼠接受雾化的空白或荷载式17银(I)碳烯络合物的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球， 再在首次治疗24h后接受治疗，直至第3天(72h)评价；图7B为表示用荷载式17银(I)碳烯络合物的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球治疗的 小鼠与用空白纳米球治疗的小鼠比较的Kaplan-Meier存活曲线的图；图7C为表示用荷载式17银(I)碳烯络合物的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球治疗的 小鼠与用空白纳米球治疗的小鼠比较的体重减轻的图；图8A为表示用荷载式17银(I)碳烯络合物的L-酪氨酸多磷酸盐纳米球和空白 纳米球雾化处理后72h从存活小鼠的肺回收的细菌总数的图；图8B为表示由在72h分析时从指定治疗后的存活小鼠脾脏回收的细菌所指示的 菌血症总数的图，柱条表示平均细菌计数；和图8C为表示对各个用细菌(深色柱条)或不用细菌(浅色柱条)处理组中的脾 脏数量作图的所有小鼠中菌血症总数的图。发明详述本文公开了包括金属络合物的、连接生物可降解的纳米粒子的金属化合物在抗微 生物应用中的用途，包括细菌和真菌感染的治疗。更明确地，本发明包括，但不限于结合到 这些生物可降解的纳米粒子的作为简单盐的银(I)金属络合物、银(I)大环金属络合物和 银(I)N-杂环碳烯(NHCs)，用于抗微生物应用，包括例如，细菌和真菌感染的治疗。经由肺部通路传递治疗剂，例如蛋白质和DNA至肺用于治疗多种遗传和获得性疾 病，例如哮喘、囊性纤维化和肺癌，显示出很大潜力。经由如喷雾的方法的气雾剂吸入提供 容易的和非侵入性路径以达到目标。然而，这些药物不顺从常规传递制剂的方式，是由于与 在喷雾过程中减少治疗剂活性以及体内酶和免疫系统成分的作用相关的问题。在这样的境 况下，装置中的这些药物的包囊，例如纳米球、微米球、脂质体等提供在传递过程中保护治 疗剂并且对抗侵入性环境因子的方式，并且还可增强药物的全身生物利用度。使用这样的 装置还可帮助达到包囊药物的靶向和控制传递。因此，使用控制的药物传递装置，例如与非 侵入性传递方法如喷雾相连的聚合物纳米粒子，由于其具有克服当前与肺传递技术相关的限制的能力而具有潜力。使药用活性剂实现在特定作用位点以最佳治疗速率和剂量方案已 经为开发这样的装置的主要驱动力。通常，纳米粒子大小从IOnm至IOOOnm不等。这些亚微米大小的粒子拥有某些比 微粒独特的优点。纳米粒子，包括纳米球、不同于微米球，可直接用于经由全身循环或穿过 粘膜靶向组织。该靶向作用可能是这些纳米粒子能够被单个细胞吞噬的结果。还观察到， 静脉给予纳米粒子被单核噬菌细胞系统中的细胞，主要被Kuppfer细胞吞噬。这样的纳米 粒子被迅速从血液中清除，并且通常聚集在肝、脾和血液骨髓中。在纳米粒子类型传递系统的情况下，依据装置的构制方法不同，治疗剂被溶解、包 囊、捕获或经化学共轭至纳米粒子基质。可将药物经物理的方法并且均勻地结合并分散在 纳米球基质中。配制在这样的聚合物装置中的药物，例如，通过扩散至聚合物基质、侵蚀聚 合物基质或通过扩散和聚合物侵蚀的合并机制释放。在本发明的一个实施方案中，使用生 物可降解的，包括聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)和聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA) 的聚合物纳米粒子。这种类型的纳米粒子提供本发明的实例中的抗微生物物质的控制释放，并且还具 有靶向特定的器官和组织的能力，以及具有包囊和通过经口给药途径传递物质的能力。常规地，用于制备纳米粒子的方法可从广义上分为两类(1)使预制的聚合物分 散和(2)不管用何种方法使单体聚合；以上各种方法的多种不同变化均可用于优化产品制 剂。被用于制备纳米粒子的第一种方法的变化，例如包括(a)溶剂蒸发方法，(b)自发的乳 化/溶剂分散法和盐析出/乳化-分散法。在这样的方法中，以控制的方式去除有机溶剂从 而使聚合物粒子沉淀。依据物质的相对亲水性和溶解性不同，通过将药物溶解于含聚合物 的有机相或内部水相中，实施药物的包囊。假如聚合物纳米粒子由单体聚合制备，聚合物在 聚合介质中通常具有比单体低的溶解性。此随着聚合物的分子量的增加导致聚合物沉淀。 通过改变参数，实现对粒子大小的控制。例如机械搅拌的速率、所用的表面活性剂和/或稳 定剂的类型和浓度、聚合介质的PH等。可或者在聚合过程中或者在聚合后将原料包囊在纳 米粒子内。可用于本发明的纳米粒子的一组实例包括聚磷腈[PR2N]n。聚磷腈是通用的聚合 物，原因是它们可被用很多种R基团通过简单地置换母体[？以”丸聚合物上的氯化物进行 官能化。聚磷腈的水敏感性通过取代基的选择可从水-稳定性至水-敏感性之间变化。总 的来说，经由P-N键结合至磷腈骨架的大多数R基团是水敏感性的，而那些经由P-O键结合 的为水稳定性的。除了后者外，一般的规则是具有葡萄糖基和乙醇酸和乳酸酯取代基的磷 腈是水-敏感性的，即使这些取代基经由P-O键结合。当斤！？…丸聚合物与水反应，形成NH3、 H3PO4 (或磷酸盐)和R-H。因为NH3和H3PO4和生物学上相容的，RH的特性确定水-可侵蚀 的[PR2N]n聚合物是否是生物学上可相容的。因此，具有葡萄糖基和乙醇酸和乳酸酯取代基 的聚磷腈是生物学上相容的。其它产生水-可侵蚀的磷腈的生物学上相容的取代基包括咪 唑基、甘油基和氨基酸的酯、缩酚酸肽(cbpsip印tides)。由于有各种生物学上相容的R基 团，[PR2N]n的水解需花费数天至数月。可通过合成具有两个或甚至三个不同的取代基的聚 磷腈(通式为[PR2N]X[PRR' N]y[PR' 2N]Z)和改变两个取代基(x、y和ζ)的相对数量，使 水敏感性得到修饰。聚磷腈具有其它潜在的有用的特性。可将它们制备成纳米纤维，并且 依据R取代基的不同，一些具有细胞粘附特性。
一般来说，用于抗微生物应用，例如治疗细菌和真菌感染的化合物，包括结合到生 物可降解的纳米聚合物中的银(I)盐，所述纳米聚合物包括PLA、PGA和PLGA，一般由式1或 式2表不 其中X由N03、OAc、SCN、BF4, OTf或SO4表示，且其中Y由Li、Na或K表示以及X 由Cl、Br或I表示。将被用于螯合至银盐的由式1表示的大环配体表示为但不限于下式3-6 其中每个R可独立变化并且可为氢原子、烷基例如但不限于甲基、醚例如但不限 于甲基乙基醚、醇例如但不限于乙醇、羧酸例如但不限于乙酸、芳基例如但不限于苯、氨基 酸例如但不限于丝氨酸或苏氨酸，或肽例如但不限于黄体生成素(luetinizing hormone) 0 可修饰这些R基团以增加络合物的整体溶解度。将被用于结合至Ag(I)的N-杂环碳烯表示为但不限于式7-8: 其中Rh可独立或不-独立地由卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基或羧酸表 示，其中r3_4可独立或不-独立地由氢原子、烷基例如但不限于甲基、醚例如但不限于甲基 乙基醚、醇例如但不限于乙醇、羧酸例如但不限于乙酸、芳基例如但不限于苯、氨基酸例如 但不限于丝氨酸或苏氨酸，或肽例如但不限于黄体生成素表示，和其中X可由N03、0Ac、SCN、 BF4、0Tf、S04、PF6、BPh4、Cl、Br和I表示。可为了溶解度的目的修饰这些R基团。 其中礼_4可独立变化，并且可为氢原子、烷基例如但不限于甲基、醚例如但不限于 甲基乙基醚、醇例如但不限于乙醇、羧酸例如但不限于乙酸、芳基例如但不限于苯、氨基酸 例如但不限于丝氨酸或苏氨酸，或肽例如但不限于黄体生成素，和其中X可由N03、0Ac、SCN、 BF4、0Tf、S04、PF6、BPh4、Cl、Br和I表示。可为了溶解度的目的修饰这些R基团。在制备纳米粒子的实例中，将相当大量的水与少量的有机溶剂合并，结合到纳米 粒子中的银(I)金属络合物在某些纳米粒子情况下将形成于混合物的有机部分中，而在其 它纳米粒子的情况下将形成于纳米粒子的疏水核心中。因此，选择的银(I)金属络合物可 为疏水性的。出于对此的理解，制备具有疏水取代基的如示于式9-13的银(I)N-杂环碳烯。 如示于式14和15的银(I)N-杂环碳烯银(I)为更多的实例，其中R1-R3表示为相同或不同 的疏水取代基。 在一个实例中，使用L-酪氨酸多磷酸盐(LTP)和50 50聚[DL-丙交酯-乙交 酯共聚物]，PLGA、LACTEL)聚合物，将化合物9的纳米粒子结合到生物可降解的聚合物中。 该合成利用水包油包水乳状液和溶剂蒸发技术。表1给出了配方。使用高速混合器使最初 的乳状液于2000rpm下旋转1分钟。在加入10% PVP后，使最终的乳状液于1600rpm下旋 转2分钟。在持续搅拌5小时时并于控制的条件下蒸发有机溶剂。表1—用于制备纳米粒子的配方 在荷载入纳米粒子之前进行化合物9和13的MIC测试已经发现，与其它水 溶性银金属络合物比较，作为抗微生物剂更有效。测试的细菌种类包括铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa) (ΡΑ0U PAM57-15 和 PAJG3)、洋葱伯克霍尔德菌(B. cepacia) (PC783)、杂 食伯克霍尔德菌(B. multivorans) (HI2229)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(B. cenocepacia) (J2315)、B. dolosa(ATTC BAA-246、AU3994、AU4459、AU4881、AU9248)、结核分枝杆菌 (M. tuberculosis)和发明人的对照菌大肠杆菌(E. coli)株。化合物9的抗该组菌株的 MIC90 为 1 μ g/mL(MIC 范围 1-2 μ g/mL)。类似地，化合物 13 的 MIC90 是 0. 8μ g/mL(MIC 范围0. 8-2 μ g/mL)。化合物9和化合物13抗银敏感性大肠杆菌(E. coli) J53的MIC均是 1 μ g/mL,而那些抗J53的含银耐药性质粒pMGlOl为> 10 μ g/mL。化合物9和化合物13抗 结核分枝杆菌的MIC均是16mg/mL。用于治疗细菌和真菌感染的银(I)络合物的另一个实例，包括结合到生物可降解 的纳米聚合物中的式16的银(I)络合物。 用于治疗细菌和真菌感染的银(I)络合物的再一个实例，包括结合到生物可降解 的纳米聚合物的式17的银(I)络合物。为了使以上络合物在肺中的浓度维持高于最小抑 菌浓度(MIC)水平，应该全天给予治疗。为了避免这种不方便，使用吸入的纳米球可被用于 将具有潜在抗微生物特性的式17银(I)络合物，直接传递至感染部位。该制剂可允许缓慢 释放化合物，由此在慢性感染的肺部造成储库效应。化合物的缓释也可具有减少给药的优 点，此应该导致患者的依从性。在制备式17银(I)络合物中，通过用氢氧化钾(KOH)使4，5-二氯咪唑去质子化， 随后用一当量的于乙腈中的1-溴代己烷烷基化，合成碘化1-己基-3-甲基-4，5-二氯咪 唑鐺盐前体1。然后将过量的碘代甲烷加至混合溶液中，回流过夜。将粗油性产物于二乙基 醚中搅拌导致良好收率的黄色粉末(流程1)。 看来，式17的银(I)络合物的13C NMR光谱的显著的特征在于179. 6ppm的相应于 碳烯碳原子的信号，其出现在Ag(I)的其它NHC络合物的典型范围内，且失去于136.3ppm 的共振。1H NMR光谱显示于约.9ppm处的咪唑鐺质子信号消失，其进一步提示形成所期待 的NHC乙酸银络合物。在本发明的一个实施方案中，式17银(I)络合物可被包囊进入与L-酪氨酸多磷 酸盐(LTP)形成的纳米球。LTP由氨基酸L-酪氨酸通过将该分子与肽键联接并且将磷酸酯 偶合至氨基酸上合成。重复单位的聚合导致分子量为IOkDa的L-酪氨酸多磷酸盐(LTP)， 并且被分类为“假(pseudo)”聚[氨基酸]。LTP可溶解于大多数有机溶剂中，这样允许其 易于配制成纳米球。前期的研究已经显示，LTP的薄膜在7天内会完全降解，是由于在LTP 的聚合物骨架中存在可水解的不稳定的磷酯键接。此降解速率使得LTP成为用于在生物薄 膜持续传递药物而不永久地聚集入肺组织的潜在候选者。此外，LTP的降解产物已经显示 导致局部PH无意义的减低，而不同于其它生物材料如聚[乳酸-乙醇酸共聚物](PLGA)。 LTP的这些可能的降解产物包括与醇一起对身体无毒的L-酪氨酸基衍生物和磷酸根离子。可使用水包油包水乳状液，完成制作包囊式17银(I)络合物的LTP纳米球。外相 可由10%聚乙烯吡咯酮(PVP)和NaNO3组成。利用占纳米球质量约88%的LTP，由于其能在 约7天内经水解降解，这样赋予纳米球持续的传递特征。在纳米球形成过程中，结合聚(乙 二醇)-g_壳聚糖共聚物(PEG-g-CHN)和线性聚乙烯亚胺(polyethyleneimine) (LPEI)帮 助使乳状液稳定，从而防止凝聚。由于PEG-g-CHN和LPEI的两性特性，这些聚合物在水-油 界面富集并通过空间排斥防止LTP小滴的合并。采用乳化技术，包囊低分子量药物，例如式 17的银(I)络合物可为困难的，因为在溶剂蒸发过程中药物可弥散出油相而进入外水相。 之前尝试包囊不含疏水基团的碳烯络合物，导致无法觉察的量的如通过荷载研究探测的发流程1化合物1的1H和13C NMR光谱与其分子结构一致。在1H NMR光谱中，咪唑鐺质子 在9. 46ppm出现。该位移与咪唑鐺盐的一般的C2-H酸性质子位移(δ 8-10ppm) 一致。1的 随后变成碳烯中心的N-C-Nsp2碳的13C NMR位移在136. 3ppm出现。适于X-射线衍射分析 的1的单个的结晶体，通过从浓缩的丙酮溶液蒸发获得。1的阳离子部分的分子结构描绘于 图1中。用约1 2摩尔比率的乙酸银的二氯甲烷液使化合物1原位去质子化，以充足的 得率提供相应的式17银(I)络合物，如在反应方程式1中所见。
明人的药物。因此，通过在外液相加入NaNO3造成的己基侧链的结合和离子荷电梯度被小 心地设计，以基本限制聚合物溶液中的式17银(I)络合物。这些包囊技术产生荷载治疗水平的式17银(I)络合物的纳米球。在本发明的一 个实施方案中，用于荷载式17银(I)络合物的目标为聚合物总重量的约2. 5%，以确 保在使 聚合物的传递最小化时达到最佳剂量。通过经由分光光度法的吸光率对从LTP纳米球萃取 的银的量进行定量已确定荷载。用约10% (w/w)的式17银⑴络合物配制LTP纳米球；然 而，确定实际荷载为约7. 士 1%。包囊效率转变为约71% 士 10%。这样对式17银(I) 络合物的包囊可增强药物在水和生物系统中的稳定性，因为银碳烯络合物对潮湿敏感。用于包囊式17银(I)络合物的方法获得不均勻分布的、平均直径大约1000纳米 的纳米球。将低分子量药物包囊进入纳米球，使得它们快速从组织中的清除减缓。为了处 理生物膜感染，纳米球必须足够小并且按空气动力学原理穿行于10 μ m的呼吸道，且大到 足以沉积进入生物膜基质。已经采用扫描电镜(SEM)确定发明人的纳米球的形状、大小和 形态。通过SEM得到的图像已经显示空白和荷载式17银(I)络合物的LTP纳米球均具有 平滑的表面形态。纳米球的直径范围在约500至约5000nm之间，且所有纳米球制剂的形状 基本为如图2和3所见的球形。采用动态激光光散射系统进一步定量LTP纳米球的大小， 结果如在图4中所见，空白和荷载式17银(I)络合物的LTP纳米球直径范围分别在约471 至约2891nm之间和在约555至约1519nm之间。因此，这些纳米球具有适当的尺寸，以能够 穿行于呼吸道而仍然大到足以沉积进入生物膜基质。为了提供持续的抗微生物药物传递的储库效应，可将纳米球配制成在一周时期内 释放式17银(I)络合物。LTP纳米球已经显示在磷酸缓冲盐水(PBS)体外孵育7天内释放 全部包囊式17的银(I)络合物，如图5所示。已经通过检测从悬浮于缓冲溶液中的纳米球 的释放上清液获得的沉淀银的吸光率，确定式17银(I)络合物从LTP纳米球释放的分布。 7天后从Img的LTP纳米球的累积释放为约74 μ g士 10 μ g，其可比得上约71 μ g士 1 μ g的 荷载资料。大约80%的式17银(I)络合物在最初2天内从LTP纳米球中释放，相对于在 第1天和第2天每Img的纳米球分别释放约60 μ g和约20 μ g。此从纳米球的释放速率是 LTP能够在7天内水解降解的结果。LTP纳米球也已经被测试用于通过喷雾经口服途径给药进入肺。将大约5mg的荷 载式17银(I)络合物的LTP纳米球悬浮于Iml的IOX磷酸缓冲液(没有NaCl)中。然后， 将纳米球放进喷雾室中，雾化，并将蒸汽直接收集进50ml离心管中。通过光学显微镜观察 到收集的浓缩物并用CCD照相机捕捉图像。单独的磷酸缓冲液喷雾没有纳米球，但是LTP 纳米球易于穿过喷雾器，如图6所见。这些结果指出，经口服途径给予LTP纳米球是局部传 递式17银(I)络合物进入肺的可行的方法。将式17银(I)络合物包囊入可降解的纳米球还可提供靶向生物膜中的微生物，例 如细菌的方法。靶向部分，例如对铜绿假单胞菌具特异性的肽可容易地被结合到纳米球制 剂中。已经发现，对铜绿假单胞菌生物膜上的脂多糖(LPS)具特异性的toll-样受体(TLR)， 可被附着至纳米球的表面。在本发明的另一个实施方案中，对LTP纳米球的体内抗微生物作用实施初步评 价。在该评价中，将一定量的气雾化的荷载式17银(I)络合物和空白LTP纳米球，在多 次给药腔室(multi-dosing chamber)中仅经鼻的方式传递至小鼠。在用铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)接种一小时后，小鼠接受一个剂量的荷载式17银(I)络合物 (约36mg)或空白(约34mg)的纳米球，随后在第一个剂量后24小时给予第二个剂量，如图 7A所示。要指出的是，即使在2天时间内重复给药后(在多次给药腔室内，约2mg式17银 (I)络合物/每剂量，每天15分钟暴露)，动物对由喷雾器提供的高浓度静态暴露大体上表 现无显著异常行为(数据未显示)。接种后每天对小鼠称重并观察其存活情况总共72小 时。用荷载式17银⑴络合物的LTP纳米球治疗导致几乎20%的存活优势(式17银⑴ 络合物_治疗组为12/16，而空白组为9/16，如图7B所见)，且与用空白纳米球治疗的存活 动物比较，存活的动物证明较少减重，如图7C所见。特别地，对LTP纳米球的体内抗微生物作用的治疗方案包括下列程序。于感染铜 绿假单胞菌PA M57-15后一小时，使小鼠接受用雾化的空白物或荷载式17银(I)络合物的 LTP纳米球的治疗，并且在首次治疗24h后再次治疗小鼠，直至于第3天(72h)评价小鼠。 B) Kaplan-Meier生存曲线。用荷载式17银(I)络合物的LTP纳米球治疗小鼠的生存，大于 用假(sham)治疗的动物(在16头用式17银⑴络合物_治疗的小鼠中75%存活，而在 16头用空白-治疗的小鼠中56%存活)。C)对于减重，用荷载式17银(I)络合物-LTP纳 米球治疗的小鼠减重，较用空白纳米球治疗的动物减重少。这些结果表现为，与接种重量比 较的平均％重量变化+/-SEM。在各时间点上组间基本上无统计学差异。为了更好地定量纳米球的抗微生物作用，切取各头动物的肺和脾脏用于粗略检查 和定量细菌学。在死亡1小时内切取死亡的动物的器官。于接种72小时后，在将幸存动物 实施安乐死后立即切取其肺和脾脏。自大多数用荷载式17银(I)络合物的LTP纳米球治 疗的小鼠的肺表现大体正常(亮粉红色代表光滑表面)。相反，自大多数接受空白LTP纳米 球小鼠的肺表现发炎红肿(红色或深粉红色代表扩大的体积)。自两组的脾脏均显示无显 著的形态学差异。用荷载式17银(I)络合物的LTP纳米球治疗导致存活动物的肺中的细 菌菌量(burden)显著减少(用式17银(I)络合物治疗的细菌菌为3. 6X 104+/_2. 8X 104， 而用空白对照治疗的细菌菌量为5. 3X 105+/-2. 6X 105、p < 0. 03，由于板的污染，忽略来自 一头动物的数据，如在图8A中所见)。死亡动物肺中的细菌计数显著高于两组中的这些计 数，并且可表示为尸检后的细菌复制(数据未显示)。经用式17银(I)络合物-处理的存 活动物脾脏中的细菌菌量少于假处理的动物(sccio处理的为υχιο^/υχιο1，而空 白治疗的为5.7Χ102+/-3.2Χ102，如在图8Β中所见)，尽管该差异不具统计学显著(ρ = 0.074)。如由细菌扩散至脾脏所证明的，生存可能与菌血症相关。确实，基本上从所有死亡 的动物的脾脏回收细菌(bacteria recovered)。用荷载式17的银(I)络合物的纳米球治 疗的动物具有显著较低的细菌扩散至脾脏的概率(P < 0. 03，如在图8C中所见)，此可解释 为生存优势。这些发现表明，用荷载式17银(I)络合物的LTP纳米球治疗可有效减少在铜 绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)肺炎模型的肺中的细菌菌量，菌血症和死亡的可能 性。术语有效量定义为正确治疗所需的剂量。剂量将根据所使用银(I)金属络合物和 患者的生理学特征，以及身体的细胞、组织、区域的性质和位置或被治疗的其它因素变化。 给予的药物类型也将依据被治疗的细菌和真菌感染的性质和位置变化。治疗的方法可为，但不限于静脉注射、腹膜内注射、吸入、喷雾或经口摄取。如果使 用注射方法，可将药物溶解于适宜的溶剂中。选择的溶剂典型地为生理盐水溶液。该溶液可在0. 5至1. 0%氯化钠的水溶液的范围内，因为在此浓度时，盐水溶液是具有生物学重要 意义，因为其与血浆等渗。另一个适宜的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。其它生物学上可接受 的溶剂也是可接受的。吸入方法将包括将药物喷雾，因为药物将被作为气雾剂吸入。经口 摄取的方法包括摄取作为丸剂、胶囊剂、囊片剂或片剂的药物。作为纳米粒子传递系统的银(I)金属络合物的制剂赋予多种临床优势。首先，如 果需要，制剂促进缓慢释放母体银(I)金属络合物和活性银阳离子，因此提供活性药物的 储库传递。这种缓慢-释放作用允许增加给药间隔和提高患者的依从性。此外，这些粒子 可被肺泡巨噬细胞摄取并传递至全身循环系统。之前的研究已经显示，大小范围在1-5 μ m 的聚集粒子可被巨噬细胞吞噬，其随后从肺表面移行至淋巴系统。由于总体上淋巴系统与 免疫系统密切关联，银(I)金属络合物药物靶向巨噬细胞可提供超过传统的全身传递的益 处。如果以该方式靶向免疫系统，可能减少剂量，得到如更高剂量的口服或全身给药类型的 抗微生物剂相同的临床效果，并且消除潜在的剂量相关性副作用。基于前述公开，现在应该明白的是，金属化合物，包括银金属络合物的应用， 可有 效用于抗微生物应用，而如本文描述的与用于治疗细菌和真菌感染的生物可降解的纳米粒 子结合，将实现上文所提出的目标。因此，应该明白，任何变化显然完全落入本发明要求保 护的范畴之内，并因此，可在不背离本文公开的和描述的本发明精神的前体下，决定具体的 构成要素的选择。
权利要求
一种用于抗菌应用的化合物，所述化合物包含结合到聚合物纳米粒子中的金属络合物。
2.权利要求1的化合物，其中所述金属络合物是银(I)金属络合物。
3.权利要求1的化合物，其中所述聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚 (乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
4.权利要求3的化合物，其中所述聚合物纳米粒子是生物可降解的。
5.权利要求1的化合物，其中所述金属络合物选自银(I)盐、银(I)大环金属络合物、 银(I)N-杂环碳烯及其混合物。
6.权利要求5的化合物，其中所述银⑴盐选自AgNO3、AgOAc、AgSCN、AgBF4、AgOTf 和 Ag2SO40
7.权利要求5的化合物，其中所述金属络合物是具有下式的银(I)盐=Y+AgX2-，其中Y 选自Li+、Na+和K+和X选自Cr、Br"和Γ。
8.权利要求5的化合物，其中所述银(I)大环金属络合物包含其中每个R独立选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸、肽或为不存在，其中Xp X2 和X3独立或者为硫或者为氮，且当Xp X2或X3为硫时，则R为不存在，其中包含碳、R1^3和 X1-S的大环配体表示L，其中Y选自NO3> OAc、SCN、BF4、OTf、SO4, Cl、Br和I，或可表示L，和 其中Y表示L，那么抗衡阴离子选自NO,、0Ac\ SCN、BF;、OTf、SO;、Cl\ Br"和Γ。
9.权利要求5的化合物，其中所述银(I)N-杂环碳烯包含其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸， 并且其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽。
10.权利要求5的化合物，其中所述银(I)N-杂环碳烯包含其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸， 其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽， 并且其中 X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 和 I。
11.权利要求5的化合物，其中所述银(I)N-杂环碳烯包含 其中Rh选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽。
12.权利要求5的化合物，其中所述银(I)N-杂环碳烯包含 其中礼-4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且 其中 X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 和 I。
13.一种在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括以下步骤 给予有效量的、结合到生物可降解的聚合物纳米粒子的银(I)金属盐。
14.权利要求13的方法，其中所述银⑴盐选自AgNO3、AgOAc、AgSCN、AgBF4、AgOTf 和 Ag2SO40
15.权利要求13的方法，其中所述生物可降解的聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚 (乳酸)、聚(乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
16.一种在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括以下步骤 给予有效量的大环银(I)络合物，所述大环络合物包含其中每个R独立选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸、肽或为不存在，其中Xp X2 和X3独立或者为硫或者为氮，且当Xp X2或X3为硫时，则R为不存在，其中所述包含碳、R1^3 和Xh的大环配体表示L，其中Y选自N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br和1，或可表示1^， 和其中Y表示L，那么抗衡阴离子选自NO,、0Ac\ SCN-、BFp OTf、SO;、Cl\ Br"和Γ。
17.权利要求16的方法，其中所述大环络合物被结合到生物可降解的聚合物纳米粒子中。
18.权利要求17的方法，其中所述生物可降解的聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚 (乳酸)、聚(乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
19.一种在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括以下步骤 给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸和其中R3和R4选自质 子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽。
20.权利要求19的方法，其中所述大环络合物被结合到生物可降解的聚合物纳米粒子中。
21.权利要求20的方法，其中所述生物可降解的聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚 (乳酸)、聚(乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
22.—种在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括以下步骤 给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中R1和R2选自卤化物、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸， 其中R3和R4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽， 并且其中 X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 和 I。
23.权利要求22的方法，其中所述大环络合物被结合到生物可降解的聚合物纳米粒子中。
24.权利要求23的方法，其中所述生物可降解的聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚 (乳酸)、聚(乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
25.一种在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括以下步骤 给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含其中Rh选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽。
26.权利要求25的方法，其中所述大环络合物被结合到生物可降解的聚合物纳米粒子中。
27.权利要求26的方法，其中所述生物可降解的聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚 (乳酸)、聚(乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
28.一种在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括以下步骤 给予有效量的N-杂环银(I)络合物，所述N-杂环络合物包含 其中礼-4选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，并且 其中 X 选自 N03、0Ac、SCN、BF4、0Tf、S04、Cl、Br 和 I。
29.权利要求28的方法，其中所述大环络合物被结合到生物可降解的聚合物纳米粒子中。
30.权利要求29的方法，其中所述生物可降解的聚合物纳米粒子选自聚(乙醇酸)、聚 (乳酸)、聚(乳酸_乙醇酸共聚物)和聚合的L-酪氨酸多磷酸盐。
全文摘要
本发明提出用于抗微生物应用和治疗细菌和真菌感染的化合物。所述化合物可包括结合到生物可降解的聚合物纳米粒子中的金属络合物。还提供在哺乳动物中治疗细菌和真菌感染的方法，所述方法包括给予有效量的、结合到生物可降解的聚合物纳米粒子的银(I)金属盐的步骤。
文档编号A61K9/14GK101888845SQ200880109337
公开日2010年11月17日 申请日期2008年7月22日 优先权日2007年7月23日
发明者C·泰西耶, D·A·梅维茨, K·M·欣迪, M·潘茨纳, W·J·扬斯 申请人:阿克伦大学